پایان نامه با موضوع شاپوری،1386)، PH، کوالان

دانلود پایان نامه ارشد

یافت. ( WHO,2006)
2-4- پاسخ های واکسن پلی‌ساکاریدی
بسیاری از دانسته های ما دربارةی ایمنی‌شناسی پاسخ ها به PRP از مطالعات محوریPorter Anderson و David Smith و نیز آزمایشات واکسن PRP که در سال 1970 در فنلاند صورت گرفت به دست‌آمده است. این مطالعات نشان دادند که ایمنی زایی PRP در کودکان جوان که ایمنی سلول B انها در آن سن به خوبی توسعه نیافته است و در نتیجه فاقد محافظت هستند ضعیف است. همراه با این واقعیت که دوز‌های تکراری واکسن PRP در ایجاد پاسخ ناکام ماند.
در بچه‌های بالای 18 ماه، بالغ‌شدن سیستم ایمنی با به ‌دست‌آوردن پاسخ دهی (responsiveness) و همزمان با اینکه چگالی‌ها ( titers) در بچه ها به طور طبیعی همزمان بارشد ایجاد شده برای آنتی‌ویژن های دیگر واکنش می‌دهند را ظاهر سازی می‌کند، وقوع بیماری کاهش می‌یابد .( WHO,2006)
2-5- عوامل دخیل در ایمونوژنسیتی واکسن های کونژوگه پلی ساکاریدی – پروتئینی
2-5-1- طول زنجیره پلی ساکاریدی:
تحقیقات گسترده نشان داده است که مولکول پلی ساکاریدی که برای کونژوگه استفاده می شود اگر خیلی کوتاه یا خیلی بلند انتخاب شود معمولا غیر ایمونوژن شده قادر به تحریک سیستم ایمنی نخواهند بود.بنابراین انتخاب طول زنجیره مولکول پلی ساکارید برای کونژوگاسیون بسیار مهم بوده و باید با وسواس انتخاب گردد.( شاپوری،1386)
2-5-2- نوع اتصال:
برای تبدیل پلی ساکارید ها به آنتی ژن نوع TD باید اتصال هاپتن به مولکول حامل از نوع کوالان باشد. سایر پیوندهای محکم و یا غیر کوالان در این راستا موثر نمی باشند.چندین روش برای اتصال پلی ساکارید به پروتئین وجود دارد اما سه روش احیای امیناسیون، آمیداسیون و اتریفیکاسیون معمولا بهترین این روش ها محسوب می شوند.کونژوگاسیون با یکی از روش های نام برده سبب پایداری بالا وحفظ ساختارهای آنتی ژنیکی مولکول ها می شود.برای این منظور باید پارامترهایی هم چون ، دما ، مدت زمان PH واکنش و محلول های شیمیایی بر اساس نوع مولکول های هاپتن و حامل دقیقا تنظیم شوند.( شاپوری،1386)
2-5-3- مولکول های حامل:
پروتئین های متنوعی از جمله پروتئین پیلی، پروتئین های غشای خارجی و توکسوئیدهای باکتری ها برای تهیه واکسن های کونژوگه برای آنتی ژن های کربوهیدراتی استفاده شده است.توکسوئید کزاز و دیفتری بیش ترین مولکول های حاملی هستند که تا به امروز استفاده شده اند و کونژوگه های آن ها اجازه مصرف انسانی را گرفته اند.( شاپوری،1386)
2-6-EDC یا EDAC1
محبوب ترین و متداول ترین کربودی ایمید برای استفاده در کونژوگه مواد بیولوژیکی EDAC می باشد.به صورت محلول در آب و بدون استفاده از حلال های آلی قابل استفاده است. محلول های اضافی و ایزوواره های تشکیل شده مانند فراورده های واکنشی اتصال نتقاطع که هر دو محلول در آب مب باشند باید توسط دیالیز و ژل فیلتراسیون حذف شوند.این ماده به دلیل ناپایداری در برابر آب ،باید در مکانی خشک و دمای -30ᶜ نگهداری گردد و قبل از استفاده از آن باید در دمای اتاق گرم شود.در محلول های آبی هیدرولیز توسط آب صورت می گیرد که واکنش های رقابتی اصلی می باشد. جدا شدن واسطه ی استری فعال، تشکیل ایزوواره می دهد و کربوکسیل احیا می شود.هیدرولیز استر فعال در PH=4.7 با کربودی ایمید EDAC محلول در آب انجام می گردد.حضور کربوکسیلات ها و آمین ها بر روی مولکول های کونژوگه شده با EDC ممکن است به دلیل پلیمریزاسیون خود به خودی باشد زیرا ماده زمینه می تواند با مولکوهایی از نوع خودش نیز واکنش دهد و محصولی جز هدف خواسته شده ایجاد گردد.برای مثال : هنگامی که پپتید با پروتئین حامل توسط EDC کونژوگه می شود.در این مورد پپتید معمولا هم دارای کربوکسیلات و هم آمین می باشد و در نتیجه، علاوه بر جفت شدن با حامل،پلیمریزاسیون پپتیدی رخ می دهد.برای این نوع از کونژوگه های ایمونوژن، پلیمریزه شدن و استفاده از آن مضر نیست زیرا خود پپتید پلیمریزه شده نیز ایمونوژنیک می باشد ولی در رابطه با کراس لینک های دیگر مطلوب است؛ از تشکیل الیگومر جلوگیری نمود.محیط واکنش بهینه برای کربودی ایمید PH<7.5 می باشد تا محصولات بی ضرر و اصلی تشکیل گردند و معمولا طبق دستورالعمل های مخصوص هر کار با محلول HCL اسیدیته ی خواسته شده را ثابت نگه می دارند.( شاپوری،1386)
2-7- کونژوگاسیون به روش آمیداسیون
