پایان نامه با موضوع لاندا، کمپلمان، ميلي

دانلود پایان نامه ارشد

مورد نياز
محلول های مورد استفاده در الکتروفورز
محلول
مواد تشکیل دهنده
استوک آکریل آمید
شامل 30% آکریل آمید و0/8% بیس آکریل آمید.
بافر ژل پایین با 8/8 pH:
18/2 گرم تریس بازی (0/5 مولار) و 0/4 گرم SDS را در 70 میلی لیتر آب مقطر حل کرده وpH را با استفاده از HCL 2 مولار در 8/8 تنظیم می کنیم و اوره با غلظت نهایی 4 مولار افزوده و حجم نهایی را با آب مقطر به 100 میلی لیتر می رسانیم.
بافر نمونه
0/1 مولار تریس اسیدی حاوی 2%SDS (W/V) ، سوکروز 20% (W/V) ، 2-مرکاپتواتانول 1% ، 0/001 (W/V) برموفنل بلو و اوره با غلظت نهایی 8 مولار (این بافر X2 است.)

3-16-4- تهیه ژل پایین SDS-PAGE
ماده
مقدار
بافر ژل پایین با 8/8 pH: حاوی اوره 4 مولار
5 میلی لیتر
محلول آكريل آميد ٣٠ درصد بعلاوه بيس آكريل آميد8/0 درصد
10 میلی لیتر
آب مقطر
5 میلی لیتر
آمونیوم پر سولفات 10 %
100 میکرولیتر
TEMED 10%
100 میکرولیتر

قبل از اضافه نمودن تمد، محلولها را خوب مخلوط نموده و سپس به مدت ٥ دقيقه با پمپ خلاء عمل گازگيري ٢ را انجام مي دهيم تمد را در هنگام استفاده از محلول، اضافه مي نماييم. از ژل ١٠ درصد براي جدا كردن پروتئين هاي با وزن مولكولي ٢٥ تا ١٠٠ كيلودالتون استفاده مي شود
3-16-5- تهیه ژل بالا با SDS-PAGE
ماده
مقدار
بافر ژل بالا با 8/6 pH: حاوی اوره 4 مولار
5/2میلی لیتر
محلول آكريل آميد ٣٠ درصد بعلاوه بيس آكريل آميد 8/0 درصد
3/1 میلی لیتر
آب مقطر
1/6 میلی لیتر
آمونیوم پر سولفات 10 %
50 میکرولیتر
TEMED 10%
100 میکرولیتر

