پایان نامه ارشد درمورد تجزیه واریانس، تحلیل داده، فیزیولوژی

ج نشان داد که مقدار بالاي مس محتواي آنزيمهاي پراكسيداز و كاتالاز را در هر دو رقم، در ريشهها و برگها افزايش داد. اين افزايش در رقم آلستار بيش از رقم يوروفلور بود. ساليسيليك اسيد سطح آنزيمهاي پراكسيداز و كاتالاز را بهطور معنيداري افزايش داد. تحت تنش مس تجمع آنزيمهاي پراكسيداز و كاتالاز در ريشهها بيشتر از برگها مشاهده شد. استفاده از ساليسيليك اسيد فعاليت آنزيمهاي كاتالاز و پراكسيداز را افزايش داد. در آزمایشی Afzal et al. (2006) اثرات پرایمینگ‌های مختلف شامل هیدروپرایمینگ، هالوپرایمینگ و آسکوربات پرایمینگ روی تحمل به شوری، جوانه‌زنی بذر، آنتی اکسیدانها و محتویات کلی پروتئین در دو کولتیوار گندم شامل Aquab-2000 (متحمل به شوری) و MH7 (حساس به شوری) تحت شرایط شوری 15 دسی‌زیمنس بر متر و بدون شوری 4 دسی‌زیمنس بر متر ارزیابی کردند. نتایج نشان داد هالوپرایمینگ و هیدروپرایمینگ بیشترین تأثیر را روی اثرات مضر شوری داشتند. اثر آسکوربات پرایمینگ در کولتیوار متحمل به شوری بیشتر بود و باعث کاهش زمان واقعی جوانه‌زنی، بهبود ویگور گیاهچه و هم‌چنین باعث افزایش محتویات آسکوربات و فعالیت کاتالاز، پراکسیداز و سوپر اکساید دسموتاز شد. در پایان هالوپرایمینگ و هیدروپرایمینگ باعث توسعه بذرها در هر دو کولتیوار شد، در حالیکه آسکوربات پرایمینگ فقط در کولتیوارهای متحمل به شوری مؤثر بود. محققین بذرهای دو واریته از یونجه شامل Victoria و Golden empress تحت تأثیر Sand priming قرار دادند و اثرات آن را روی جوانه‌زنی و تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در سطوح بالای استرس شوری بررسی کردند. نتایج حاصله نشان داد درصد جوانه‌زنی، شاخص جوانه‌زنی و شاخص ویگور بعد از پرایمینگ بصورت قابل توجهی در هر دو واریته نسبت به شاهد افزایش پیدا کرد. تیمار بذرها وزن خشک ریشه را تحت شرایط شوری افزایش داد و باعث افزایش قابل توجه در فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دسموتاز و کاهش ذخیره MDA و هم‌چنین باعث افزایش تحمل به شوری و بهبود جوانه‌زنی و رشد گیاه یونجه شد (Xiujuan & Jin, 2004).

فصل سوم
مواد و روشها

3-1- ویژگیهای محل انجام آزمایش و زمان اجرای طرح تحقیقاتی
اين مطالعه بهمنظور بررسی اثرات پرایمینگ بذر به وسیله سالیسیلیک اسید و نیترات پتاسیم بر شاخصهای جوانه‌زنی و بیوشیمیایی بذر گیاه دارویی ماریتیغال تحت شرایط تنش شوری در محیط آزمایشی در آذرماه سال 1391 در آزمایشگاه بیوشیمی دانشگاه خوارزمی تهران صورت پذیرفت.
3-2- طرح آزمایشی و روش کار
آزمایش بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار اجرا شد.
فاکتور اول مقادیر مختلف تنش شوری ناشی از کلرید سدیم شامل:
a1) صفر (آب مقطر) a2) 150 میلی‌مولار a3) 250 میلی‌مولار
فاکتور دوم مقادیر مختلف سالیسیلیک اسید شامل:
b1) صفر b2) 200 میلی‌گرم در لیتر b3) 400 میلی‌گرم در لیتر
فاکتور سوم مقادیر مختلف نیترات پتاسیم شامل:
c1) صفر c2) 25/0 مول بر لیتر c3) 35/0 مول بر لیتر
برای هر تیمار در هر تکرار تعداد 20 بذر در پتریدیش‌های ضدعفونی شده قرار داده شدند، سپس پتریدیش‌ها به ژرمیناتور با دمای 1±25 درجه سانتیگراد انتقال یافتند و به مدت 10 روز بذور جوانه‌زده در هر روز شمارش گردیدند.
