پایان نامه ارشد رایگان درباره ایمن سازی، گروه کنترل

دانلود پایان نامه ارشد

شد. گوسفندان هو برای این جهش به صورت هموزایگوس حامل بودند اما در گوسفندان هان سه ژنوتیپ BB، B+ و ++ به ترتیب با فراوانی های 33/0، 58/0 و 08/0 مشاهده شدند.
ژو و همکاران (2010)، بیان mRNA ژن های درگیر در مسیر BMP/smad را در گوسفندان نژاد هو چینی با روش RT-PCR بررسی نمودند. یافته ها نشان دادند که تمامی ژن های درگیر در مسیر BMP/smad، GDF9 و گیرنده های نوع یک خانواده TGFβ (TGFβRI) همه در تخمدان بیان می شوند. فزون بر آن، mRNA مربوط به ژن های BMP4، BMPR1B، BMPRII، smad4، GDF9 و TGFβRI نیز در فولیکول های حفره دار حیوانات پر بارور، بیشتر از حیوانات کم بارور بیان می شوند. آن ها پیشنهاد کردند که احتمالاً جهش های ژنتیکی نا شناخته ای در ژن BMPR1B یا سایر ژن ها یا فاکتورهای ناشناخته وجود دارند که باروری را از راه تغییر الگوی بیان ژن های شناخته شده در نرخ تخمک ریزی تحت تاثیر قرار می دهند. پیشنهاد شد که این جهش های ناشناخته احتمالاٌ از راه BMP/smad در ارتباط با مولکول های GDF9 و TGFβRI عمل می کنند.
وو و همکاران (2006)، با استفاده از روش PCR-SSCP و چهار جفت آغازگر اختصاصی، چند شکلی های اگزون شماره دو ژن GDF9 و ارتباط آن را با باروری در بزهای بارور جی نینگ قهوه ای و بزهای کم بارور بوئر، وندنگ شیری و لیائونینگ کشمیری بررسی کردند. نتایج این پژوهش وجود همولوژی 99 درصد را بین توالی اگزون شماره دو گوسفند و بز نشان داد. در این پژوهش فقط محصولات آغازگرهای یک و چهار چند شکلی نشان دادند. در محصول آغازگر شماره یک سه ژنوتیپ AA، AB و BB در همه پنج نژاد مطالعه شده دیده شدند. داده های توالی یابی وجود یک جهش تک نوکلئوتیدی (G26A) را در قطعه مربوطه در بزهای جی نینگ قهوه ای که منجر به جایگزینی اسید آمینه ای نمی شد، نشان داد. فراوانی آلل های A و B به ترتیب 9128/0 و 0872/0 برآورد شدند. مطالعات آماری نشان داد که ماده بزهای AA دارای 54/0 تا 63/0 بزغاله زایی بیشتر از دیگر ژنوتیپ ها هستند. در محصول آغازگر شماره چهار، سه ژنوتیپ CC، CD و DD در پنج نژاد مورد مطالعه مشاهده شدند. داده های توالی یابی وجود یک جهش تک نوکلئوتیدی (G792A) را در این قطعه نشان داد که منجر به جایگزینی یک والین به جای یک ایزولوسین در توالی آمینو اسیدی GDF9 می شد. فراوانی آلل های C و D بترتیب 9266/0 و 0734/0 برآورد شد. در ماده بزهای جی نینگ قهوه ای، افراد CC دارای 57/0 یا 62/0 بزغاله زایی بیشتر نسبت به افراد CD و DD بودند. نتایج آن پژوهش نشان داد که GDF9 یا یک ژن بزرگ اثر در باروری بز های جی نینگ قهوه ای است یا به یک ژن بزرگ اثر در این حیوان متصل می باشد.
چو و همکاران (2007)، ژن BMP15 را به عنوان یک ژن کاندید در باروری بزهای نژاد جی نینگ قهوه ای و چهار نژاد کم بارورتر با استفاده از تکنیک PCR-SSCP با شش جفت آغازگر اختصاصی طراحی شده بر اساس توالی گوسفندی ژن BMP15 به منظور شناسایی چند شکلی های اگزون های 1 و 2 و بررسی ارتباط آن ها با بره زایی مورد مطالعه قرار دادند. در اين پژوهش تنها يكي از آغازگرهي مربوط به اگزون 2 چند شکلی را نشان داد. برای این آغازگر دو ژنوتیپ AA و AB به ترتیب با فراوانی های 1/0 و 9/0 در بزهای بارور جی نینگ قهوه ای و تنها یک ژنوتیپ (AA) در سایر نژادها مشاهده شد. داده های توالی یابی وجود دو جهش تک نوکلئوتیدی (G1050C و G963A) را برای ژنوتیپ AB نشان داد. مطالعات آماری نشان داد که ماده بزهای AB دارای 13/1 بزغاله زایی بیشتر از افراد AA بودند. نتایج این پژوهش، ژن BMP15 را به عنوان یک ژن کاندید یا یک نشانگر متصل به یک ژن کاندید در باروری بزهای جی نینگ قهوه ای معرفی کرد.