بسیاری از پلی ساکاریدهای باکتریایی در حالت طبیعی فاقد گروه های شیمیایی فعال مانند گروه های آمینو و یا کربوکسیل هستند و به همین دلیل به طور مستقیم نمی توانند به یک حامل پروتئینی به صورت کوالان متصل شوند.در کونژوگاسیون به روش آمیداسیون که یکی از بهترین روش های موجود برای کونژوگه کردن ترکیبات پلی ساکاریدی به پروتئین می باشد ، از آدپیک اسید دی هیدرازید (Spacer) به عنوان یک مولکول فاصله گذار(ADH) 6 کربنه و 1- اتیل – 3(3- دی متیل آمینو – پروپیل ) کربودیمید ( (EDAC در نقش عامل جفت کننده استفاده میشود. EDAC سبب اتصال کوالان مشتق آدپیک هیدرازید – پلی ساکارید به حامل پروتئینی به صورت پیوند آمیدی بین هیدرازید پلی ساکارید با گروه های کربوکسیل پروتئین می شود. ممکن است واکنش های جانبی دیگری بین گروه های آمین اسید آمینه لیزین و کربوکسیل مجاور در یک مولکول پروتئینی و یا در سایر مولکول های پروتئینی به صورت اتصال متقاطع درون مولکولی صورت پذیرد. کونژوگاسیون با روش آمیداسیون سبب میشود که در چندین محل پلی ساکارید به مولکول حامل متصل شده و این حالت را ساختار مشبک می گویند. . برای تبدیل پلی ساکارید ها به آنتی ژن های باید نوع اتصال هاپتن به مولکول حامل از نوع کوالان باشد. سایر پیوند های محکم و یا غیر کوالان در این راستا موثر نمی باشند.چندین روش برای اتصال پلی ساکارید به پروتئین وجود دارد اما سه روش احیای آمیناسیون ، آمیداسیون و اتریفیکاسیون معمولا بهترین این روش ها محسوب می شوند.( شاپوری،1386)
2-8- تهیه کونژوگه ایمونوژن هاپتن1 – حامل
ماهیت ایمنی تطبیقی به توانایی یک موجود زنده در واکنش به مواد بیگانه و تولید انتی بادی وواکنش متقابل آنها و حفاظت از میزبان می باشد.یک آنتی ژن یا ایمونوژن ماده ای است که ،توانایی تولید این نوع پاسخ ایمنی را دارد و قادر به واکنش با سلول های تحریک شده علیه آن است.سیستم ایمنی دو نوع پاسخ علیه چالش های ایجاد شده توسط مواد بیگانه را دارد: پاسخ ایمنی سلولی ،که توسط لنفوسیت های T ایجاد می شود و پاسخ ایمنی همورال ،که توسط لنفوسیت های B تولید می گردد.نوعی از لنفوسیت های B که پروتئین های ترشحی به نام آنتی بادی میکنند پلاسماسل نام دارند.کونژوگاسیون پلی ساکارید با پروتئین، پلی ساکارید را از فرم آنتی زن غیر وابسته به سلول T به انتی ژن وابسته به سلول T تبدیل می کند،که سبب القای تیترهای بالای پاسخ ایمنی در حیوانات می شود. آنتی ژن ها معمولا ماکرومولکول هایی هستند که شامل مکان های آنتی ژنی تشخیصی یا اپی توپهای سازمان دهی شده می باشند که با اجزائ سیستم ایمنی واکنش متفابل دارند.آنتی زن ها ممکن است مولکول هایی با ترکیبات آلی مانند : پروتئین ،لیپو پروتئین، RNA،DNA ، پلی ساکاریدها و یا قسنت هایی از ساختارهای سلولی باکتریایی،قارچ یا ویروس باشند. مولکول های کوچکی مانند پپتید های کوتاه که اغلب نمی توانند به تنهایی باعث ایجاد پاسخ ایمنی گردند را هاپتن می گویند.این مولکول ها آنتی ژن های ناقصی هستند که به صورت ترکیب با مولکول حامل مناسب می توانند به عنوان ایمونوژن عمل کند.حامل ها معمولا مولکول هایی با وزن مولکولی بالا هستند. مولکول های هاپتن حاوی آلدهید با وزن مولکول حامل توسط احیای آمیناسیون متصل گردند.
2-9- پروتئین های حامل مناسب برای ایجاد کونژوگه های آنتی ژنیک
متداول ترین حامل های مورد استفاده مولکول های بزرگی هستند که ایمنی زایی بالایی ایجاد میکنند و با مولکول های هاپتن پیوند کوالانسی ایجاد میکنند.یکی از مناسب ترین این ها پروتئین ها می باشند ام حامل های دیگری مانند لیپید دو لایه ( لیپوزوم) ،پلیمرهای طبیعی یا مصنوعی ( دکستران، آگارز ) یا مولکول های طراحی شده نیز وجود دارند.اولین مولکول های حامل برای کونژوگاسیون ، پروتئین های ایمونوژن بودند. حامل های پروتوینی به فراوانی حل می شوند و دارای گروه عاملی فراوانی هستند که می توانند کونژوگاسیون با مولکول های هاپتن را تسهیل کنند.متداولترین حامل های پروتوینی که امروزه از آنها استفاده می گردد به شرح زیر می باشند:
KLH ، سرم آلبومین گاوی ( BSA ) ، سرم آلبومین گاوی آمینواتیل دار، تیرو گلبولین، اوآلبومین ( OVA ) و انواع توکسوئیدهای پروتئینی مانند توکسین ها یا توکسین دیفتری ،توکسین یا توکسءید کزاز، موتانت های غیر توکسیک دیفتری CRM-197 ، اگزوتوکسین A سودوموناس ،پنومولیزین استرپتوکوکوس پنومونیه، فیلامنت هماگلوتینین ( FHA ) بوردتلا پرتوسیس، پیلی یا پیلین نایسریا گونوره آ، پیلی یا پیلین نایسریا مننژیتیدیس، OMP نایسریا گونوره آ، پپتیداز CoA استرپتوکوکوس . پروتئین های سطحی مورکسلا کاتارالیس.دیگر پروتئین هایی که گاهی اوقات استفاده می شوند: میوگلوبین، سرم آلبومین خرگوش،مولکول های ایمونوگلوبولین، ( به ویژه IgG ) از سرم موشی یا گاوی ، توبرکولین خالص شده.
