پایان نامه ارشد درباره پلاسمیدهای، کلونهای، (B)، ژلآگارز

دانلود پایان نامه ارشد

د غیرنوترکیب مقایسه شدند (شکل3-18) و پلاسمیدهای که وزن ملکولی بیشتری نسبت به کنترل داشتند به عنوان کلنیهای مثبت برای غربالگریهای بیشتر انتخاب شدند.

شکل 3-18. الکتروفورز DNA پلاسمید pBR322 و کلونهای نوترکیب بر روی ژل آگارز یک درصد. چاهک اول در سمت چپ در هر دو ژل پلاسمید برش نیافته pBR322 میباشد و چاهکهای بعدی در ژل اول از سمت چپ، کلونهای نوترکیب حاوی ژن cstH::cbm و در ژل دوم کلونهای نوترکیب cstH::cbβm برش نیافته میباشد (نام دقیق pEYSm1 ، pEYScbm1 و نام دقیق pEYSmb1 ،pEYScbβm1).
2-1-2-2-3 غربالگری با PCR
کلنیهای نوترکیب انتخاب شده ابتدا با استفاده از آغازگر پیشرو (CS3-FF) ومعکوس ((CS3-RR PCR شدند و محصول این مرحله از PCR روی ژلآگارز یک درصد الکتروفورز گردید (شکل 3-19) سپس نمونههای مثبت جهشیافته دارنده ژن موتیف (cstH::cbm) با آغازگرهای داخل(-R ) و ابتدای ژن (CS3-FF) و ژن بتا موتیف(cstH::cbβm) با آغازگرهای داخل(-F) و انتهای ژن ) (CS3-RR بررسی شدند. محصول PCR این مرحله نیز روی ژلآگارز یک درصد الکتروفورز گردید و باندهای حاصل با اندازههای مورد انتظار مقایسهشدند که نتیجه نشاندهنده صحت اندازه باندها میباشد.

(A)

(B)

شکل 3- 19.الکتروفورز محصولات PCR کلونهای نوترکيب. (A) الکتروفورز محصول واکنش PCR با آغازگرهای ابتدا و انتهای ژن روی ژلآگارز یک درصد.ردیف بالا نام نمونه و ردیف پایین اندازه آنرا نشان میدهد. به علت کمبود فضا حروف pEYS ازابتدای نام نمونه ها حذف شده است بدین معنی که نام کامل نمونه 38m1، pEYS38cbm1 و نام کامل نمونه 38cbβm1، pEYS38cbβm1 میباشد (به شکل 3-17 پلاسمید رجوع شود). از مارکر DNA 100bp فرمنتاز استفاده شد. (B) الکتروفورز محصول واکنش PCR. سمت چپ با آغازگر داخلی (-R) و آغازگر ابتدای ژن، سمت راست، آغازگر داخلی (-F) و آغازگر انتهای ژن . دراین ژل از مارکر DNA 1kb فرمنتاز استفاده شد. سیستم نامگذاری در شکل (B) مشابه شکل (A) می¬باشد.

3-1-2-2-3 برش آنزیمی
به جهت اینکه در غربالگری با روش PCR آغازگرهای وکتور در دسترس نبود و از طرف دیگربه جهت اینکه جایگاه برش آنزیمی E.coRV صاف یا بلانت می¬باشد و انتهای محصولات حاصل از PCR با آنزیمPfu نیزصاف می¬باشد لذا قطعه کلون شده در جایگاه برش آنزیمی E.coRV وکتور pBR322 ممکن است در دو جهت مختلف صورت گیرد که فقط کلونینگ در یکی از این جهت برای ادامه کار مطلوب بود. از اینرو تعیین جهت DNA ورودی در اینجا بسیار ضروری می¬باشد.
پلاسميدهای نوترکيب مثبت حاصل از مراحل غربالگری پس از استخراج با کیت استخراج DNA، تحت برش آنزيمی دو آنزيم BamH1 و Aoc1 قرار گرفتند و روی ژل آگارز الکتروفورز باندهای حاصل از برش بررسی شدند. نمونههایی که دو باند 396 و 4745 ویا 396 و 4703 روی ژل نشاندادند به عنوان کلنیهای با جهت صحیح برای بررسی مرحله بعدی انتخاب شدند(شکل 3-20).

