پایان نامه با موضوع فیزیولوژی

دانلود پایان نامه ارشد

بود و بر روی مایع حاصل از محیط تریپتیکاز سوی براث معادل 156 میلی لیتر بود اضافه شد. بعد از ايجاد رسوب با سولفات آمونيوم، سوسپانسيون با دور3700rpm به مدت30 دقيقه سانتريفيوژ شد .مایع رویی دور ریخته و سپس رسوب را جمع آوری کردیم.

شکل 3-7- رسوب با سولفات آمونيوم
3-6-9- دياليز اگزوتوكسين A
بدنبال رسوب گیری توسط سولفات آمونیوم آن را درون كيسه دياليز كه از قبل تيمار شده بود ريخته و در سردخانه قرار داده شد و به روی رسوب حاصل از محیط به غلظت 10 میلی مولار تریس بافر ریختیم و رسوب را به طور کامل حل کردیم و در کیسه دیالیز ریخته و به مدت 24 ساعت بر علیه تریس بافر سه بار تعویض انجام گرفت.سپس سوسپانسيون موجود در كيسه دياليز از فيلتر سرنگي 22/0 ميكرون جهت استريل كردن عبور داده شد. سپس اگزوتوکسین تولید شده از هر کدام از محیط ها را از ستون کروماتوگرافی رد میکنیم و جذب نوری هر کدام از فراکشن ها را گرفته و به روش لوری پروتئین سنجی .

شکل 3-8- دياليز
3-6-10- کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل اگزوتوكسين A
مراحل پك كردن ستون كروماتوگرافي:
3-16-2-1مواد مورد نیاز:
ژل سفاروزCL-4B (فارماسیا)
تامپون Nacl 2/0 مولار همراه با سدیم آزاید 3 میلی مولار
تامپون Nacl 2/0 مولار
لوازم آزمایشگاهی مورد نیاز:
1-ستون شیشهای با طول 1 متر و قطر 5/1 سانتی متر
2-فرکشن کلتور اتوماتیک ، پمپ پاراستاتیک و لولههای آزمایش جهت جمع آوری فراکشنها
به 200 ميلي ليتر سفارزCL-4B (فارماسيا) مقدار 400 ميلي ليتر كلريد سديم 2/0مولار محتوي 3 ميلي مولار سديم آزايد اضافه نموده و به آرامي تكان داديم بعد از يك ساعت فاز مايع را همراه با ذرات بسيار كوچك سفارز خارج نموده و شستشو را آنقدر تكرار می‏كنيم تا سفارز يكنواخت به دست آيد. به سفارز شسته شده 200 ميلي ليتر كلريد سديم 2/0 مولار همراه با سديم آزايد اضافه نموده و به كمك خلأ حباب‏های هوا را از سيستم خارج كرديم.
سفارز شسته شده را به آرامي داخل ستون ريخته و به كمك پمپ پاراستاتيك در فلوريت 18 ميلي ليتر در ساعت به طريقي پك كرديم كه ارتفاع ژل به 90 سانتي متر برسد. جهت استاندارد نمودن، ستون را 3 مرتبه با حجمي برابر حجم ستون توسط كلريد سديم 2/0 مولار شستشو داديم .سپس مقدار 2 سی سی از اگزوتوکسین بدست آمده از محیط تریپتیکاز سوی براث را از ستون رد کردیم و تمام فراکشنهای بدست آمده توسط کلکتور جمعآوری شد.