2-10- ادجوانت های مناسب در طراحی واکسن کونژوگه
آلومینیوم فسفات، آلومینیوم هیدروکساید، مونوفسفوریل لیپید A، 3- دی آسیل مونوقسقوریل لیپید A، QS21 همچنین انواع پاک کنندها : ( تریتون X100 ،زوئترجنت 1 و دزوکسیکولات ) در ترکیب با ترکیبات آلومینیومی.در کل پاسخ آنتی بادی ها در حضور کونژوگه ی همراه ادجوانت در واکسن ،افزایش می یابد.
2-11- سنجش فعاليت باكتري كشي
حساسيت ميكروارگانيسم ها به عوامل ضد ميكروبي اغلب در آزمايشگاه به وسيله اندازه گيري فعاليت ممانعت از رشد آن ها سنجيده مي شود. اين سنجش ها، آزمون هايي هستند كه هميشه اطلاعات كافي براي تعيين روش درماني مناسب مبتلايان به عفونت هاي خاصي مثل اندوكارديت نمي دهند. علاوه بر آن، عوامل ضد ميكروبي خاصي مثل β –Lactam ها، كه داراي فعاليت باكتريسيدالي نيز مي باشند،نمي توانند براي تمامي ارگانبيسم ها كشندگي داشته باشند. بنابراين، نياز به روش هاي آزمايشگاهي جديدي كه بتواند فعاليت باكتري كشي يك عامل ضد ميكروبي را تعيين كند، مي باشد.
آزمون Serum Bactericidal Assay (SBA)، روش اصلاح شده Broth Dilution مي باشد، كه فعاليت ضد باكتري سرم يك بيمار را در هنگام مواجهه با باكتري پاتوژن را بررسي مي كند. اين تست، يكي از تست هايي است كه در آزمايشگاه ميكروبيولوژي پزشكي در ارتباط با پاتوژن، عامل ضد ميكروبي و بيمار مي باشد.با اين وجود، استفاده از چنينتستي براي بررسي فعاليت باكتري كشي در سرم بيمار به مذت ٤٠ انجام مي گيرد وسوالاتي براي نحوه انجام آن، تفسير و نتايج آن ايجاد شده است.
در ميان روش هاي آزمايشگاهي بررسي فعاليت باكتري كشي سرم بيمار، هيچ كدام به اندازه SBA موثر نبودند. سابقه آزمون هاي برآورد فعاليت ضد باكتري خون به دوره هاي قبل از عصر آنتي بيوتيك مي رسد. با اين وجود، Schlichter و Mac Lean را بنيانگذار روش SBA مي دانند. آن ها بر روي خاصيت بازدارندگي رشد سرم مطالعه نمودند، اما نتوانستند ملاك درستي خصوصيت باكتري كشي تعريف كنند. در واقع، Fisher بود كه در نهايت روش Schlichter را با پاساژ دادن ل.له هايي كه رشد قابل مشاهده در آن ها ديده نمي شد، توانست اصلاح كند. اگر چه، Fisher اذعان داشت، نياز به تعيين غلظت باكتري كشي سرم مي باشد، اما هيچ روش قابل قبولي در دنيا براي Microdilution و Macrodilution در انجام SBA وجود ندارد. شكي نيست كه بررسي هاي مختلف SBA، اين تكنيك را از نظر كلينيكي، غيركاربردي دانسته و بر وجود استانداردسازي اين روش تاكيد مي كند. اين تست در هر جايي مي تواند انجام گيرد، اما از يك آزمايشگاه به آزمايشگاه ديگر، نحوه اجراي اين تكنيك، به دليل بررسي متغير هاي متنوع، متفاوت خواهد بود.
جهت اهداف كلينيكي، نسخه هاي متعدد و تغيير در نحوه اجراي تست مي تواند تعداد زيادي از متغير ها را از مطالعات حذف كند. بنابراين، كميته ملي استاندارد هاي آزمايشگاه هاي پزشكي آمريكا دستور العمل هايي را براي انجام SBA و مطالعات بررسي باكتري كشي به چاپ رسانده است. اين دستور العمل ها ابعاد مختلف SBA و پژوهش هاي باكتري كشي را بيان كرده و بر لزوم استانداردسازي اين روش ها تاكيد مي كند. پس از استانداردسازي، امكان انجام مطالعات پيچيده كلينيكي فراهم مي شود.
با وجود اين كه در In Vitro بررسي خاصيت كشندگي يك عامل ضد ميكروبي بسيار جذاب به نظر مي رسد، اما عواملي وجود دارند در اين بررسي هاي آزمايشگاهي مي توانند تداخل ايجاد كنند. اين فاكتور ها هم بيولوژيك، و هم تكنيكي هستند.
از عوامل بيولوژيك مي توان، وجود باكتري هاي مقاوم، اثر متناقض (Paradoxal Effect)، تولرانس باكتري در برابر ماده ضد ميكروبي و انتشار عامل مقاومت را نام برد.
از عوامل تكنيكي مي توان، فاز رشد كشت تلقيح شده، مقدار كشت، عدم تماس كافي بين دارو و ميكروارگانيسم، حجم نهايي باكتري پس از فعاليت باكتري كشي و انتخاب محيط كشت مناسب را نام برد.
مراحل انجام روش SBA به ترتيب تهيه سرم بيمار، تهيه رقت و ساخت محيط كشت، تلقيح سرم بيمار در محيط كشت ، انكوباسيون، تعيين ميزان باكتري كشي سرم، كنترل كيفي مي باشد.
از اين روش مي توان در جهت تشخيص، هم چنين بررسي ميزان ايمني زايي واكسن ها در عفونت هاي Streptococccus pneumonia، Vibrio cholera، Haemophilus influenza ،Neissria meningitidis، Brucella abotus و … پرداخت.

