43
2-6-2. بیولوژی هیدروژن پر اکسید 44
2-6-3. گونه‌های واکنشگر اکسیژن 45
2-6-4. ROS و منابع تولید آن 46
2-6-5. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی 47
2-6-7. ردوکس و تمایز سلول‌های بنیادی 49
2-6-8. ردوکس و تمایز سلول بنیادین جنینی به سلول‌های ماهیچه صاف (SMC) 50
2-7. نیتریک اکسید 51
2-7-1. سنتز نیتریک اکسید 52
2-7-2. عملکرد NOS 53
2-7-3. نقش‌های فیزیولوژیکی NO 53
2-7-4. اثر NO بر رگ‌های خونی 53
2-7-5. نقش NO در سیستم ایمنی 54
2-7-6. نقش NO در التهاب 54
2-7-7. نقش NO در سیستم عصبی 55
2-7-8. NO و مرگ تدریجی سلول 55
2-7-9. نقش iNOS در القای COX-2 55
2-7-10. نقش iNOS در تکثیر 56
2-8. پوست 57
2-8-1. فیبروبلاست 58
2-9. زخم 61
2-9-1. چگونگی ترمیم زخم طی روزهای مختلف 61
2-9-1-1. 24 ساعت اول 61
2-9-1-2. روز سوم 62
2-9-1-3. روز پنجم 62
2-9-1-4. هفته‌ی دوم 62
2-9-1-5. اواخر ماه اول 62
2-9-2. مراحل ترمیم زخم 63
2-9-2-1. مرحله‌ی التهابی 63
2-9-2-1-1. میانجی‌های شیمیایی التهاب 67
2-9-2-1-2. پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها 67
2-9-2-2. مرحله‌ی تکثیر 67
2-9-2-2-1. ری اپیتلیالیزاسیون 68
2-9-2-2-2. فیبروپلازیا 68
2-9-2-2-3. آنژیوژنز 69
2-9-2-3. مرحله‌ی بازسازی 69
2-9-3. اهمیت ماکروفاژها در التیام زخم 69
2-9-3-1. فنوتیپ ماکروفاژ‌های زخم 70
2-9-3-2. اثر ماکروفاژها بر فیبروبلاست‌ها و میو فیبروبلاست‌ها 71
2-9-3-3. ماکروفاژها در مرحله‌ی التهاب 72
2-9-4. زخم و هیدروژن پراکسید 73
2-9-4-1. اثرات مثبت استرس اکسیداتیو در التیام زخم 77
2-9-4-1-1. انعقاد 77
2-9-4-1-2. آغاز و دوام فاز التهابی 78
2-9-4-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون 78
2-9-4-1-4. آنژیوژنز و رسوب ماتریکس 79
2-9-4-2. اثر منفی استرس اکسیداتیو و استرس نیترو اکسیداتیو در ترمیم زخم 80
2-9-5. نیتریک اکسید و زخم 82
2-9-5-1. اثر مثبت نیتریک اکسید در ترمیم زخم 82
2-9-5-1-1. التهاب 83
2-9-5-1-2. آنژیوژنز 83
2-9-5-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون 83
2-9-5-1-4. رسوب ماتریکس و بازسازی 84
2-9-5-2. کاربرد نیتریک اکسید در درمان زخم 85
فصل سوم: مواد و روش‌ها
3-1. مواد و وسایل و دستگاه‌های بکار رفته در آزمایش 89
3-2. طرز تهیه‌ی محلول‌ها و معرف‌های بکار رفته 91
3-2-1. محیط کشت DMEM 91
3-2-2. FBS 91
3-2-3. بافر PBS 91
3-3. کشت سلول‌های فیبروبلاست 91
3-4. آماده‌سازی غلظت‌های مختلف لیپو پلی ساکارید 92
3-5. تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست‌ها 93
3-6. رنگ‌آمیزی XTT 93
3-7. رنگ‌آمیزی تریپان بلو 95
3-8. شمارش سلولی 95
3-9. تعیین درصد زنده ماندن سلول‌ها 95
3-10. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی 96
3-10-1. آماده سازی نمونه‌ها 96
3-10-2. روش کار 96
3-11. تعیین میزان هیدروژن پر اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی 97
3-11-1. آماده‌سازی نمونه‌ها 97
3-11-2. منحنی استاندارد H2O2 98
3-11-3. مخلوط واکنش 98
3-12. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی 98
3-12-1. مواد 99
3-12-2. آماده‌سازی محلول‌ها 99
3-12-3. آماده‌سازی نمونه‌ها 99
3-12-4. روش کار 100
3-13. حیوانات آزمایشگاهی انتخاب شده برای تحقیق 101
3-13-1. روش‌های نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی 101
3-13-1-1. نیاز‌های محیطی موش کوچک آزمایشگاهی 101
3-13-1-2. بستر مناسب 103
3-13-1-3. رعایت اصول بهداشتی در نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی 103
3-13-1-4. تغذیه 104
3-14. اجرای الگوی زخم 105
3-15. تیمار موضعی لیپو پلی ساکارید 107
3-16. آماده‌سازی لیزات بافت 109
3-17. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی بافت لیز شده 110
3-17-1. آماده‌سازی نمونه‌ها 110
3-17-2. روش کار 110