3-6-11سنجش توليد اگزوتوكسين A
3-6-11-1-سنجش توکسیسیتی
از هر 3 فراکشن به دست آمده از ستون کروماتوگرافی در سرم فیزیولوژی رقت های 0 تا یک بیستم تهیه می نماییم.1/0 میلی لیتر از هر رقت را به3 گروه 5 تایی موش های سفید آزمایشگاهی به صورت داخل صفاقی تزريق نمودیم . موش ها بعد از تزریق دارای علایمی همچون ترشحات چشمی، قوز کرده، مو‏های ژوليده، كوچكي چشم و در حال بسته شدن و عدم تعادل در حركات نشان دادند و همه آنها در عرض 48 ساعت از بین رفتند که نشانه ی بارزی جهت اثبات توکسیک بودن اگزوتوکسین ما می باشد. در کالبد شکافی مه بعد از مرگ انجام گرفت آثار توکسیک بر روی کلیه ها، سفیدی و تورم کبد و خونریزی زیه مشاهده شد . تا 48
3-6-12- دتوكسيفاي كردن اگزوتوكسين A به روش فرمآلدیئد :
فراکشن 2 که با انجام آزمایش توکسیسیتی به عنوان اگزوتوکسین اصلی شناخته شد، جهت دتوکسیفای کردن و کونژوگه مورد استفاده قرار گرفت. به این فراکشن به میزان 5/0% فرمالدهید 37% اضافه گردید و به مدت یک شبانه روز در C°4+ نگهداری گردید و به مدت ا روز دیالیز گردید. در مرحله بعدی همین اگزوتوکسین دتوکسی فای شده را از فیلتر سرنگی 22/0 میکرونی رد کردیم و لیوفلیزه شدند.
کونژوگاسیون PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا:
برای کونژوگاسیون PRP با اگزو توکسین A ، 50 میلی گرم در 5 میلی لیتر آب مقطر در دمای اتاق حل و با استفاده از سود 1 نرمال حا محلول در 5/10 تنظیم گردید.150 میکرولیتر از محلول سیانوژن بروماید با غلظت 2/0گرم در میلی لیتر در استو نیتریل را اضافه کرده و مجدادا PH محلول را در5/10 تنظیم می کنیم. بعد از 5 دقیقه 5 میلی لیتر محلول5/0 مولار آدیپیک اسید دی هیدرازید همراه با بیکربنات سدیم با غلظت 0.5 مولار را افزوده و مجددا PH محلول را در 8.5 تنظیم می کنیم. این محلول برای یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده می شود. سپس به نمونه ی کونژوگه آدیپیک اسید با PRP به صورت جداگانه 50 میلی گرم اگزوتوکسین دتوکسیفای شده خالص لیوفلیزه اضافه کرده و مخلوط واکنش روی یخ سرد می شود. PH محلول را در 5/8 با استفاده از HCL 1/0نرمال تنظیم می کنیم.سپس محلول حاوی EDAC با غلظت 1/0 نرمال به نمونه اظافه و برای 4 ساعت بر روی یخ هم زده شده و سپس برای یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار داده شد.پس از این مدت زمان، محلول در برابر محلول 2/0 مولار کلرید سدیم برای 2 روز دیالیز شد.
3-7- ژل فيلتراسيون جهت تخليص كونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا
جهت خالص سازي مولكول‏های كونژوگه از مولكول‏های غير كونژوگه، نمونه كونژوگه تهيه شده PRP- ETA با حجم4 ميلي ليتر از ستون ژل فيلتراسيون حاوي سفارز 4B-CL با حجم كاري CM90×CM5/1 كه با محلول كلريد سديم 2/0مولار به تعادل رسيده عبور داده شد. جريان بافر با سرعت 40 ميلي ليتر در ساعت برقرار شد و تا عبور معادل يك حجم بسته‏ي، مايع از ستون ادامه يافت. فراكشن‏های جمع آوري شده در طول موج 280 و210 نانومتر قرائت شدند و لوله‏هایی كه بيشترين جذب را داشتند به عنوان فراكشن‏های حاوي مولكول كونژوگه جمع آوري و با هم ادغام شدند. سپس كونژوگه‏های تهيه شده با كمك اولتراسانتريكان، تغليظ و از فيلتر 22/0 ميكرون ميلي پور عبور داده شد و در ويال‏های استريل تقسيم ودر 20- درجه نگهداري گرديد.
3-8- آزمون های کنترل و کیفی کونژوگه
3-9- سنجش پروتئین :
میزان پروتئین کونژوگه PRP-ETA به روش LOWRY (1951) انجام شد.
3-11- تعیین میزان اسید نوکلئیک :
اسید نوکلئیک موجود یک گرم پروتئین لیوفیلیزه شده به روش مطابق بند 3-5 اندازه گیری شد.