فصل سوم

مواد
و
روش ها

3-1-1 مواد و وسایل لازم
1- سویه استاندارد هموفیلوس آنفلوآنزا تیپ b
2- انکوباتور
3- هود میکروبی- هود کشت استریل
4- اتوکلاو
5- پمپ و دستگاه تقسیم
6- سانتریفوژ یخچالدار(HeHich)
7- لام
8- بن ماری شیکردار
9- یخچال 40C
10- فریزر
11- لوله آزمایش
12- ارلن
13- مزور
14- ظروف 1 لیتری سانتریفوژ
15- بشر
16- سمپلرو سرسمپلر
17- پیپت
18- پیپت پاستور
19- پلیت شیشه ای و پلاستیکی
20- سرنگ 5 cc و cc 2
21- دستکش لاتکس
22- ماسک
23- پارافیلم
24- چسب اتوکلاو
25- فویل آلومینیومی
26- یخ
27- لوله شیشه ای سانتریفوژ
28- کیسه دیالیز با Cut off: 10.000
29- فیلتر میلی پور 22/0 و 45 میکرونی
30- ترازوی دیجیتالی حساس
31-ترازوی دقیق
32- گالن 5 لیتری
33- ویال استریل CC10 و 50
34- پانچر(Puncher)
35- دستگاه اسپکتروفوتومتر(Deckman)
36- کاغذ واتمن شماره 1
37- دستگاه ELISA Reader
38- خرگوش سفید نیوزیلندی
39- موش سوری
40- میکروپلیت
41- شعله گاز
42- دستگاه الکتروفورز
43- نرم افزار Excel
44- فرمانتور
45- محیط کشت Brucella agr و Brucella broth
46- سرم فیزیولوژی آپیروژن
47- بافر PBS)pH:6/4)
48- بافر PBS)pH:7/2)
49- بوات دورو
50- فنل
51- آب مقطر آپیروژن
52- اتانول مطلق Merck
53- متانول
54- استات سدیم
55- تری کلرواستیک اسید(T.C.A)
60- تریس بافربازی
61- 1و 9- دی متیل متیلن بلو
62- گلایسین
63- NaOH
64- دسیکاتور
65- بافرباربیتال(Ph:8.6)
66- باربیتات سدیم
67- باربیتوریک اسید
68- مرتیولات
69- اسیداستیک گلایسیال
70- کوماسی بریلیان بلو (R-250)
71- کوماسی بریلیان بلو(G-250)
74- ادجوانت آلومینیوم هیدروکسید
76- آکریل آمید و بیس آکریل آمید
77- سدیم دودسیل سولفات (SDS)
78- TEMED
79- 2_ مرکاپتواتانول (2-ME)
80- اوره
82- هیدروکسید آمونیوم و هیدروکسید سدیم
84- پلیت میکروتیتر پلی استیرنی 96 خانه ای(استریل)
85- آزید سدیم
86- فسفات سدیم
87- کلرید سدیم
89-اورسینول
91-ایزوپروپانول
92- سفارزCL-4B
93- (ADH)
94- (EDAC)
3-2-1- تهيه ميكروارگانيسم هاي به كار گرفته شده در اين مطالعه:
سویه باکتری همو فیلوس آنفولانزای تیپ b با شماره PTCC 1623 براي تهيه PRP استفاده شد و از كلكسيون ميكروبي بخش واكسن هاي ميكروبي و تهيه آنتي ژن انستيتو پاستور ايران تهيه شد.
3-2-2-باز كردن سویه باکتری همو فیلوس آنفولانزای تیپ b ليوفيليزه و کشت آن :
براي بازكردن هر سوش ليوفيليزه دستور خاصي وجود دارد، در مورد سوش همو فیلوس آنفولانزای تیپ b با شماره PTCC 1623 ابتداcc /05 محیط BHI broth تزريق شد. سپس، در ٣ مرحله در محيط كشت BHI broth كشت داده شد. اين كشت ها در زمان هاي متفاوتي انجام شدند. در مرحله اول 2 ساعت، مرحله دوم 1 ساعت و در مرحله سوم محيط كشت BHI broth ٣ ساعت در درون انكوباتور در دماي ٣٧ درجه سانتيگراد انکوبه میکنیم،بعد از 6ساعت باکتری فعال می شود. با سرنگ مقدرای از سوشهایی که در محیط مایع BHI broth رشد کرده به داخل پلیت های شکلات آگار (3 عدد) می ریزیم و سپس کشت انبوه می دهیم و در داخل گرماخانه در 37c قرار می دهیم. بعد از رشد در این محیط برای حصول از اطمینان سالم بودن از محیط کشت از این سه پلیت رنگ آمیزی گرم حاصل می شود تا از آلوده شدن آن به میکروارگانیسمهای دیگر اطمینان حاصل شود. در این مرحله ماکلنی تک می گیریم بدین ترتیب که از یکی از سه پلیت قبلی که اطمینان حاصل شده سالم است مقداری باکتری برداشته و در پلیت جدید کشت خطی می دهیم تا کلنی تک بگیریم. سپس بعد از کشت خطی پلیت را در داخل گرماخانه قرار می دهیم. کلنی های هموفیلوس آنفلوآنزا ظرف 12-8 ساعت رشد می کنند. بدین ترتیب کلنی تک بدست می آوریم.جهت اطمینان از سالم بودن پلیت فوق رنگ آمیزی گرم به عمل می آید. برای اینکه مطمئن شویم سوش کپسول دار است باید تست آکروفلاوین انجام دهیم، به این صورت که مقداری از کلنی برداشته و بر روی لام با سرم فیزیولوژی حل کرده، سپس یک قطره آکروفلاوین به آن اضافه می کنیم اگر سوش smoth باشد نباید آگلوتیناسیون اتفاق بیفتد

شکال3-1- باز کردن سویه PTCC هموفیلوس آنفلوانزا

3-2-3-فرآوردن و تخلیص PRP
برای رسیدن به توده سلولی مورد نیاز جهت تولید PRP به میزان مناسب،برای رسیدن به حجم بالایی از محیط کشت از فرمانتور استفاده شد که مراحل کشت در فرمانتو به این ترتیب است : ابتدا تهیه بذر سپس تیمار عصاره مخمر، در ادامه آماده سازی ، نمونه گیری از فرمانتور و مراحل خالص سازی PRP .
3-2-4- تهیه بذر محیط کشت
در ابتدا باید بذر باکتری آماده گردد و سپس فرمانتور برای تخلیص پلی ساکارید آماده گردد. برای همین منظور از کشت تازه باکتری استفاده کردیم.محتویات بذر مورد نظر به ترتیب زیر برای حجم 1 لیتر بذر،تهیه شد.
گلوکز: 20 گرم ( شرکت مرک)
گاردن پی پپتون: 10 گرم (شرکت فلوکا)
سیستئین: 04/0 گرم (شرکت مرک)
تریپپتوفان: 05/0 گرم (شرکت مرک)
فسفات دی هیدروژن سدیم: 1 گرم (شرکت مرک)
دی فسفات هیدروژن سدیم 12 مولکول آب: 20 گرم (شرکت مرک)
سولفات آمونیوم: 2گرم (شرکت سیگما)
سولفات منیزیم 7 مولکول آب: 2/0 گرم (شرکت مرک)
کلرید کلسیم 2 مولکول آب: 05/0 گرم (شرکت سیگما)
عصاره‌ی مخمر دیالیز شده: 20 سی سی
نیکوتین آمیددی نوکلئوتید (NAD): 2 میلی گرم (شرکت مرک)
پروتوپورفیرین (Hemine): 1 میلی گرم (شرکت سیگما)
همچنین NAD و Hemine باید بعد از اتوکلاو شدن محیط بذر به صورت فیلتر شده اضافه شوند، چون توسط اتوکلاو شدن از بین می روند.تمام مواد بالا را در یک لیتر آب مقطر حل کرده و سپس اتوکلاو انجام میشود. باید به این نکته نوجه کنیم که چون عصاره مخمر دارای مقادیر حائز اهمیتی پلی ساکارید می باشد که موجب اختلال در فرایند تخلیص پلی ساکارید می کند،این پلی ساکارید باید تا حد امکان حذف گردد وبا اصلاح عصاره مخمر تیمار شود.باکتری کشت داده شده با 20 میلی لیتر محیط بذر شستشو وسپس به محیط کشت بذرمنتقل می‌شود. سپس بذر در انکوباتور شیکردار با 70 دور در دقیقه و دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت قرار می‌دهیم. تا باکتری رشدکند و محیط کدر شود. زمانی که جذب نوری این محیط در طول موج 600 نانومتر به حدود 4/0-5/0 برسد نشان می دهد که باکتری به فاز رشد لگاریتمی رسیده این مرحله از رشد برای تلقیح محیط بذر به محیط کشت اصلی( فرمانتور ) مناسب است.
3-2-5-تیمار عصاره مخمر:
100 گرم پودر عصاره مخمر را در 200سی سی آب مقطر حل کرده،برای یکنواخت شدن آن به همراه مگنت روی استیرر بدون حرارت قرار می گیرد.سپس عصاره مخمر را به کیسه های دیالیز با cutoff ، 10هزار که از قبل جوشانده بودیم(برای فعال شدن کیسه ی دیالیز) ریخته و بر علیه 5 لیتر آب مقطر با دمای 4درجه بود قرار گرفته ،داخل آلونژ یک عدد مگنت انداخته و آلونژ را بر روی استیرر و در یخچال قرار دادیم. آب جدید باید هم دمای آب قبلی باشد تا به پروتئن های عصاره مخمر آسیب نرسد و هر سه ساعت یک بار آب مقطر آلونژ را تعویض کردیم.تعویض را تا جایی انجام میدهیم که دیگر رنگ آب مقطر آلونژ تغییری نکند.برای مطمئن شدن از تکمیل مرحله دیالیز می توان از تست فتل اسید سولفوریک استفاده کرد.که اگر رنگ آب مقطر آلونژ با این قسمت قهوه ای شد یعنی حاوی پلی ساکارید است،و یا اینکه مایع آلونژ را در دستگاه اسپکتوفتومتری قرار داده و در طول موج 570 نانومتر،میزان جذب را قرائت کرده اگر جذبی مشاهده شد یعنی پلی ساکارید در داخل آب مقطر آلونژ وجود دارد.

