پایان نامه ارشد رایگان درباره كروموزوم، تهيه، باندينگ

دانلود پایان نامه ارشد

و محاسبه غلظت نسبي، DNA استخراج شده همراه نشانگر وزن مولكولي (SM0331, Fermentase) و DNA فاژ لامبدا روي ژل آگارز 8/0 درصد الكتروفورز شدند.

جدول 3-4. تركيبات محلول هاي P1، P2 و P3 استفاده شده در استخراج DNA
محلول
تركيبات
P1
P2
P3
1
50 mM Tris, PH 8
0.2 N NaOH
3M KOAc (C2H3KO2)
2
10 mM EDTA
1% SDS

3
100 µg/ml RNase


SDS: sodium dodecyl sulfate
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
3-4 نشاندارسازي DNA استخراج شده از كلون هاي BAC
در پژوهش حاضر نشاندار سازي پروب ها به صورت غير مستقيم با استفاده از سيستم بيوتين (به عنوان هاپتن) و آويدين و روش Nick Translation (Biotin-Nick translation Mix Kit, Roche applied science Inc. Cat#1174582490) انجام شد. در روش Nick Translation آنزيم DNase I يك شكاف در 3/-OH توالي DNA مورد نظر ايجاد مي كند. سپس يك يا چند نوكلئوتيد در كنار شكاف ايجاد شده با فعاليت اگزونوكلئازي /3 به /5 آنزيم DNA-Polymerase I باكتري E.coli جداسازي مي شوند. در مرحله بعد نوكلئوتيدهاي جدا شده با نوكلئوتيدهاي متصل شده به بيوتين به عنوان هاپتن توسط آنزيم اخير جايگزين مي شوند. تكرار واكنش هاي فوق باعث حركت منطقه برش داده شده و نشاندار سازي رشته DNA تازه سنتز شده مي شود (شکل 3-7). در پژوهش حاضر نشاندار سازي پروب ها طبق روش يانوزي و دي براردينو (2008) انجام شد.

3-5 تهيه كاريوتايپ گاو، گاوميش رودخانه اي، گوسفند و بز
پايه و اساس نقشه يابي فيزيكي ژن ها با تكنيك FISH آشنايي كامل با مرفولوژي كروموزوم ها و باندهاي كروموزومي خاص هر كروموزوم است. در واقع توانايي تفكيك كروموزوم ها با توجه به الگوي باندينگ آن ها اساس تمامي پژوهش هاي سيتوژنتيك در همه موجودات را تشكيل مي دهد. بر خلاف كروموزوم هاي انسان كه از هفت گروه آتوزوم ها (A-G) و كروموزوم هاي جنسي تشكيل شده است و در آن انواع مختلف كروموزوم ها شامل متاسانتريك، ساب متاسانتريك، آكروسانتريك با طول هاي متفاوت يافت مي شود كه به تفكيك كروموزوم ها در كنار الگوي باندينگ آن ها كمك مي كند، آتوزوم هاي گاوسانان همگي (به استثنا 3 و 5 آتوزوم به ترتيب در گوسفند و گاوميش) آكروسانتريك با كاهش طول نا محسوس هستند كه فقط تفكيك آن ها از طريق كسب تجربه از راه الگوي باندينگ امكان پذير است. به همين منظور قبل از وارد شدن به آزمايش FISH مدت زيادي صرف شناسايي و تفكيك كروموزوم هاي چهار گونه مورد مطالعه و تهيه كاريوتايپ آن ها شد. لازم به ذكر است كه يك پژوهشگر سيتوژنتيك كه در زمينه مكان يابي فيزيكي ژن ها كار مي كند بايد قادر به تفكيك راحت كروموزوم ها در متافاز گونه هاي مختلف باشد (در بخش 3-1-2 مواد و مراحل كشت سلول هاي خوني و تهيه اسلايدهاي RB-باندينگ شرح داده شد).