3-12- كنترل توكسيسيته غیرعادی((Abnormal toxicity
یک گروه 5 تایی موش سفيد آزمایشگاهی هر کدام با 50 میکروگرم از کونژوگه به صورت داخل صفاقی تزریق نمودیم. قبل و بعد از تزریق وزن 22-17 گرم به صورت داخل صفاقي تزريق گرديد و موش‏‏ها هر روز به مدت 2 هفته از لحاظ كاهش وزن، عوارض به مدت یک هفته موش ها وزن گردیدند و همگی موش ها از لحاظ کاهش وزن، مرگ و میر و علائم ناخواسته در محل تزریق مورد کنترل قرار گرفتند.
3-13- آزمون پیروژنی
برای انجام آزمون پیروژنی سه خرگوش سفید نیوزلندی با وزنkg 5/1-2 استفاده گردید. به میزان دو برابر دوز تزریقی یعنی مقدار 100 میکروگرم كونژوگه PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb (Hib) با اگزو توکسین A سودوموناس آئروژینوزا را در ml1 سرم فیزیولوژی آپیروژناز از طریق رگ مارژینال به گوش خرگوش تزریق گردید. قبل از تزریق و به مدت 5 ساعت، هر یک ساعت حرارت رکتال خرگوش ها اندازه گیری شد که اگر افزایش حرارت بدن هر خرگوش کمتر از 6/0 و مجموع حرارت بدن هر سه خرگوش کمتر از 4/1 باش، کونژوگه غیر تب زا گزارش می شود.
3-14- ایمیونیزاسیون خرگوشها و خونگیری
برای ارزیابی ایمونولوژیکی در این تحقیق از خرگوش سفید نیوزلندی با وزن 5/1 الی 2 کیلوگرم استفاده گردید. به 2 گروه 2 تایی خرگوش به ترتیب، به گروه اول 5/0 میلی لیتر حاوی 50 میکرو گرم پلی ساکارید PRP هموفیلوس آنفولانزای تیپb به صورت داخل عضله به هر خرگوش تزریق گردید و به گروه دوم 5/0 میلی لیتر حاوی50 میکرو گرم از کونژوگه به صورت داخل عضله به هر خرگوش تزریق گردید. به همین ترتیب تزریق مجدد در روز پانزدهم انجام گرفت.قبل از تزریق اول و در روزهای 15، 30، 45 خونگیری از قلب خرگوش ها انجام شد و سرم آن ها به وسیله سانتریفیوژ جدا گردید و سرم هر گروه خرگوش در هر مرحله با هم مخلوط و با اضافه نمودن 1 به 10000 مرتیولات نگهداری گردید.
3-15تهیه بافر باربیتال :
الف) محلول A : 12 گرم باربیتات سدیم را در 800 میلی لیتر آب مقطر حل می نماییم.
ب) محلول B : 4/4 گرم باربیتوریک اسید را در 150 میلی لیتر آب مقطر در 95 درجه سانتی گراد حل می نماییم.
ج) محلول C : محلول A و B را با هم مخلوط کرده و pH آن را با سود 5 مولار در 2/8 تنظیم نمودیم. سپس 15/0 گرم مرتیولات به آن افزوده و حجم نهایی را با آب مقطر به یک لیتر رساندیم. محلول فوق را با کاغذ صافی فیلتر می نماییم.
3-16- تهیه محلول کوماسی بلو و رنگ بر :
الف) محلول رنگ بر : به 400 میلی لیتر متانول 70 میلی لیتر اسید استیک گلایسال و 530 میلی لیتر آب مقطر اضافه نموده و سپس فیلتر می نماییم.
ب) تهیه محلول کوماسی بلو : 25/1 گرم رنگ کوماسی برلیانت آبی R-250 سیگما را در : 500 میلی لیتر محلول رنگ بر حل نموده و پس از فیلتراسیون در بطری رنگی نگهداری می نماییم.