شکال3-2- تیمار عصاره مخمر . چپ: تغییر رنگ آب در روز اول دیالیز عصاره مخمر.راست: روز سوم دیالیز عصاره مخمر بدون تغییر رنگ آب
3-2-6-آماده کردن فرمانتور و تلقیح بذر :
جهت کشت باکتری از فرمانتور نوع کویل با مخزن شیشه ای و حجم 60 لیتر ،ساخت شرکت Novo-Paljas
کشور هلند استفاده کردیم.

شکال3-3- فرمانتور Novo-Paljas کشور هلند

ابتدا 8 لیتر محیط کشت بذر با استفاده از فشار مثبت و عبور از فیلتر با قطر منافذ 45/0 مایکرومتر،محیط به مخزن فرمانتور منتقل کردیم و حدود 4 لیتر آب سرد به آن اضافه کرده،چون برای استفاده از فرمانتور بایدتمام مسیرهای ورودی و خروجی استریل شوند. فرمانتور را روشن، خروجی ها و ورودی های آن را در 121 درجه سانتی گراد با بخار حاصل از محیط کشت استریل کردیم. به مدت 15 دقیقه بخار از لوله های ورودی و خروجی آن عبور کرد. بعداز استریل شدن لوله ها، شیلنگ های ورودی و خروجی،سر این ها با کلیپس بسته شد تا آلوده نشوند. پس از این مخزن سرد شد، دما را روی 37 درجه و فشار را روی 2/0 بار تنظیم کردیم و به مدت 24 ساعت زمان می دهیم تا مطمئن شویم آلودگی ندارد. بعد از گذشت این زمان و در صورت شفاف بودن محیط، بذر را از انکوباتور شیکردار خارج کرده و حجم 1 لیتر محیط بذر را به محیط کشت منتقل کردیم، دمای فرمانتور 37 درجه سانتی گراد وPH روی 4/7 و 6/7 تنظیم شد. همچنین حدود cc 20 NAD و Hemin به فرمانتور منتقل کردیم .زمانی که PH محیط کاهش یابد سود 5 نرمال به صورت خودکار اضافه می شود تا با کاهش PH محیط باکتری از بین نرود.

شکال3-4- راست: اضافه کردن عصاره مخمر و فاکتور رشد – چپ : اضافه کردن بذر به محیط کشت
3-2-7-نمونه گیری از فرمانتور
برای اینکه بدانیم باکتری در چه مرحله ای از رشد است هر 2 ساعت یک بار از فرمانتور نمونه گیری و OD آن را در 560 نانو متر میخوانیم.ابتدا قبل از وارد کردن محیط بذر به محیط فرمانتور یک نمونه گیری انجام داده و به عنوان زمان صفر در نظر میگیریم و OD آن را قرائت میکنیم. اما در مراحل بعدی رشد از محیط کشت به عنوان بلانک استفاده شد.همچنین از محتویات فرمانتور با تهیه لام و رنگ آمیزی گرم از رسوب آن می توان از خالص بودن کشت داخل فرمانتور مطمئن شویم.در زمانهای صفر، 2، 4، 6 ساعت از فرمانتور نمونه گرفتیم و OD آن را خواندیم.که تا 4 ساعت بعد از آن افزایش OD مشاهده شد که نشان دهنده ی رشد لگاریتمی است. اما از ساعت چهارم تا 6 ساعت بعد از آن افزایش زیادی در OD مشاهده نشد که نشان دهنده ی پایان فاز سکون و شروع فاز مرگ باکتری است. همچنین برای اطمینان حاصل کردن سود را هم قطع کرده چون تغییر زیادی در PH محیط مشاهده نشد.پس فرمانتور را خاموش می کنیم.
بعد از حدود 6 ساعت رشد باکتری و مرحله لگاریتمی آن کامل شد ، محتویات فرمانتور را تخلیه و به آن حدود 200سی سی اتانول 6% اضافه کرده و یک شب در دمای 4درجه نگه داشتیم.
3-2-8- مرحله رسوب دهی الکلی
به منظور جداسازی محیط کشت و توده سلولی محتوی فرمانتور را به مدت یک ساعت در 3500 دور سانتریفوژ کردیم.سوپر ناتانت را جمع آوری و سلول های ته نشین شده را دور ریختیم.سانتریفوژ باعث جدا شدن کپسول باکتری از سلول شده و در فاز مایع حل می گردد.
3-2-9- مرحله الکل زنی
سوپرناتانت را جمع آوری شده را به مدت یک شب در یخچال با دمای 4 درجه نگه داشتیم. به ازاء هر 5/2 لیتر سوپرناتانت حدود 6 لیتر و 750سی سی اتانول 96% اضافه شد. بعد از اضافه کردن الکل به سوپرناتانت، سوپرناتانت را به مدت یک شب در دمای 4درجه نگه میداریم، سپس بعد از یک شب، ظرف های شیشه ای را از یخچال خارج کرده PH آن را اندازه میگیریم(3/7)، بعد به آن گلاسیال استیک اسید اضافه و PH آن روی 8/6 تنظیم شد. و دوباره به مدت 24 ساعت آن را در دمای 4 درجه نگه داری می کنیم تا پلی ساکارید ها رسوب کنند.