3-18. تعیین میزان هیدروژن پراکسید برای نمونه‌های بافتی لیز شده 111
3-18-1. آماده‌سازی نمونه‌ها 111
3-18-2. منحنی استاندارد H2O2 111
3-18-3. مخلوط واکنش 112
3-19. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 برای نمونه‌های بافتی لیز شده 112
3-20. بررسی هیستوپاتولوژیکی بافت‌های زخم شده 113
3-21. آنالیز آماری 113
فصل چهارم: نتايج
4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 و 48 ساعت) 116
4-2. بررسی اثر LPS بر میزان پرولیفراسیون سلول‌های فیبروبلاست با استفاده از روش XTT 117
4-3. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 118
4-4. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز) 119
4-5. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 121
4-6. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان NO در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز) 122
4-7. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 123
4-8. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان H2O2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست با فاصله‌ی یک روز) 124
4-9. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله) 125
4-10. ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر میزان COX-2 در گروه دوم (بررسی اثر LPS بر فیبرئبلاست با فاصله‌ی یک روز) 126
4-11. اثر LPS بر میزان NO در زخم موش‌ها در روزهای مختلف 127
4-12. اثر LPS بر میزان H2O2 در زخم موش‌ها در روزهای مختلف 128
4-13. اثر LPS بر میزان COX-2 در زخم موش‌ها در روزهای مختلف 129
4-15. نتایج نمونه‌های پاتولوژی 132
فصل پنجم: بحث و پيشنهادات
5-1. اثر LPS سالمونلا انتریکا بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست 138
5-2. بررسی اثر LPS بر زخم ایجاد شده در شرایط invivo 142
5-3. اثر LPS بر میزان NO، H2O2 و COX-2 در شرایط invitro 144
منابع 149
خلاصه انگلیسی 162
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 4-1. نتایج حاصل از بررسی های پاتولوژیک لام های تهیه شده از بافت زخم 135
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 ساعت) 116
نمودار 4-2. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 48 ساعت) 117
نمودار 4-3. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار) 118
نمودار 4-4. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار) 119
نمودار 4-5. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه اول که تیمار بلافاصله LPS داشتند (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار) 120
نمودار 4-6. بررسی میزان حیات سلولی برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها با فاصله‌ی یک روز بعد از کشت سلولی بود (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار) 120
نمودار 4-7. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) 121
نمودار 4-8. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) 122
نمودار 4-9. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) 123
نمودار 4-10. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) 124
نمودار 4-11. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 بلافاصله بعد از کشت سلولی (72 و 48 ساعت بعد از تیمار) 125
نمودار 4-12. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 با فاصله یک روز بعد از کشت سلولی (48 و 24 ساعت بعد از تیمار) 126
نمودار 4-13. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت NO پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم 127
نمودار 4-14. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت H2O2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم 128