کوی و همکاران (2008)، توالی نوکلئوتیدی و مقدار بیان بافتی ژن های FSHB، FSHR، BMP15، BMPR1B و ESR2 را در بزهای چینی یونلینگ سیاه بررسی نمودند. توالی کامل cDNA این ژن ها به ترتیب 390، 2088، 1185، 1509 و 1585 جفت باز برآورد شدند که در مقایسه با بزهای بارور بوئر به ترتیب دارای 99، 99، 99، 100 و 99 درصد یکسانی در توالی نوکلئوتیدی بودند. این بزها همچنین دارای تعداد فولیکول ها و اووسیت های کمتری نسبت به بزهای بوئر بودند. مقدار بیان FSHB، FSHR و BMP15 در بزهای یونلینگ کم بود در حالی که مقدار بیان BMPR1B و ESR2 در آن ها بیشتر بود. همچنین مقدار بیان پروتئین های FSHR، BMP15، BMPR1B و ESR2 در تخمدان و هیپوفیز به طور مثبتی با مقدار بیان mRNA ژنی آن ها ارتباط داشت. همچنین نشان داده شد که مقدار بیان mRNA ژن های FSHB، FSHR و BMP15 با تعداد بزغاله زایی در بزهای یونلینگ ارتباط مثبت دارند.
پولی و همکاران (2009)، ارتباط چند شکلی های ژن های BMP15، GDF9 و FecB را با بزغاله زایی در بزهای بارور سیاه بنگال در هندوستان با تکنیک T-ARMS-PCR بررسی کردند. در این پژوهش چند شکلی فقط در FecB مشاهده شد. آلل جهش یافته (FecBB) و آلل وحشی (FecB+) به ترتیب دارای فراوانی های 57/0 و 43/0 بوده و افراد غیر حامل، حامل هتروزایگوس و حامل هموزایگوس برای جهش فوق به ترتیب دارای 7/2، 04/3 و 11/3 بزغاله در هر زایش بودند. نتایج آن پژوهش نشان داد که BMPR1B می تواند به عنوان یک ژن کاندید احتمالی در باروری بزهای سیاه بنگال بیشتر مورد بررسی قرار گیرد.
چو و همکاران (2010)، با مطالعه ده جفت آغازگر طراحی شده بر اساس توالی ژن FecB گوسفندی، چند شکلی های قسمت های مختلف این ژن را با روش PCR-SSCP در بزهای بارور و کم بارور چینی بررسی کردند. نتایج آن پژوهش نشان داد که محصولات آغازگرهای شماره 8 و 10 که برای ناحیه / 3 ترجمه نشده (3/UTR) طراحی شده بودند، دارای چند شکلی هستند.
یانگ و همکاران (2012) بیان ژن های BMPR1B، BMP15 و GDF9 و توالی کد شونده آن ها را در دو نژاد بز لژی سیاه (با باروری زیاد, 5-3 بزغاله در هر زایش) و تبتی (تک قلو زا) بررسی و مقایسه کردند. آنالیزهای بیان ژن نشان دادند که بیان بافتی mRNA ژن BMP15 در فولیکول بزهای لژی سیاه 72/5 برابر بز تبتی بود. در پژوهش اخیر همچنین دو جهش در ژن GDF9 و 15 جهش در ژن BMPR1B مشاهده شدند که همگی آن ها به غیر از یک جهش در ژن GDF9 با تغییر اسید آمینه در در ساختار پروتئین های مربوطه همراه بودند. نتایج پژوهش اخیر نیز نشان دهنده اثر کلیدی ژن های باروری در تولید مثل بز است.
آن و همكاران (2013) چند شكلي هاي دو ژن GDF9 و GNRH1 را در 641 بز از سه نژاد زينونگ سانن، گونژونگ و بوئر با روش PCR-RFLP بررسي نمودند. در پژوهش اخير به ترتيب يك (g.4093GA كه با جاگزيني آمينو اسيدي در توالي پروتئين همراه بود) و دو (g.3548AG، g.3699GA) در GDF9 و GNRH1 مشاهده شدند. نتايج مطالعات آماري در پژوهش اخير نشان داد كه اثر تركيبي جهش هاي دو ژن روي نرخ بزغاله زايي اثر معني داري دارد به طوريكه ژنوتيپ C5 داراي بيشترين بزغاله زايي در زايش هاي اول، سوم، چهارم و همچنين بيشترين ميانگين بزغاله زايي بوده است. نتايج پژوهش اخير پيشنهاد داد كه GDF9 و GNRH1 مي توانند به عنوان نشانگرهاي ژنتيكي در مطالعات توليد مثلي بز مورد استفاده قرار گيرند.
جانگل و همکاران (2009) در یک آزمایش ایمن سازی علیه GDF9 و BMP15 اثر تنظیمی این ژن ها را بر نرخ تخمک ریزی گاوها بررسی کردند. نتایج پژوهش اخیر افزایش میانگین تخمک ریزی را در پایان دوره ایمن سازی برای GDF9 و BMP15 به ترتیب 7/5 و 1/2 در گروه ایمن شده در مقایسه با گروه کنترل نشان داد. بنابراین مي توان نتيجه گيري نمود كه در گاو نیز مانند گوسفند ژن های اخیر در تنظیم نرخ تخمک ریزی دخالت دارند.
هوسو و همكاران (2008) با مطالعه برون تني نقش هاي BMP15 و GDF9 روي بلوغ، باروري و توسعه رويان هاي گاوي نشان دادند كه BMP15 داراي نقش حياتي در بلوغ سيتوپلاسمي اووسيت ها بوده و توسعه و تكامل رويان ها را در گاو تحت تاثير قرار مي دهد.