تهيه اين ژل نيز مثل ژل تحتاني بوده و تا قبل از اضافه نمودن تمد به خوبي مخلوط و گازگيري
مي گردد. همچنين تمد در هنگام مصرف ژل اضافه م يشود.
نمونه های کونژوگه و اگزوتوکسین در چاهک ها ریخته شد و الکتروفورز در 60 میلی ولت برای 5/3 ساعت ( تا 30 دقیقه بعد از خروج برمو فنل بلو از انتهای ژل) ادامه یافت. پس از اتمام الکتروفورز ژل جدا و رنگ آمیزی گردید.
3-16-6-رنگ آميزي ژل پلي آكريل آميد
پس از انجام الكتروفورز به منظور ديدن باندهاي پروتئيني، ژل را رنگ آميزي نموديم . براي رنگ آميزي ژل از روش رنگ آميزي كوما سي بلو استفاده گرديد . در اين روش ثبات رنگ طولاني مدت بوده و نگهداري ژل رنگ شده آسانتر است.
3-16-7- محلولهاي مورد نياز
١- محلول رنگ
2/0 گرم كوماسي بلوR250 (سیگما) در 40 ميلي ليتر متانول (مرك) حل گرديد؛ سپس 10 ميلي ليتر اسيداستيك گلايسيال(مرك) و 50 ميلي ليتر آب مقطر افزوده شد . پس از مخلوط كردن در ظرف شيشه اي در ٤ درجه سانتي گراد نگهداري مي گردد.
٢ – محلول رنگ بر
به ٤٠٠ ميلي ليتر متانول، ١٠٠ ميلي ليتر اسيد استيك گلايسيال و ٥٠٠ ميلي ليتر آب مقطر اضافه گرديد. پس از مخلوط كردن در شيشه در دار نگه داري مي شود.
٣- محلول نگهداري ژل
70 میلی لیترميلي ليتر اسيد استيك گلايسيال با ١٠ ميلي ليتر متانول مخلوط گرديد و سپس حجم آن با آب مقطر به ١٠٠ ميلي ليتر رسيد.
3-16-8- روش رنگ آميزي
١- ژل در داخل ظرف رنگ قرار گرفت؛ سپس مقداري رنگ به آن اضافه گرديد و مدت ١٠ تا ١٥ دقيقه روي شيكر قرار داده شد.
٢- رنگ را خارج نموده و سپس با آب مقطر ژل را شستشو داديم.
٣- ژل در داخل محلول رنگ بر، روي شيكر قرار گرفت و با شفاف شدن زمينه ژل باندهاي
پروتئيني نمايان شدند.
٤- در مرحله آخر ژل در محلول نگهدارنده قرار داده شد.
3-17- آزمون بررسی فعالیت باکتریسیدالی سرم حیوان ایمیون (SBA104)
3-17-1- اصول آزمون SBA
واکسن های موفق بر علیه پاتوژنهای خارج سلولی سبب القاء زیر کلاس های متعدد IgG در مقابل اپی توپهای سطحی و قابل دسترس باکتری می شوند. اما در مورد باکتریهای داخل سلولی همه زیر کلاس های IgG خاصیت حفاظتی در برابر عفونت ناشی از این باکتریها را نداشته و توانایی کشندگی وابسته به کمپلمان را ندارند. به همین دلیل تست ارزیابی فعالیت باکتریسیدالی سرم در این گروه از اهمیت زیادی برخوردار است. مکانیسم تست بر مبنای اثرات کشندگی آنتی بادی القایی در خلال سیر طبیعی عفونت یا بعد از انجام واکسیناسیون پایه ریزی شده است. این آزمون به بررسی خاصیت کشندگی آنتی بادیهای ایجاد شده با واسطه فاکتورهای کمپلمان در شرایط خارج بدن 1 می پردازد.آنتی بادیهای باکتریسیدالی با فعال کردن مسیر آبشاری کمپلمان، سبب ایجاد کمپلکس تهاجم غشایی شده و در نهایت باعث لیز باکتری می شوند.
3-17-2- مواد مورد نیاز برای آزمون SBA Serum Bactericidal Assay)) :
1- با استفاده از لوله مک فارلند از کشت 18 ساعته همو فیلوس آنفولانزای تیپ b سوسپانسیون باکتریایی حاوی CFU/ml103تهیه می گردد.
2- سرم حیوان ایمن شده
سرم های به دست آمده از مراحل مختلف تزریق را در C°56 به مدت نیم ساعت در بن ماری غیر فعال می نماییم.
3- منبع کمپلمان خارجی
برای منبع کمپلمان خارجی در آزمون از سرم خون نوزاد خرگوش 3 هفته ای استفاده می نماییم. به همین دلیل در شرایط کاملا استریل از قلب نوزاد خرگوش خون گیری انجام شد و سرم خون حیوان بعد از جدا سازی در C°20- تا زمان انجام آزمون نگهداری گردید.
4- میکروپلیت
در این آزمون از میکروپلیت های استریل 96 خانه ای با انتهای U شکل استفاده گردید.
3-17-3-روش انجام آزمون
ابتدا از سويه هموفیلوس آنفولانزای تیپ b در يك لوله كشت داده و 24 ساعت در دماي ٣٧ درجه سانتيگراد انكوبه مي كنيم. پس از اين مدت، لوله را با سرم فيزيولوژي شستشو داده و مايع غليظ را به رقت لوله ٣ مك فارلند مي رسانيم. محلول DPBS، سرم بچه خرگوش غیر فعال شده ، 50 میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی حاوی CFU/ml103 و در چاهك اول از ميكروپليت ٩٦ خانه λ ١٠٠ سرم غليظ تزريق نوبت اول را ريخته و آن را در خانه هاي بعدي از رقت 1/2 تا رقت 1/128 مي رسانيم. در رديف بعدي و در خانه اول سرم غليظ نوبت دوم را ريخته و در خانه هاي بعدي تا رقت 1/128 مي رسانيم.كنترل هاي زير را نيز در نظر مي گيريم :
1- کنترل مثبت : 50 لاندا سرم غیرفعال منفی (روز صفر)، 50 لاندا بافر DPBS+ 50 لاندا سوسپانسیون باکتری + 50 لاندا سرم بچه خرگوش
2- کنترل باکتریایی : 100 لاندا تامپون DPBS +50 لاندا سرم بچه خرگوش + 50 لاندا سوسپانسیون باکتریائی Cfu/ml103
3- کنترل سلولی: 50 میکرولیتر منبع کمپلمان خارجی غیر فعال + 50 میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی Cfu/ml103، 50 میکرولیتر تامپون DPBS
4- کنترل کمپلمان فعال : 50 لاندا سرم نوزاد خرگوش (فعال) + 100 لاندا تامپون DPBS+ 50 لاندا سوسپانسیون باکتریائی
5- کنترل کمپلمان غیرفعال:
50 لاندا سرم نوزاد خرگوش غیرفعال +100 لاندا تامپون DPBS +50 لاندا سوسپانسیون باکتریائی

1

سرم رقیق شده

+

+

+

+

+

+

+

+
سوسپانسیون باکتریایی (50 میکرو لیتر)
+
+
+
+
+
+
+
+
منبع کمپلمان خارجی(سرم نوزاد خرگوش) (50 میکرولیتر)
روش انجام سرم باکتریسیدال اسی در میکروپلیت

کنترل تهیه شده در آزمون SBA
کنترل
باکتری

کنترل
کمپلمان

کنترل
سلولی

کنترل
مثبت

کنترل
منفی

کنترل مواد

_

_

_

_

+
سرم حیوان قبل از تزریقات (سرم منفی) (50 میکرولیتر)
_
_
_
+
_
سرم کنترل مثبت (50 میکرولیتر)
_
+
+
_
_
D-PBS (50 میکرولیتر)
+
+
+
+
+
سوسپانسیون باکتریایی CFU/ml104
(50 میکرولیتر)
_
_
+
+
+
منبع کمپلمان خارجی غیر فعال (سرم نوزاد خرگوش) (50 میکرولیتر)
_
+
_
_
_

منبع کمپلمان خارجی(سرم نوزاد خرگوش) (50 میکرولیتر)

فصل چهارم

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه با موضوع فیزیولوژی Next Entries منابع پایان نامه ارشد با موضوع الکلی...................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................73، تهيه، ميكروارگانيسم