نمودار 4-15. بررسی میزان اثر LPS بر فعالیت COX-2 پس از 1، 2، 3 و 7 روز بعد از اجرای الگوی زخم 129
فهرست اشكال
عنوان صفحه
شکل 2-1. ترکیب غشای باکتری‌های گرم منفی غشای سیتوپلاسمی‌یا غشای داخلی، سلول باکتری را احاطه می‌کند. 14
شکل 2-2. ساختار LPS از نوع صاف نشان دهنده‌ی انشعاب اختصاصی O، مرکز داخلی و خارجی، لیپید A می‌باشد 15
شکل 2-3. ساختار LPS از نوع زبر. 16
شکل 2-4. ساختار لیپید A در سالمونلا تیفی موریوم و اشریشیا کلی 19
شکل 2-5. سالمونلا انتریتیدیس 28
شکل 2-6. اجزای متقاطع التهاب 31
شکل 2-7. متابولیسم اسید آراشیدونیک 33
شکل 2-8. مسیر انتقال سیگنال توسط رسپتور‌های شبه تول 34
شکل 2-9. مسیر بیوسنتز پروستانوئید‌ها 36
شکل 2-10. تأثیر COX-2 بر آنژیوژنز 40
شکل 2-11. اثر LPS بر تولید PGE2 41
شکل 2-12. نمایی از مکانیسم اثر LPS بر تحریک تولید COX-2 42
شکل 2-13. منابع تولید کننده ROS 47
شکل 2-14. سیستم اکسیداسیون- احیا و تکثیر سلولی 48
شکل 2-15. نقش ROS در چرخه‌ی سلولی 50
شکل 2-16. مراحل سنتز نیتریک اکسید 52
شکل 2-17. رابطه‌ی بین NO، COX-2 و ROS با LPS 57
شکل 2-18. فیبروبلاست 58
شكل 2-19. نمایی شماتیک از اندامک‌های داخلی فیبروبلاست 60
شکل 2-20. مراحل ترمیم زخم پوستی 63
شکل 2-21. نگاهی کلی به فاز التهابی ترمیم زخم 65
شکل 2-22. روز سوم زخم (فاز التهابی) 66
شکل 2-23. روز پنجم زخم (مرحله‌ی ری اپیتلیالیزاسیون و رگ‌سازی) 66
شکل 2-24. کنترل مستقیم و غیر مستقیم ری اپیتلیزاسیون، آنژیوژنز و فعالیت فیبروبلاست‌ها توسط ماکروفاژها 72
شکل 2-25. اثر سلول‌های مختلف در ترمیم زخم 73
شکل 2-26. مدل فرضی از نقش گونه‌های واکنشگر اکسیژن در مکانیسم سیگنال‌دهی فاکتور رشد اپیدرمی در سلول‌های اپیتلیال 80
شکل 2-27. مدلی فرضی برای تنظیم ساخت کلاژن 84
شکل 3-1. احیای کلرومتریک XTT با آنزیم‌های سلولی 94
شکل 3-2. نگهداری از حیوانات آزمایشگاهی 101
شکل 3-3. نحوه قرارگیری موش‌های آزمایشگاهی در قفس‌های مخصوص 105
شکل 3-4. روز صفر پس از اجرای الگوی زخم 107
شکل 3-5. روزهای مختلف پس از اجرای الگوی زخم 108
شکل 3-6. نحوه گرفتن بیوپسی از محل زخم و تقسیم‌بندی نمونه‌ها به منظور انتقال به آزمایشگاه‌های بیوشیمی و پاتولوژی 109
شکل 4-1. عکس‌های حاصل از نمونه‌های پاتولوژیک 134
خلاصه فارسی
اندوتوکسین‌ها از عمده‌ترین فاکتور‌های ویرولانس باکتری‌های گرم منفی هستند که به دلیل اثرات ایمونولوژیکی، پاتو فیزیولوژیکی و فارماکولوژیکی بر سلول‌های یوکاریوتی، مورد توجه قرار گرفته‌اند. ترمیم زخم ممکن است به دلیل نقص در مولکول‌های میانجی متوقف شود. لیپو پلی ساکارید (LPS) یکی از اصلی‌ترین محرک‌های تولید میانجی‌های التهابی به شمار می‌آید. هدف اصلی این تحقیق، بررسی اثر تجویز موضعی LPS سالمونلا انتریکا بر زخم تجربی ایجاد شده در پوست موش Balb/c و همچنین اثر آن بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست پوست می‌باشد. نمونه‌گیری از بافت‌های پوستی مربوط به گروه‌های شاهد و تیمار طی روزهای 1، 2، 3 و 7 بعد از ایجاد زخم، به منظور بررسی‌های بیوشیمیایی و پاتولوژیکی انجام شد. میزان حیات سلولی با استفاده از روش XTT برای سلول‌های فیبروبلاست صورت گرفت. زخم‌های تیمار شده با LPS (100μg) نسبت به گروه شاهد، افزایش ارتشاح سلول‌های التهابی به محل زخم و افزایشی جزئی در میزان ضخامت لایه‌ی اپیتلیوم نشان دادند. سنجش سیکلو اکسیژناز-2 (COX-2)، هیدروژن پراکسید (H2O2) و نیتریک اکسید (NO) به منظور اثر احتمالی آنها در ترمیم زخم مورد ارزیابی قرار گرفت. در سنجش‌های بیوشیمیایی میزان NO، COX-2، H2O2 افزایش یافت (P˂0.001). بر اساس آزمون ANOVA، در بررسی میزان حیات سلول‌های فیبروبلاست تفاوت معنادار بین گروه‌های شاهد و تیمار مشاهده شد که البته این تفاوت وابسته به دوز مصرفی LPS و مدت زمان انکوباسیون بود. نتایج نشان می‌دهند که LPS با تحریک تولید میانجی‌های التهابی،