فصل سوم

مواد و روش ها

3- مواد و روش ها
3 – 1 تهیه نمونه های خون و کشت سلول های خونی
3 – 1- 1 تهیه ی نمونه های خون
نمونه های خون برای هر چهار گونه مورد مطالعه در این پژوهش به مقدار 8-15 میلی لیتر از راه سرخرگ وداجی اخذ شدند ودر لوله های آغشته به هپارین به آز مایشگاه سیتوژنتیک دامی ونقشه یابی ژن ها منتقل شدند. برای جمع آوری نمونه های خون مورد استفاده در سیتوژنتیک ( کشت سلولی و … ) حتما باید از هپارین به عنوان ماده ضد انعقاد خون استفاده شود زیرا EDTA باعث ایجاد مشکل در روند کشت سلولی می شود. نمونه های خون برای گاو، گوسفند، بز و گاو میش تیپ رودخانه ای به ترتیب از نژادهای ایتالیایی Agerolese، Laticauda، Cilentana و گاوميش ايتاليايي تيپ رودخانه اي از طريق سياهرگ وداجي اخذ شدند. هنگام خونگیری باید دقت داشت که حیوان وارد شوک یا استرس نشود زیرا احتمالا استرس وارده به حیوان با ترشح برخی فاکتورها در خون همراه خواهد شد که در روند کشت سلولی مشکل ایجاد خواهد کرد.