روش انجام آزمایش
1 گرم آگاروز را در 100 میلی لیتر بافر باربیتال (6/8 =pH ) حل نموده و 01/0 درصد سدیم آزاید اضافه گردید. سپس آن را با حرارت ذوب نمودیم. بعد از سرد شدن ژل و رسیدن به دمای 45 درجه سانتی گراد، در پلیت ریخته شد، به طوری که ارتفاع آن 3 میلی لیتر برسد و پس از سرد شدن و بستن ژل با استفاده از دستگاه ایجاد کننده گوده 103 ، حفره هایی در ژل ایجاد نمودیم.
به منظور جلوگیری از پخش شدن آنتی ژن یا آنتی بادی در سطح بین شیشه و ژل ، محلولی از آگاروز 5/0 درصد در کف حفره ها می ریزیم. حفره ها به قطر 4 میلی متر و با فاصله 1 سانتی متر از یکدیگر( یک حفره در مرکز و 4 حفره در اطراف ) تعبیه شده اند. پس از شماره گذاری حفره ها بر اساس الگوی طراحی شده، کونژوگه در حفره مرکزی و سرم حیواناتی که توسط پلی ساکارید تنها و کونژوگه ایمنی زایی شده بود و نیز پلی ساکارید مننژیتAبه عنوان کنترل منفی و آنتی سرم مننژیت در حفره های اطراف ریخته شدهو پلیت 1تا 3 روز در اتاقک مرطوب در دمای آزمایشگاه قرار گرفتند تا خط رسوبی تشکیل گردد. با مشاهده خط رسوبی ژل ها به مدت 24 ساعت در محلول PBS10 میلی مولار (2/7 =pH) قرار گرفته و در طی این مدت، بافر چندین بار تعویض می گردد. سپس با قرار دادن ژلها در آب مقطر به مدت 2 ساعت نمکهای اضافی را خارج می نماییم. ژل به مدت 15-10 دقیقه در رنگ کوماسی بلو قرار گرفته تا خطوط رسوبی ظاهر شوند و سپس آن را در ظرف محتوی محلول رنگ بر حاوی 10 درصد گلیسیرین قرار داده تا زمینه کاملا بی رنگ شود.
در نهایت ژل را با کاغذ صافی مرطوب پوشانده و در حرارت اتاق خشک می نماییم.
3-16- پلي آكريل آميد ژل الكتروفورز درحضور سديم دو دسيل سولفات(SDS-PAGE)
3-16-1- اصول روش SDS-PAGE
ژل پلي آكريل آميد از پلي مريزاسيون منومرآكريل آميد و واكنش متقاطع اين زنجيره پل ي مري با بيس آكريل آميد تشكيل مي شود اندازه خلل و فرج تابع غلظت آكريل آميد است؛ يعني اگر غلظت آكريل آميد افزايش يابد، اندازه خلل و فرج ژل كاهش مي يابد و بالعكس. به طوري كه به آساني درجه غربال مولكولي را با تغيير غلظت آكريل آميد و بيس آكريل آميد مي توان تغيير داد.
پروتئين ها در حضور يك دترجنت يوني مثل سديم دو دسيل سولفات (SDS) دناتوره مي شوند ومركاپتواتانول پيوندهاي دي سولفيد آنها را مي شكندSDS . به اسيد آمينه هاي آبگريز در ساختمان پروتئين اتصال برقرار مي كند(به نسبت4/1 گرم SDSدر هر گرم پروتئين(به طوري كه پوششي از بار منفي بر سطح مولكول پروتئين ايجاد مي گردد و به اين ترتيب تمام پروتئين ها نسبت ثابتي از بار را خواهند داشت و پروتئين ها براساس شكل و اندازه از يكديگر جدا مي شوند. از اين رو اگر تفاوتي در حركت آنها وجود داشته باشد، نشان دهنده اختلاف در اندازه مولكولي است و اندازه مولكول نيز رابطه مستقيم با وزن آن دارد. لذا بدين وسيله وزن مولكولي پروتئين مجهول در مقايسه با پروتئين هاي استاندارد قابل اندازه گيري خواهد بود.
3-16-3- محلولهاي

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه با موضوع شاپوری،1386)، PH، کوالان Next Entries پایان نامه با موضوع لاندا، کمپلمان، ميلي