در روزهای سوم و پنجم میزان فعالیت آنزیم آلفا-آمیلاز و هورمون جیبرلین بذور و در روزهای هشتم و دهم میزان پروتئین کل گیاهچه محاسبه شدند.
3-3- ضدعفونی بذور و وسایل کار
ابتدا بذور ماریتیغال در محلول هیپوکلریت سدیم 5 درصد به مدت 2 دقیقه ضدعفونی شدند. سپس در داخل پتریدیش‌های 10 سانتیمتری استریل شده، کاغذ واتمن شماره 1 قرار داده شد. در انتها بذور بر روی کاغذ واتمن قرار گرفته شدند و پس از بسته شدن درب پتری‌دیش‌ها، درون ژرمیناتور قرار داده شدند.
3-4- نحوه پرایم بذور
برای پرایمکردن بذور، محلولهای مورد نظر با توجه به تیمارها و غلظتهای معین شده، ساخته شدند. سپس 20 عدد بذر به مدت 24 ساعت درون محلولهای پرایمینگ قرار گرفتند و بعد از 24 ساعت بذور از محلولها خارج و پس از خشکشدن به پتریدیش‌ها منتقل شدند. برای تیمار شاهد از آب مقطر به میزان 10 میلیلیتر استفاده شد و برای اعمال تنش شوری از کلریدسدیم با غلظتهای مشخص شده به میزان 10 میلیلیتر در پتریدیش‌های مربوط به تیمارهای شوری استفاده شد. در نهایت درب پتریدیش‌ها بسته شد و در داخل اتاقک رشد در دمای °C1±25 به مدت 10 روز قرار گرفتند. در هر روز تعداد بذور جوانه زده شمارش شد و در روز آخر صفتهای جوانه‌زنی محاسبه شدند.
3-5- محاسبه پارامترهای جوانه‌زنی
در پایان (روز دهم) صفتهای زیر محاسبه شدند :
3-5-1- درصد جوانه‌زنی
100 × (تعداد كل بذور/تعداد بذور جوانه‌زده تا روزi ) = درصد جوانه‌زني
3-5-2- سرعت جوانه‌زنی
روز آخر/ بذور جوانه‌زده در روز آخر +…+ روز 1 / بذور جوانه‌زده در روز 1 = سرعت جوانه‌زنی
3-5-3- شاخص بنیه بذر
% GR G MSH / 100 = بنیه بذر
که در این رابطه: % GR = درصد جوانه‌زني، MSH= میانگین طول گياهچه
3-5-4- طول گیاهچه
طول گیاهچه با استفاده از خطکش میلیمتری محاسبه گردید و بر اساس واحد میلیمتر گزارش گردید. برای هر گروه تیماری سه تکرار محاسبه و میانگین بر اساس واحد میلیمتر گزارش گردید.
3-5-5- وزنتر و خشک گیاهچه
بدین منظور از ترازوی دیجیتال sartorious مدل BPSIID با دقت وزن 0001/0 گرم استفاده شد، سپس نمونهها به مدت 48 ساعت در درون آون با دمای 72 درجه سانتیگراد قرار داده شدند و در نهایت وزن خشک نمونه‌ها اندازه‌گیری شد.
3-6- محاسبه صفات بیوشیمیایی
3-6-1- روش تهیه عصاره آنزیمی
یک گرم از بافت گیاه را درون هاون که از روز قبل در یخچال قرار گرفته بود گذاشته شد. سپس 5 میلیلیتر محلول استخراج به آن اضافه گردید و به خوبی به مدت 10 دقیقه سابیده شدند تا یک محلول هموژن حاصل شد. عصاره حاصل به مدت 24 ساعت درون بوراکس (دی سدیم تترابورات)، 2 گرم Na2EDTA و 50 گرم PEG 2000 با هم مخلوط شدند و با آب مقطر به حجم 100 میلیلیتر رسانده شد و در یخچال با دمای 4 درجه قرار گرفت. بعد از 24 ساعت عصاره به مدت 5 دقیقه درون سانتریفیوژ 6000 دور گذاشته شد.