شکال3-5- رسوب حاصل از الکل زنی
3-2-10- مرحله شست و شو با کلریدمنیزیم:
بعد از 24 ساعت، محتویات آلونژ هارا به مدت 1 ساعت با دور 3000 سانتریفوژ کرده، سوپر ناتانت را دور ریخته و رسوب حاصل را نگه داشته و حدود 8/1 لیتر کلرید منیزیم 6 ملکول آب با غلظت 05/0 مولار به آن اضافه کرده و خوب مخلوط میکنیم تا بطور کامل رسوبات حل شوند و آن را به مدت 1ساعت با دور 3000 سانتریفوژ میکنیم.رسوبات را دور ریخته و سوپر ناتانت را نگه میداریم.
3-2-11- تیمار با ستاولن:
سوپرناتانت جمع آوری شده حدود 5/2 لیتر بوده که با حدود 100سی سی ستاولن 2% ( سیگما) مخلوط میکنیم و یک شب در دمای 4 درجه نگه میداریم.پس از یک شب محلول را به مدت 1ساعت در 3000 دور سانتریفوژ کرده، رسوب را نگه داشته ، سوپر ناتانت را دور میریزیم.
3-2-12- افزودن فسفات سدیم
رسوبات را با حدود یک لیتر فسفات سدیم 7/0مولار حل کرده، محلول را به مدت 1ساعت در 3500 دور سانتریفوژ کردیم ، سوپر ناتانت را از رسوبات جدا کرده، حدود 930سی سی سوپر ناتانت حاصل شد.
3-2-13- مرحله الکل زنی مجدد:
چون در مرحله اول الکل زنی به ازاء هر لیتر حدود 2لیتر و 600سی سی اتانول 96% اضافه شد این بار هم حدود 2لیتر و 418سی سی اتانول 96% به سوپر ناتانت که حدود 930سی سی بود اضافه شد. و این محلول را به مدت یک ساعت در دمای آزمایشگاه نگه داشتیم و سپس در یخچال به مدت یک شب قرار دادیم.
3-2-14- تیمار با هیدروکسیل آپاتیت:
سپس محلول را به مدت 1ساعت در 3500 دور سانتریفوژ کردیم و به رسوب ایجاد شده حدود cc900 محلول هیدروکسیل آپاتیت 1/0 درصد (Merck) اضافه شد تا بطور کامل حل شوند، سپس به مدت 1ساعت با 3500 دور سانتریفوژ انجام می دهیم، به رسوبات حاصل شده از سانتریفوژ حدود 500سی سی محلول استات سدیم 5/0مولار (Merck) اضافه کرده و به مدت یک شب در یخچال قرار میدهیم. پس از یک شب حدود 5 گرم سدیم دزوکسی کلات (Merck) اضافه ، حدود 2ساعت در یخچال آن را نگه داشته، بعد محلول را به فالکن های 50سی سی منتقل و به مدت نیم ساعت ا دور 9000 سانتریفوژ کرده، سوپر ناتانت را جمع آوری، فیلتر و سپس لیوفیلیزه کردیم.
3-2-15- فیلتراسیون سوپرناتانت
حدود 500 سی سی سوپرناتانت حاصل شد که توسط فیلتر هولدینگ و با قطر منافذ 45/0 میکرون، فیلتراسیون انجام شد.
3-2-16- لیوفلیزاسیون
برای حفظ پایداری و ماندگاری طولانی مدت، PRP تخلیص شده باید لیوفلیزاسیون شود. به این منظور محلول حاصل، در حجم‌های 2 میلی لیتردر ویال‌های کوچک تقسیم شد و برای لیوفلیزاسیون به بخش تولید انستیتوپاستور فرستاده شد.
3-2-17- تعیین خلوص PRP تخلیص شده :
نمونه های تخلیص شده PRP برای تعیین خلوص و مقایسه با PRP استاندارد با روش طیف سنجی NMR و FTIR به بخش شیمی فیزیک دانشگاه تهران ارسال شد.درصد خلول PRP به عنوان پلی ساکارید مورد استفاده در کونژوگاسیون از اهمیت ویژه ای برخوردار است.زیرا هرچه خلوص بیشتر باشد اتصال پلی ساکارید با کریر پروتئینی بهتر انجام می گیرد.
3-2-18- تست ریبوز
سنجش ریبوز و PRP بر اساس تست بیال انجام شد. (آشول و همکاران، 1957)
3-2-18- 1- اساس تست بیال
ریبوز جزء قندهای 5 کربنه (پنتوز) محسوب می‌شود، در این روش می‌توان هگزوزها و پنتوزها را از هم تشخیص داد و روشی اختصاصی برای تشخیص پنتوزها می‌باشد.
پنتوزها در مجاورت اسیدکلریدریک غلیظ، آب از دست داده، فورفورال تولید می‌کنند، فورفورال با اورسینول به کمپلکس با رنگ سبز مایل به آبی تبدیل می‌شود. ( آشول و همکاران، 1957).
3-2-18- 2- معرف‌های تست بیال :
اورسینول
اسید هیدروکلریک غلیظ
فریک کلرید
اتانول
3-2-18- 3-محلولها و ترکیبات :
A- محلول 10% فریک کلرید (Fecl3) در اسید کلریدریک (12 نرمال)
B- محلول 10٪ اورسینول- اتانول (95 درصد)
C- محلول 10٪ استوک ریبوز
3-2-18- 4-تهیه‌ی محلول‌های استاندارد ریبوز :
ابتدا حدود 25 میلی گرم از ریبوز استاندار (مرک) را برداشته و در 100 میلی لیتر آب مقطر حل می‌کنیم (استوک1)، سپس 1 میلی لیتر از استوک 1 را برداشته و حجم آن را با آب مقطر به 10 میلی لیتری می‌رسانیم، سپس به میزان 1/0، 2/0، 4/0، 6/0، 8/0، 1 میلی لیتر از استوک 2 برداشته و سپس با آب مقطر حجم همه‌ی تیوپ‌ها را به 2 میلی لیتر می‌رسانیم. سپس به همه‌ی لوله‌ها 2 میلی لیتر از محلول gl5/0 کلریدفریک در اسید کلریدریک اضافه می‌کنیم، هم‌چنین به همه‌ی تیوپ‌ها 2/0 میلی لیتر از محلول grl100 اورسینول در اتانول اضافه می‌کنیم. سپس هر 6 تیوپ را به مدت 20 دقیقه در حرارت 100 درجه سانتیگراد قرار می‌دهیم. (شکل 3-11 )بعد از 20 دقیقه بلافاصله تیوپ‌ها را در آب سرد قرار می‌دهیم. بعد از آن جذب نوری هر 6 تیوپ را در 670 نانومتر قرائت کرده و بر اساس آن منحنی استاندارد ریبوز را رسم می‌کنیم.

ب الف
شکال3-6- تهیه استانداردهای ریبوز(الف -قبل از حرارت ، ب – بعد از حرارت)