شکل 3-20. الکتروفورز محصول برش آنزیمی DNA نوترکیب با آنزیم های AocIو. BamH1 نمونههای که باند 396 به همراه باند حدود 4700 را نشان دادند به عنوان کلنی های دارنده ژن جهش یافته در جهت مناسب، برای ادامهکار انتخاب شدند. سیستم نامگذاری نیز در اینجا همانند شکلهای پیشین میباشد. در ژل سمت چپ از مارکر وزن ملکولی 100bp و در ژل سمت راست از مارکر وزن ملکولی 1Kbاستفاده شدهاست . (وضوح باند پایینی در پرینت برخی از شکل ها ممکن است چندان مطلوب نباشد ولی بوضوح در فایل کامپیوتری قابل روئیت است)

4-1-2-2-3 تعیین توالی ژنهایCstH::cbm وCstH::cbβm در کلونهای نوترکیب
پس از تائید های اولیه مانند واکنش PCRو برش آنزیمی معمولا تعیین توالی به عنوان مرحله نهایی تأئید انجام می گیرد. جهت تایید نهایی صحت سازههایcstH::cbm وcstH::cbβm (در جایگاه های مختلف ژن cstH) از تعیین توالی ژن کلون شده استفاده گردید. بدین منظور باکتری های حاوی پلاسمید نوترکیب کشت داده شد سپس DNA پلاسمیدهای نوترکیب به کمک کیت (High pure plasmid Isolation Kit) استخراج و با روش Dideoxy Termination تعیین توالی شدند. پس از تعیین ترادف، توالیهای فوق با استفاده از نرمافزار Chromas مورد بررسی قرار گرفتند و صحت توالی ژنهای هیبرید تائیدشد. نتایج حاصل از تعیین توالی ژنهای هیبرید در پلاسمیدهای نوترکیبpEYS38cbm1, pEYS79cbm1 ,pEYS66cbm1, pEYS66cbβm1, pEYS92cbβm1 pEYS92cbm1, pEYS79cbβm1, pEYS38cbβm1, pEYS107cbm1, pEYS107cbm1 در پیوست هفت آورده شده است.

3-2-3 کلونینگ ژنهایcstH::cbm و cstH::cbβm در اپرون cst
جهت بیان و ارائه موتیفهای اتصالی به کادمیوم در سطح باکتریE .coli می¬بایست ژنهایcstH::Cbm و cstH::Cbβm در اپرون کامل کدکننده پیلی CS3 قرار گیرند. شکل شماتیک 3-21 مراحل و نحوه کلونینگ ژنهای هیبریدcstH::cbm و cstH::cbβm در اپرون پیلی را نشان میدهد. برای انجام مراحل کلونیگ ترسیم شده در شکل 3-21، ابتدا باکتری دارای پلاسمید pPM4567 حاوی اپرون کامل پیلی Cs3 در محیط LB حاوی کلرامفنیکل کشت دادهشد و DNA پلاسمید آن توسط کیت استخراج پلاسمید، استخراج گردید. سپس DNA پلاسمیدی ابتدا با آنزیم AocI بریده شد و پس از حصول اطمینان از برش آن که از طریق الکتروفورز بر روی ژلآگارز حاصل شد، محصول برش آنزیمی فوق از روی ژلآگارز بازیافت شده وتوسط آنزیم BamH1 نیز بریدهشد. با برش توسط این دو آنزیم، اپرون پیلی بدون زیرواحد CstH جدا میگردد که اندازه تقریبی آن 43000bp می¬باشد. محصول برش آنزیمی بر روی ژلآگارز یک درصد الکتروفورز گردید، همانطور که در شکل 3-22 مشاهده میشود در اثر برش آنزیمهای BamH1 و AocI بر روی پلاسمید pPM4567 سه قطعه 2200~ ، 1700~ و 4295 ایجاد میشود که قطعه 4295 حاوی اپرون از روی ژل جدا و خالص شد. سپس کلونهای حاوی پلاسمیدهای نوترکیبpEYS38cbm1 ,pEYS79cbm1) ,pEYS66cbm1 ,pEYS66cbβm1 ,pEYS92cbβm1 ,pEYS92cbm1 ,pEYS79cbβm1 , pEYS38cbβm1, pEYS107cbm1 ,pEYS107cbm1) هریک بطور جداگانه در محیط L.B حاوی آمپیسیلین کشت دادهشد و پس از استخراج پلاسمید آن، توسط دو آنزیم AocI و BamHI بریدهشد. با این برش قطعهای با طولbp 396 خارج میگردد و قطعه بزرگتر برای مرحله بعد از ژل جدا و خالص شد(شکل3-22). پس از خالص سازی DNA از ژلآگارز، اپرون پیلی (قطعه 4Kb) حاصل از برش آنزیمهای AocI و BamHI پلاسمید pPM4567 (شکل3-22) به کمک آنزیم T4 DNA ligase به جایگاه AocI و BamHI پلاسمیدهای فوق متصل شد. محصول اتصال (Ligation) به داخل باکتری مستعدE. coli سویه DH5α منتقل شد. پلاسمید نوترکیب جدید به ترتیب pEYScbm2 و pEYScbβm2 نامگذاری گردید.