3-6-2- سنجش آنزیم آلفا آمیلاز
بر اساس متد کالریمتری Bergmayer انجام شد. نیم میلیلیتر سوبسترا (نشاسته سوکسینیل شده) با محلول حاوی فسفات سدیم (10 میلیمول)، سدیمکلرید (3 میلیمول)، با “پی اچ” 5/5 در 25 درجه سانتیگراد انکوبه شد. در پایان زمان استاندارد واکنش با اضافهکردن ماده رنگ‌زا 3و5- دی نیترو سالسیلیک اسید (10mg/ml) در محلول هیدروکسید سدیم (4 میلمول) دارای سدیم پتاسیم تارتارات (3/0 g/ml) کامل شده و پس از قرار گرفتن در آب جوش متوقف شد. جذب آن در 546 نانومتر قرائت و بر اساس منحنی استاندارد، مقدار فعالیت آنزیم ارزیابی گرفت.
3-6-3- سنجش فعالیت هورمون جیبرلین
بدین منظور از دستگاهHPLC مدل UniCam استفاده شد و با روش ایزوکرانیک جداسازی صورت پذیرفت.
3-6-4- سنجش پروتئین
بدین منظور از روش کجلدال استفاده شد. طی آن پودر نمونه گیاهی در اسید سولفوریک غلیظ در حضور کاتالیست حاوی یون مس جوشانده شد تا ازت بصورت آمونیاک در آید. آمونیاک حاصله به وسیله اسید بوریک جذب شد. یونهای آمونیوم با اسید کلریدریک و سپس محلول سود تیتر شدند. به ازای هر یک مول اسید کلریدریک مصرفی 14 گرم نیتروژن در بافت اولیه وجود داشت. با استفاده از ضریب 25/6 میزان پروتئین قابل سنجش شد.
3-7- آنالیز دادهها
پس از پایان آزمایشات، آنالیز دادهها با استفاده از نرم‌افزار آماری SAS (Version 9.1) و مقایسه میانگینها به روش آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد. رسم نمودارها با استفاده از نرم‌افزار Excel صورت گرفت.
فصل چهارم
تجزیه
و
تحلیل داده‌ها

4-1- درصد جوانه‌زنی
جدول تجزیه واریانس درصد جوانه‌زنی (جدول 4-1) نشان می‌دهد که اثر اصلی شوری و اثر متقابل شوری با سالیسیلیک اسید و نیترات پتاسیم در سطح احتمال 1 درصد معنیدار شده است، هم‌چنین اثر اصلی سالیسیلیک اسید در سطح احتمال 5 درصد معنیدار شده است ولی در اثر اصلی نیترات پتاسیم و اثرات متقابل شوری در سالیسیلیک اسید، شوری در نیترات پتاسیم و سالیسیلیک اسید در نیترات پتاسیم اختلاف معنیداری مشاهده نگردید.
مقایسه میانگین درصد جوانه‌زنی تحت تأثیر سطوح فاکتور شوری در (جدول 4-3) و (نمودار 4-1) نشان می‌دهد که با افزایش شوری شاهد کاهش درصد جوانه‌زنی هستیم بهطوری که بالاترین درصد جوانه‌زنی به میزان 22/87 درصد مربوط به شاهد و کم‌ترین درصد جوانه‌زنی به میزان 41/12 درصد مربوط به شوری 250 میلیمولار می‌باشد.