3-2-18- 5- آماده سازی PRP تخلیص شده
حدود 1 میلی گرم از PRP لیوفلیزه شده را برداشته و در 40 میلی لیتر آب مقطر حل می‌کنیم، سپس حدود 2/0 میلی لیتر از این محلول را برداشته و مراحل زیر را به ترتیب عمل می‌کنیم:
1- حجم محلول را با آب مقطر به 2 میلی لیتر می‌رسانیم.
2- اضافه کردن 2 میلی لیتر از محلول gl5/0 کلریدفریک در اسید کلریدریک
3- اضافه کردن 2/0 میلی لیتر از محلول grl100، اورسینول در اتانول
4- قرار دادن تیوپ در دمای 100 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه
5- قرار دادن تیوپ در آب سرد
6- قرائت جذب نوری تیوب ها در 670 نانومتر
7- پس از رسم نمودار استاندار ریبوز، میزان ریبوز در نمونه‌ی PRP تخلیص شده بر حسب میکروگرم در میلی لیتر محاسبه شد. (آشول و همکاران، 1957)
3-3-1- آزمون هاي پروتئين سنجي
چهار روش به طور روتين براي تعيين غلطت پروتئين ها در يك محلول استفاده مي شود. اين روش ها شامل يك روش بر اساس جذب طبيعي اشعه ماورا بنفش بوده و در سه روش ديگر، رنگ پروتئين ها تغيير پيدا مي كند. اين روش ها شامل، آزمون Lowry، آزمون Smith Copper/Bicinchoninic، و آزمون سنجش رنگي Bradford مي باشد. با وجود اين كه يكي يا چند روش اشاره شده در آزمايشگاه هاي بيوشيميايي مورد استفاده قرار مي گيرند،اما انجام هيچ كدام از آنها به طور خاص ، به دلايل زير به سادگي امكان پذير نمي باشد.
در روش اول ، كه جذب UV بوده، به يك پروتئين خالص كه داراي ضريب (؟) بالايي است كه در يك محلول عاري از مواد مداخله گروجود دارد، نياز داريم. غلطت يكك پروتئين در يك محلول، به طور تقريبي مي تواند توسط معادله هاي زير برآورد شود:
A280 = 1 A (mL/cm mg) x [Conc.] (mg/mL) x 1 (cm)
A205 = 31 A (mL/cm mg) x [Conc.] (mg/mL) x 1 (cm)
پروتئين هاي مختلف داراي ضريب هاي شكست مختلفي در ٢٠٥ و ٢٨٥ نانومتر هستند، و غلظت هاي بدست آمده به اين روش بايد با دقت زيادي مورد بررسي قرار گيرند. پس به طور خلاصه در اين آزمون، محلول پروتئيني بايد فاقد مواد جاذب UV ديگر باشد، و تمامي سنجش ها بايد در كووتي از جنس كوارتز انجام گيرند.
در روش هاي Lowry و Copper/bicinchoninic، اساس واكنش بر احيا شدن Cu2+ به Cu1+ توسط آميد ها مي باشد. با اين كه اين روش ها نسبتا دقيق هستند، اما به محلول سازي هاي زيادي نياز دارند، كه بايد در زمان انجام آزمايش تهيه شوند. سپس، انكوباسيون بايد با اختلاف دماي كم و كنترل شده اي انجام شود و فورا ميزان جذب محلول هاي نا پايدار نيز بايد خوانده شود. هر دو آزمون تحت تاثير مواد فراوان موجود ديگر در محلول، مثل دترجنت ها، ليپيد ها، بافرها و احيا كننده قرار مي گيرند. هم چنين اين آزمون ها نياز به تهيه رقت هاي سريالي دارند، اما در هر آزمون، نياز به رقت هاي مختلفي از پروتئين نمونه مي باشد.
روش رنگي Bradford بر اساس تشكيل تعادل بين ٣ حالت مختلف از ربگ كوماسي بلو است.نحن شرايط سخت اسيدي، رنگ بيشترين پايداري را از خود نشان مي دهد و به صورت قرمز پر رنگ
(double protononated) در مي آيد. پس از اتصال به پروتئين ها، بيشترين پايداري در رنگ آبي پر رنگ (unprotonated) ديده مي شود.
Protein
Red <=======> Green ======== Blue ======= Blue-Protein
(470 nm) H+ (650 nm) H+ (590 nm) (590 nm)

3-3-2روش برادفورد
روشي سريع، داراي مراحل محلول سازي كمتر، بدون نياز به حرارت دادن، و داراي پاسخ رنگي مطمئن تري نسبت به روش هاي ديگر است. اما مانند روش هاي ديگر، به موادي غيرپروتئيني، مثل دترجنت ها نيز پاسخ مي دهد. هم چنين، بسته به غلطت پروتئين موجود، ميزان پاسخ رنگي هم تغيير پيدا مي كند. به همين دليل، انجام سنجش هاي پروتئيني استاندارد اهميت دارد.
محلول هاي به كار رفته در روش هاي پروتئين سنجي قابل دسترس و آماده هستند. روش هاي اصلاح شده اي نيز وجود دارند كه در متن به آنها اشاره شده است.
3-3-3- روش پروتئين سنجي Lowry
در اين روش، ٢ واكنش شيميايي اساسي رخ مي دهد: در واكنش اول، يون Cu+2 با مولكول هاي پروتئيني وارد واكنش مي شود. در نتيجه، يك كمپلكس پروتئين- مس دو ظرفيتي را به وجود مي آورد. در واكنش دوم، اسيد فسفو تنگستيك و اسيد فسفو موليبديك از محلول فولين باعث ايجاد رنگ خاصي در كمپلكس فوق مي شود. در كمپلكس پروتئين- مس دو ظرفيتي، اسيد آمينه تيروزين و تريپتوفان احيا مي شوند و غلظت رنگ آبي محلول به ميزان پروتئين موجود بستگي دارد. حساسيت اين روش، بين mg/ml ٣٠٠-١ است.
محلول هاي مورد نياز براي انجام روش Lowry:
محلول A: شامل ٢٠ گرم Na2CO3 و ٥ گرم تارتارات سديم-پتاسيم است كه در ١ ليتر سود M ١/٠ حل مي شود.
محلول B: ٥ گرم سولفات مس آبدار ٥ ظرفيتي (CuSO4, 5 H2O)را به محلول سيترات سديم M ٠١/٠ افزوده، و با آب مقطر به حجم ١ ليتر رسانده مي شود.
محلولC : ml٥٠ از محلول A با ml ١ از محلول B مخلوط شد. توجه داشته باشيد كه محلول C بايد به صورت تازه تهيه شود و مدت زمان نگهداري آن تا حداكثر ٤٠ ساعت براي مصرف مي باشد.
محلول D: محلول فولين به نسبت مساوي با آب مقطر رقيق كرده، و بايد در ظروف تيره رنگ و در يخچال نگهداري كرد.