شکل3- 21. شکل شماتیک کلونینگ ژن هیبرید cstH::cbm و cstH::cbbm در اپرون پیلی CS3.

شکل3-22. برش آنزیمی پلاسمید pPM4567 و پلاسمیدهای نوترکیب. برش آنزیمی DNA پلاسمید pPM4567 (حامل اپرون کامل cst) و پلاسمیدهای pEYSm1 و pEYSbm1 (نام دقیق,pEYSm1 pEYScbm1 و نام دقیق pEYSbm1 pEYScbβm1, میباشد) (حامل ژنهای جهشیافته به ترتیب cstH::cbm و cstH::cbβm) با دو آنزیم BamH1 و AocI و الکتروفورز آن بر روی ژلآگارز یک درصد. باندهای مشخص شده باندهای بودند که از روی ژل بازیافت شدند. از مارکر DNA100bp استفاده شد.

1-3-2-3 غربال کردن کلون های حاوی اپرون هیبرید cst::cbm و cst::cbbm
باکتریهای دریافت کننده محصول واکنش اتصال حاوی پلاسمید نوترکیب در محیط LB حاوی آمپیسیلین کشت داده شد. DNA پلاسمیدی به روش لیز قلیایی استخراج گردید و همراه با پلاسمیدهای فاقد پیلی (کنترل) بر روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز گردید. DNAپلاسمیدی کلونهای نوترکیب که قطعه DNA ژنهای کمکی اپرون cst را دریافت کرده بودند، وزن ملکولی بالاتری نسبت به DNA حاوی پلاسمید pEYScbm1 و pEYScbβm1 داشتند (شکل 3-23).

(A)

(B)
شکل 3-23 . الکتروفورز DNA پلاسمید های نوترکیب pEYScbm2 و pEYScbβm2 (حامل ژنهای هیبرید cstH::cbm و cstH::cbβm) روی ژل آگارز یک درصد.(A) چاهک های ستاره دار پلاسمید pEYScbm1 میباشند و به عنوان کنترل استفاده شدند، بقیه چاهک ها نمونه های دارنده اپرون نوترکیب می¬باشند. (B) چاهک های ستاره دار پلاسمید pEYScbβm1 می¬باشند و به عنوان کنترل استفاده شدند، بقیه چاهک ها نمونه های دارنده اپرون نوترکیب می¬باشند.

1-1-3-2-3 تائید صحت کلونینگ با برش آنزیمی
برای تائید کلونینگ، DNA پلاسمیدهای نوترکیب(pEYScbm2 و pEYScbβm2) که وزن ملکولی بالاتری نسبت به کنترل داشتند با آنزیم HindIII بریدهشدند. در اثر برش با آنزیم HindIII دو قطعه با وزن ملکولی حدود 5/4 و 3/5 کیلوباز ایجاد میگردد(شکل 3-24). نتایج فوق با توجه به مارکر وزن ملکولی و مقایسه با پلاسمیدهای pEYScbm1 و pEYScbβm1 صحت کلونینگ را تائیدکرد.