3 – 1- 2 کشت سلول های خونی با روش RB و انتخاب اسلاید های مناسب برای FISH
به علت راحتی کشت و کار کردن و هم چنین شاخص متافازی بالا غالباً از لنفوسیت های خون برای کشت در اکثر آزمایشگاه ها برای FISH استفاده می شود. در پژوهش حاضر از روشRB با وضوح بالا برای کشت سلول های خونی استفاده شد (در این روش حرف لاتین R نشان دهنده کلمه Reverse می باشد و به معنی توليد باندهاي كروموزومي معكوس نسبت به روش G-باندينگ است) که با وارد سازی دیر هنگام برومودی یوراسیل (BrdU) و Hoechst33258 به محیط کشت همراه است (به فصل دوم بخش 2-6-3 مراجعه شود). مواد استفاده شده در كشت سلولي براي هر كدام از گونه هاي مورد مطالعه در جدول 3-1 آورده شده اند. پس از تهيه مخلوط كشت زير هود استريل، فلاسك هاي حاوي محيط هاي كشت به مدت 72 ساعت در دمای 5/37 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. برای خارج سازی CO2 حاصل شده از روند کشت سلول ها هر روز یک بار با باز و بسته كردن درب فلاسک ها گاز جمع شده در فلاسك را خارج نموديم. براي هر گونه حداقل 20 كشت در هر آزمايش انجام مي شد. زمان اضافه کردن BrdU ، Hoechst 33258 به محیط کشت به ترتیب برای گاو، گاومیش، گوسفند و بز به 6، 6، 5/5 و 6 ساعت قبل از اتمام کشت بود. در پژوهش حاضر از کونکاناوالین-A به عنوان عامل ميتوژن استفاده شد. سایر میتوژن ها از جمله لکتین برای خوک، اسب، میمون، و سگ مناسب هستند. کلسمید یک ساعت قبل از پایان کشت به محیط کشت گاو، گاومیش و بز و50 دقیقه قبل از پايان كشت به محیط کشت گوسفند اضافه شد.
يك ساعت قبل از اتمام كشت، محلول هیپوتونیک (KCL 075/0 مولار) را تهیه نموده و در انکوباتور 5/37 درجه سانتی گراد قرار دادیم. بعد از 72 ساعت، نمونه هاي خون از انکوباتور خارج نموده و به لوله های سانتریفیوژ انتقال داده شدند. مراحل تيمار هيپوتونيك و فيكساتيو و تهيه اسلايدهاي متافازي با توجه به روش يانوزي و دي براردينو (2008) انجام شد. پس از تهيه اسلايدها، تراكم سلول هاي كشت شده و شاخص ميتوزي زير ميكروسكوپ فاز كنتراست بررسي شدند. براي انتخاب يك اسلايد متافازي خوب براي FISH بايد در يك محدوده 2 سانتي متر مربع روي اسلايد حداقل 20-15 متافاز با گستردگي خوب و اندازه كروموزومي متوسط وجود داشته باشد. اگر در محدوده مورد نظر براي FISH تعداد زيادي (بيش از 20 عدد) متافاز وجود داشته باشد براي ورود پروب ها به متافازها دچار مشكل خواهيم شد. علاوه بر اين، بايد سلول هاي سطح اسلايد نيز از اندازه كافي برخوردار باشند كه نشان دهنده رشد خوب سلول ها در فرآيند كشت است. پس از شناسايي و انتخاب اسلايد مناسب براي هر حيوان، يك كلون BAC حاوي يكي از ژن هاي مورد مطالعه را براي آن اسلايد در نظر گرفته و نام BAC مورد نظر در كنار اسلايد يادداشت شد. اسلايدها تا زمان استفاده در FISH در فريزر نگهداري شدند.

3-2 انتخاب و سفارش كلون هاي BAC
در تكنيك هاي هيبريداسيون در محل (ISH) غير راديواكتيو از پروب هاي DNA با قطعات بزرگ استفاده مي شود. امكان تهيه نقشه

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد رایگان درباره مکان یابی Next Entries پایان نامه ارشد رایگان درباره كلون، BAC، يابي