مقایسه میانگین درصد جوانه‌زنی تحت تأثیر سطوح فاکتور سالیسیلیک اسید در (جدول 4-5) و (نمودار 4-2) نشان می‌دهد که با افزایش سالیسیلیک اسید درصد جوانه‌زنی نسبت به سطح شاهد افزایش پیدا می‌کند. البته بین سطح دوم و سوم سالیسیلیک اسید اختلاف معنیداری وجود ندارد. سطوح 200 و 400 میلیگرم در لیتر سالیسیلیک اسید به ترتیب دارای 41/47 و 74/45 درصد جوانه‌زنی هستند و کم‌ترین درصد جوانه‌زنی به میزان 63/39 درصد مربوط به شاهد می‌باشد.
مقایسه میانگین درصد جوانه‌زنی تحت تأثیر سطوح فاکتور نیترات پتاسیم در (جدول 4-7) و (نمودار 4-3) بیانگر این است که بین سطوح مختلف نیترات پتاسیم تفاوت معنیداری وجود ندارد و درصد جوانه‌زنی بین سطوح مختلف از نطر آماری تفاوتی با یکدیگر ندارند.
مقایسه میانگین درصد جوانه‌زنی تحت تأثیر سطوح مختلف شوری و سالیسیلیک اسید در (جدول 4-9) و (نمودار 4-4) نشان می‌دهد که بیشترین میزان درصد جوانه‌زنی مربوط به شوری صفر میلیمولار و سالیسیلیک اسید 400 میلیگرم در لیتر به میزان 100 درصد و کم‌ترین میزان درصد جوانه‌زنی مربوط به شوری 250 میلیمولار و عدم مصرف سالیسیلیک اسید و مصرف 200 و 400 میلیگرم در لیتر سالیسیلیک اسید به میزان 10، 33/13 و 15درصد می‌باشد. مشاهده می‌شود در شرایط عدم حضور شوری مصرف سالیسیلیک اسید بر درصد جوانه‌زنی مؤثر می‌باشد و در سطح سوم شوری این عامل چندان مؤثر و تأثیر گذار نمی باشد و تأثیری بر روی جوانه‌زنی ندارد.
مقایسه میانگین درصد جوانه‌زنی تحت تأثیر سطوح مختلف شوری و نیترات پتاسیم در (جدول 4-11) و (نمودار 4-5) نشان می‌دهد که بیشترین درصد جوانه‌زنی به میزان 90 درصد مربوط به شوری صفر میلیمولار و نیترات پتاسیم 25/0 مول بر لیتر و کم‌ترین درصد جوانه‌زنی به میزان 33/3 درصد مربوط به شوری 250 میلیمولار و نیترات پتاسیم 35/0 مول بر لیتر است. مشاهده می‌شود در شرایط عدم حضور شوری پرایم بذر با نیترات پتاسیم، بر روی درصد جوانه‌زنی اثر منفی دارد و با افزایش شوری محیط تأثیر منفی این عامل کاهش می‌یابد.
مقایسه میانگین درصد جوانه‌زنی تحت تأثیر سطوح مختلف سالیسیلیک اسید و نیترات پتاسیم (جدول 4-13) و (نمودار 4-6) نشان می‌دهد که بیشترین درصد جوانه‌زنی به میزان 100 درصد مربوط به سالیسیلیک اسید 400 میلیگرم در لیتر و عدم مصرف نیترات پتاسیم و کم‌ترین درصد جوانه‌زنی به میزان 33/68 درصد مربوط به صفر میلیگرم در لیتر سالیسیلیک است با 35/0 مول بر لیتر نیترات پتاسیم است.
مقایسه میانگین درصد جوانه‌زنی تحت تأثیر سطوح مختلف شوری، سالیسیلیک اسید و نیترات پتاسیم در (جدول 4-15) نشان می‌دهد که بیشترین درصد جوانه‌زنی به ترتیب مربوط به 400 میلیگرم در لیتر سالیسیلیک اسید با عدم مصرف نیترات پتاسیم و 200 میلیگرم در لیتر سالیسیلیک اسید با 25/0 مول بر لیتر نیترات پتاسیم و عدم مصرف نیترات پتاسیم به مقدار 100، 33/98 و 95 درصد و هم‌چنین کم‌ترین درصد جوانه‌زنی به میزان 33/3 درصد مربوط به شوری 250 میلیمولار، عدم مصرف سالیسیلیک اسید و نیترات پتاسیم 35/0 مول بر لیتر