(A)

(B)

شکل3-24. الکتروفورز برش آنزیمی DNA پلاسمیدهای حامل اپرون نوترکیب با آنزیم HindIII بر روی ژل آگارز یک درصد. (A) چاهک مشخص شده با ستاره پلاسمید کنترل (pEYScbm1) حامل ژن cstH و سایر چاهک ها پلاسمیدهای(pEYScbm2) حامل اپرون نوترکیب می¬باشند. (B) چاهک مشخصشده با ستاره پلاسمید کنترل(pEYScbβm1) حامل ژن cstH و سایر چاهک ها پلاسمیدهای(pEYScbβm2) حامل اپرون نوترکیب می¬باشند. برای هر دو ژل از مارکر 1Kb DNA استفاده شد.
2-1-3-2-3 تائید کلونیگ با PCR
کلنی های نوترکیب انتخاب شده از مرحله اول غربالگری با استفاده از آغازگرهای ابتدا ( cs3-FF) و انتهای ( cs3-RR) ژن و یکی از سه آغازگر داخلی (-R, -F1 ویا –F2) مربوط به موتیف و یا بتاموتیف جهت جستجوی حضور DNA اتصالی به کادمیوم مورد بررسی قرار گرفتند و نمونه های مثبت جهت ادامه بررسی انتخاب شدند(شکل3-25).

(A)

(B)

(C)

شکل 3-25. الکتروفورز محصول واکنش PCR کلونهای نوترکیب حامل کل اپرون بر روی ژلآگارز یک درصد. ( A) با استفاده از آغازگرهای ابتدا ( cs3-FF) و انتهای ( cs3-RR) ژن cstH (B وC) آغازگر ابتدا یا انتهای ژن و یکی از سه آغازگر داخلی (-R, -F1 ویا –F2). محصول PCR پرایمرهای cs3FF و cs3 – F1با شماره 1 ، cs3RR و cs3 – Rبا شماره 2 و محصول cs3RR & cs3 – F2 با شماره 3 نامگذاری شدهاست (نام دقیق,pEYSm1 pEYScbm1 و نام دقیق pEYSbm1 pEYScbβm1, میباشد).

4-2-3 بررسی بیان پیلیهای هیبرید CS3::Cbβm و CS3::Cbm توسط روشهای داتبلاتینگ باکتری و وسترن پروتئین
یکی از روشهای مرسوم برای نشاندادن بیان یک پروتئین ردیابی آن پروتیئن با آنتیبادی علیه آن میباشد. در این تحقیق بعلت اینکه پپتید متصلشونده به کادمیوم براساس توالی آن طی واکنش PCR وارد پیلی شده و آنتیبادی علیه پپتیدهای وارد شده عملا در دسترس نبود لذا برای اثبات بیان پیلی از آنتیبادی بر ضد CS3 استفاده شد. بدین منظور آنتیبادی های ناخالص موجود علیه CS3 با پروتیئن های سطحی باکتریِDH5α E. coli جذب شدند و از آن جهت نشاندادن بیان پیلیهای هیبرید استفادهشد.
تاثیر احتمالی ورود پپتید خارجی (پپتیدهای اتصالی به فلز سنگین) بر بیان پیلی هیبرید روی سطح باکتری توسط روشهای داتبلات باکتری، وسترنبلات با استفاده از آنتیبادی بر علیه پیلی CS3 مورد مطالعه و بررسی قرارگرفت.
1-4-2-3 دات بلاتینگ باکتری
برای بررسی بیان و تشکیل پلی هیبرید Cs3 روی سطح باکتری با کمک تکینک داتبلات ، کلونهای pEYScbm2 و pEYScbβm2 به همراه باکتریهای کنترل (باکتری دارنده پلاسمید pPM4567 حامل اپرون کامل پیلی و باکتری میزبان بدون پلاسمید) در محیط CFA بترتیب حاوی آنتیبیوتیکهای آمپیسیلین و کلرامفنیکل و محیط بدون آنتیبیوتیک رشد دادهشدند و پس از گذشت 20 ساعت از کشت مربوطه، سوسپانسیونی از هر یک از باکتریها در PBS با غلظت A600 nm = 0.8 – 1.6تهیه گردید سپس مقدار lµ 5

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد درباره Sec.Cons.، Query، cs3_1، caf1M Next Entries پایان نامه ارشد درباره ظرفیت جذب، بازدارندگی، اکسیداسیون، انفورماتیک