3-6 هيبريداسيون در محل فلورسنتي (FISH)
بعد از انتخاب اسلايدهاي متافازي مناسب تهيه شده با روش R- باندينگ براي FISH و نشاندار سازي پروب هاي BAC، آزمايش FISH در پژوهش حاضر با روش واسرشته سازي همزمان (Co-denaturation) پروب و كروموزوم ها روي صفحه داغ (Hot plate) انجام شد. ابتدا اسلايدهاي تهيه شده با روش RB- باندينگ در سري اتانول 70، 80 و 96 درصد هر كدام به مدت 5 دقيقه قرار داده شدند و بعد از خشكاندن در دماي اتاق با استفاده از Hoechst33258 رنگ آميزي شده و همرا با بافر 2 برابر SSC به مدت 40 دقيقه در معرض اشعه فرابنفش (UV) تيمار شدند. در اين فاصله نيز مخلوط واكنش به حجم 10 ميكروليتر حاوي 150-100 نانوگرم پروب نشاندار شده، 5/1 ميكروليتر Cot1 DNA گاوي و محلول واكنش هيبريداسيون تهيه شد. مخلوط هيبريداسيون به مدت 30 دقيقه در بن ماري در دماي 37 درجه سانتيگراد قرار داده شد كه اين مرحله را اصطلاحاً مرحله پيش اتصال (Pre annealing) مي نامند كه باعث اتصال Cot1 DNA با توالي هاي تكراري خاص گونه اي در پروب ها مي شود و از اين طريق سيگنال هاي ضميمه در FISH كاهش خواهد يافت. پس از مشخص كردن ناحيه مورد نظر براي FISH روي اسلايدها، ابتدا اسلايدها به مدت 2 دقيقه در دماي 60 درجه سانتيگراد روي صفحه داغ يا روي دستگاه PCR قرار داده شدند (مرحله پيش واسرشته سازي (Re denaturation)) و سپس مخلوط واكنش در مركز ناحيه مورد نظر ريخته شده و روي آن با لامل شيشه اي پوشانده شد. اسلايد به همراه مخلوط واكنش به طور همزمان به مدت 4 دقيقه در 75 درجه سانتيگراد روي صفحه داغ نگهداشته شدند و سپس در پارافيلم يا نايلون پيچيده شده و در جعبه مرطوب (Moist chamber) كه قبلاً آماده شده بود قرار داده شدند و به مدت 3-1 روز در انكوباتر 5//37 درجه سانتيگراد براي انجام مرحله هيبريداسيون بين پروب و DNA كروموزوم قرار داده شدند. بعد از انجام FISH در همان روز محلول 1/0 برابر SSC تهيه شده و در سه جار كوپلين درون بن ماري در دماي60 درجه سانتيگراد قرار داده شد تا در روز بعد در مرحله بعد از هيبريداسيون استفاده شود.

شکل 3-7. مراحل نشاندار سازي DNA با روش Nick Translation

3-7 مراحل بعد از FISH
پس از خارج سازي اسلايدها از انكوباتور، پارافيلم يا نايلون اطراف آن ها را باز كرده و به آرامي و با دقت لامل ها را جدا كرديم. بايد دقت كرد كه جدا سازي لامل ها با شدت و يا با كشش سبب پارگي متافازها خواهد شد. پس از جداسازي لامل ها، اسلايدها سه بار در محلول 1/0 برابر SSC هر كدام به مدت 5 دقيقه در 60 درجه سانتيگراد شستشو داده شدند.
3-7-1 آشكار سازي سيگنال هاي FITC
آشكار سازي سيگنال ها در پژوهش حاضر با استفاده از سيستم آنتي بادي هاي FITC-Avidin (Vector_A2011) و Anti-Avidin (Vector_A0300) انجام شد. پس از شستشوي اسلايدها در محلول 1/0 برابر SSC، در سه مرحله متوالي با ترتيب FITC-Avidin، Anti-Avidin و FITC-Avidin آنتي بادي ها روي محل هيبريداسيون اضافه شده و در هر مرحله با يك قطعه پارافيلم پوشانده شده و در انكوباتور 37 درجه سانتيگراد به مدت 30 دقيقه قرار داده شدند. بعد از هر بار خارج سازي از انكوباتور، پارافيلم ها را به آرامي جدا كرده و اسلايدها سه بار در بافر شستشو (PN- بافر) هر كدام به مدت 2 دقيقه روي شيكر شستشو داده شدند. استفاده متوالي از آنتي بادي ها در اين روش باعث تكثير و قوي تر شدن سيگنال هاي FITC خواهد شد. به اين ترتيب كه ابتدا FITC-Avidin به هاپتن بيوتن روي توالي DNA متصل مي شود. سپس در گام دوم آنتي بادي Anti-Avidin اضافه مي شود. Anti-Avidin ها به FITC-Avidin ها متصل مي شوند و چون هر Anti-Avidin داراي چندين دنباله متصل شونده براي FITC-Avidin هستند، در مرحله سوم با اضافه كردن مجدد FITC-Avidin در واقع سيگنال هاي FITC تكثير يافته و قوي تر مي شوند (شکل 2-1).