نمودار 3-1- نمودار استاندارد لوري

3-4-1- آزمون ایمونو ژل دیفیوژن
اين آزمون، صحت استخراج PRP را نشان مي دهد. براي انجام اين آزمون، 8/0 گرم آگار درcc ١٠٠ بافر باربيتول با ٢/٧pH= جوشانده تا رنگ آن شفاف گردد. مقدار جزئي سديم آزايد براي جلوگيري از رشد ميكروارگانيسم هاي ديگر، به محلول اضافه شدسپس آنرا در پلیت های شیشه ای تقسیم کرده تا جايي كه سطح زيرين پليت را پوشاند در حرارت اتاق رها شد تا ژل ببندد. با استفاده از انتهاي پيپت پاستور، چاهك هایی بر روي هر ژل با فاصله ٥/١ سانتيمتري از هم ديگر، بر روي ژل ايجاد شدند. آنتي ژن ها ، آنتي سرم ها در جایگاه های مخصوص درون چاهک ها ریخته و پلیت ها را برای 24-72 ساعت در اتاقک مرطوب در دمی 37 درجه سانتی گراد قرار داده تا تشکیل خطوط رسوبی مشاهده گردد.
3-5- سنجش نوکلئیک اسید
میزان اسید نوکلئیک موجود در پلی ساکارید به روش اسپکتروفوتومتری uv اندازه گیری گردید که در میزان اسید هسته ای کمتر از 20 میکروگرم در هر گرم پلی ساکارید محاسبه شد که این مقدار قابل قبول می باشد.
3-6-تخلیص اگزوتوسین A سودوموناس آئروژينوزا PA103
در اين پروژه از گونه استانداردسویه PA103 Liu سودوموناس آئروژينوزا جهت تهیه اگزوتوكسين A استفاده شد. اين باكتري‏‏ از مركز كلكسيون باكتري‏های استاندارد بخش واكسن‏های باكتريايي انستيتو پاستور ايران تهيه گردید.
3-6-1- طرز باز كردن سوش ليوفيليزه جديد
براي بازكردن هر سوش ليوفيليزه دستور خاصي وجود دارد، مثلا، ممكن است گفته شود ابتدا ٣-٥ سی سی سرم فيزيولوژي يا آب مقطر داخل ويال تزريق شود. در مورد سوش PA103 ابتدا 5 سی سی سرم فيزيولوژي تزريق شد. سپس، در ٣ مرحله در محيط كشت بروسلا براث كشت داده شد. اين كشت ها در زمان هاي متفاوتي انجام شدند. در مرحله اول ١ ساعت، مرحله دوم ٢ ساعت و در مرحله سوم محيط كشت بروسلا آگار ٣ ساعت در درون انكوباتور در دماي ٣٧ درجه سانتيگراد، به مدت 24 ساعت درون انكوباتور قرار داده شد.
3-6-2-تهيه لوله بذر
يك لوله از كشت 24 ساعته سويه PA103 سودوموناس آئروژینوزا به وسيله سرم فيزيولوژي شستشو داده و در 2 لوله محيط كشت تریپتیکاز سوی براث تلقيح گرديد تا از عدم آلودگی ان اطمینان حاصل گردد و به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه سانتي‏گراد انكوبه نموديم تا سویه مورد نظررشد کند.
3-6-3- اطمینان از خالص بودن سوش
قبل از تلقیح سوش به محیطها و بررسی اثر تولید اگزوتوکسین A ،برای اینکه اطمینان کامل از خالص بودن سوش و عدم حضور گونههای دیگر باکتریایی حاصل شود ،یک اسمیر از کشت را تهیه کردیم و به روش رنگ آمیز ی گرم رنگ شد ،سپس توسط میکروسکوپ نوری لام بررسی شد.
3-6-4- تست سوش برای تولید اگزوتوکسین A
بعد از اینکه سوش خالص PA103 سودوموناس آئروژینوزا بدست آمد و از عدم الودگی آن اطمینان حاصل کردیم، آن را د ر محیط TSB به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد کشت دادیم ،سپس محتویات محیط کشت توسط سانتریفیوژ به مدت نیم ساعت با دور rpm 2000 سانتریفیوژ شدو توده سلولی را جدا کرده و مایع رویی جمع آوری شد.مایع رویی را جهت استریل کردن از فیلتر سرنگی 45/0 عبور دادیم و سپس این مایع به صورت درون صفاقی به موش تزریق شد.موشها بعد از 24 ساعت کشته شدند.مرگ موشها نشان دهنده بود که اگزوتوکسین A توسط سوش مذکور تولید شده بود.

3-6-5-تهیه محیط کشت
ترکیب محیط کشت تریپتیکاز سوی براث:
17 گرم آنزیم هضم کننده کازئین
3 گرم آنزیم هضم کننده سویا
5 گرم سدیم کلراید
5/2 گرم دی پتاسیم فسفات
5/2 گرم دکستروز
-20 سی سی گلیسرول
100 سی سی گلوتامات سدیم 1 مولار
60 گرم TSB را در ml100 آب مقطر حل کرده و بر علیه سه تعویض1 لیتری آب مقطر در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت زمان 24 ساعت دیالیزنمودیم . محیط دیالیزشده TSB به همراه cc 20 گلیسرول و cc 100 گلوتامات سدیم به داخل یک ظرف ریخته و با اضافه کردن آب مقطر حجم محیط را به 2 لیتر می رسانیم و در دمای 121 درجه سانتیگراد در فشار 1 اتمسفر به مدت 15 دقیقه اتوکلاو می کنیم. محیط کشت تریپتیکاز سوی براث تهیه شده را در درون کیسه دیالیز ریخته و به مدت یک شب در 4 درجه سانتی گراد بر علیه سه تعویض آب مقطر دیالیز کردیم.
سویه PA103 سودوموناس آئروژینوزارا روی محیط بروسلا آگارکشت داده و داخل انکوباتور در دمای 37 درجه به مدت 18 ساعت قرار می دهیم. برای تهیه محیط کشت اصلی از کشت 18 ساعته بروسلا آگار یک لوله را با تامپون شستشو داده و به داخل 2 لیتر محیط TSB از قبل تهیه شده تلقیح می کنیم و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه و با دور 80 داخل انکوباتور شیکر دار قرار می دهیم. سپس در دور g3800 به مدت زمان50 دقیقه سانتریفوژ می کنیم.مایع رویی حاصل از هر کرام از محیط ها جمع آوری شد.

3-6-7- رسوب با استات روی 1 مولار
بعد از سانتریفوژ بلا فاصله سوپرناتانت را به داخل یخچال 4 درجه سانتیگراد انتقال میدهیم و100 سی سی استات روی 1 مولار به روی مایع بدست آمده از محیط کشت تریپتیکاز سوی براث به آرامی ( قطره قطره) اضافه کردیم. این مایه رویی به مدت چند ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد.سپس مایه رویی مذکور را سانتریفیوژکرده (3800 دور به مدت 60 دقيقه در 4 درجه سانتي گراد) و به رسوب حاصله مقداری سیترات سدیم 0.3 نرمال اضافه میکنیم تا رسوب حاصله حل گردد. سه مرتبه بر علیه 01/0 مولار تریس بافر با 8 PH= به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد دیالیز نمودیم..بعد از 24 ساعت دیالیز محتوای کیسه ها سانتریفیوژ(3500 دور به مدت 30 دقيقه در 4 درجه سانتي گراد)شد.
3-6-8- رسوب با سولفات آمونيوم:
قبل از اضافه کردن سولفات آمونیوم با اضافه کردن NAOH ، PH محلول را به 8 رسانده ، سپس به آرامي سولفات آمونيوم خشك60% اشباع كه از طريق نرم افزار Amunium sulfat calculator محاسبه شده

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه با موضوع ایالات متحده، دوران کودکی، ابتلا به بیماری Next Entries پایان نامه با موضوع فیزیولوژی