3-7-2 RBPI- باندينگ
پس از مرحله آشكار سازي سيگنال ها، اسلايدها را در دماي انكوباتور خشك نموده و براي آشكارسازي باندهاي كروموزومي با استفاده از پروپيديوم آيودايد (PI) رنگ آميزي شدند. مقدار µg/ml پروپيديوم آيودايد را در محل هيبريداسيون روي اسلايدها ريخته و پس از پوشاندن آن با لامل شيشه اي بلند به مدت 10 دقيقه در محل تاريك در دماي اتاق قرار داده شدند. بعد از شستشو با آب دوبار استريل و خشك نمودن اسلايدها، يك قطره از محلول 1:1 PI:آنتي فيد1 را به محل مورد نظر اضافه كرده و بعد از گذاشتن لامل شيشه اي بلند در جعبه تاريك تا زمان بررسي ميكروسكوپي نگهداري شدند.

3-8 بررسي ميكروسكوپي اسلايدها و رديابي سيگنال هاي FITC
در پژوهش حاضر بررسي ميكوسكوپي اسلايدها و رديابي سيگنال هاي FITC و باندها RBPI زير ميكروسكوپ2 انجام شد. پس از جستجوي اسلايدها در محل هيبريداسيون و شناسايي يك متافاز خوب كه داراي الگوي باندينگ و با تفكيك باندهاي قابل قبول بود، با استفاده از فيلتي Texas Red از آن متافاز يك عكس تهيه و مجدداً همان متافاز براي مشاهده وجود سيگنال هاي مورد نظر با استفاده از فيلتر FITC مورد جستجو قرار گرفته و يك عكس نيز با فيلتر FITC از متافاز تهيه شد. بنابراين براي هر متافاز دو عكس (RBPI و FITC) تهيه مي شد كه بعداً با استفاده از نرم افزار فتوشاپ عكس ها روي هم قرار داده مي شدند.

3-9 تعيين محل دقيق (باند كروموزومي) ژن هاي مورد مطالعه روي كروموزوم ها
پس از تهيه عكس هاي RBPI- باندينگ و FITC، تعيين باندهاي كروموزمي محل ژن هاي مورد نظر با استفاده از الگوي استاندارد نامگذاري كروموزوم هاي گاوسانان (CSKBB، 1994؛ یانوزی، 1994 و ISCNDB، 2000) انجام شد.

فصل چهارم

نتايج

4- نتايج
4-1 كيفيت DNA استخراج شده از كلون هاي BAC
پس از استخراج DNA از كلون هاي BAC استفاده شده در پژوهش حاضر براي حصول اطمينان از روند استخراج و محاسبه غلظت نسبي، DNA استخراج شده همراه نشانگر وزن مولكولي (SM0331, Fermentase) و DNA فاژ لامبدا روي ژل آگارز 8/0 درصد الكتروفورز شدند. غلظت نسبي DNA استخراج شده نسبت به DNA فاژ لامبدا سنجيده شد (شکل 4-1).

4-2 نتايج حاصل از كشت سلولي و كاريوتايپ هاي تهيه شده براي گاو، گاو ميش رودخانه اي، گوسفند و بز با روش RBA- باندينگ
پس از انجام كشت سلولي به مدت 72 ساعت با استفاده از روش RB و پس از تهيه اسلايدها (به فصل سوم مراجعه شود)، از بين نمونه هاي كشت شده بهترين متافازها از نظر طول كروموزوم و باندينگ قابل تفكيك آن ها براي تهيه كاريوتايپ مورد استفاده قرار گرفتند.

4-2-1 كاريوتايپ RBA- باندينگ گاو (BTA)
كاريوتايپ گاو به عنوان كاريوتايپ مرجع براي تمامي گونه هاي گاوسانان استفاده مي شود. متافاز و كاريوتايپ تهيه شده براي گاو در پژوهش حاضر در شکل 4-2 نشان داده شد. گاو اهلي گونه اروپايي (Bos taurus) (BTA, 2n=60) داراي 29 جفت آتوزوم آكروسانتريك و كروموزوم هاي X و Y ساب متاسانتريك است (شکل 4-3) (ISCNDB، 2000).

4-2-2 كاريوتايپ RBA- باندينگ گاو ميش رودخانه اي (BBU)
كاريوتايپ تهيه شده براي گاو ميش رودخانه اي در پژوهش حاضر در شکل 4-4 نشان داده شد. در متافاز گاو ميش آسيايي تيپ رودخانه اي (BBU, 2N=50) 24 جفت آتوزوم ديده مي شود كه از بين آن ها پنج جفت اول (كروموزوم هاي 1 تا 5) ساب متاسانتريك و به ترتيب حاصل ترانسلوكاسيون روبرتسوني بين جفت كروموزوم هاي 27/1، 23/2، 19/8، 28/5 و 29/16 گونه هاي اجدادي گاوسانان هستند. كروموزوم هاي X و Y در گاو ميش رودخانه اي آكروسانتريك هستند (شکل 4-5) (CSKBB، 1994؛ یانوزی، 1994 و ISCNDB، 2000).

4-2-3 كاريوتايپ RBA- باندينگ گوسفند (OAR)
گوسفند اهلي (OAR, 2n=54) داراي 26 جفت آتوزوم بوده و جفت هاي 1 تا 3 ساب متاسانتريك و به ترتيب حاصل ترانسلوكاسيون روبرتسوني كروموزوم هاي 3/1، 8/2 و 11/5 گونه هاي اجدادي گاوسانان هستند. كروموزوم X و Y در گوسفند به ترتيب آكروسانتريك و متاسانتريك هستند (شکل 4-6) (ISCNDB، 2000). متافاز و كاريوتايپ تهيه شده براي گوسفند در پژوهش حاضر در شکل 4-7 نشان داده شد.
4-2-4 كاريوتايپ RBA- باندينگ بز (CHI)
كاريوتايپ تهيه شده براي بز در پژوهش حاضر در شکل 4-8 نشان داده شد. كاريوتايپ بز اهلي (CHI, 2n=60) هم از نظر تعداد كروموزوم ها و هم از نظر الگوي باندينگ بسيار شبيه گاو است. تنها تفاوت موجود در متافازهاي اين دو حيوان در مورد آتوزوم هاي 9 و 14 و در مورد كروموزوم هاي جنسي مشاهده مي شود. در متافاز بز يك ناحيه كوچك زير سانترومري از كروموزوم 9 به ناحيه زير سانترومري كروموزوم 14 جابجا شده است. همچنين كروموزوم هاي X و Y در يز برخلاف گاو به ترتيب آكروسانتريك و متاسانتريك هستند (شکل 4-3) (ISCNDB، 2000).

4-3 جايگاه فيزيكي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 با استفاده از تكنيك FISH روي كروموزوم هاي RBPI- باندينگ گونه هاي مورد مطالعه
4-3-1 جايگاه فيزيكي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 در گاو (BTA)
در پژوهش حاضر، ژن هاي بزرگ اثر BMPR1B، BMP15 و GDF9 (موثر بر باروری) برای اولین بار روی متافاز

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد رایگان درباره كلون، BAC، يابي Next Entries پایان نامه ارشد رایگان درباره كروموزوم، BMPR1B،، باندينگ