پایان نامه ارشد درباره مدل سازی

دانلود پایان نامه ارشد

HTH87
2- PDOC00804 پروفایلها و نشانهای دمینهای متصل شونده به فلزات سنگین88
3- PDOC00139 P-type ATPases89
4- PDOC00180 نشان متالوتیونینهای مهرهداران90
از چهار سند فوق، سند شماره دو برای ادامه مطالعه انتخاب گردید. این سند شامل سه نوع دمین اتصال به فلزات سنگین با شناسه91های PS50846، PS01047و PS00154 در جایگاه پروسایت میباشد. دومین با شناسه PS01047، دومین حفاظت شده با حدود 70 اسیدآمینه میباشد که در تعدادی از پروتئینهایی که نقش ناقل یا سمزدایی فلزات سنگین را برعهده دارند یافت میشود. این دومین که به نام دمین اتصال به فلزات سنگین92 (HMA) نامیده میشود دارای پترن توافقی (شکل 3-1) با دو سیستئین حفظ شده میباشد که در اتصال به فلزات سنگین نقش مهمی را ایفا میکند.
[LIVNS]-x-{L}-[LIVMFA]-x-C-x-[STAGCDNH]-C-x(3)-[LIVFG]-{LV}-x(2)-[LIV]-x(9,11)-[IVA]-x-[LVFYS]
(a )

(b)
شکل3-1.) :(aپترن توافقی دومین اتصال به فلزات سنگین ) (HMA_1،b) 🙁 نمایش لوگوی توالی پترن. دو اسیدآمینه سیستئین احتمالا عامل اصلی اتصال موتیف به فلزات میباشند.
شناسه PS01047 با کمک ابزار Prosite-Scan موجود در پایگاهداده Prosite در مقابل دو پایگاهداده UniProtKB/Swiss-Prot و UniProtKB/TrEMBL پویش گردید که 209 پروتئین تا تاریخ آوریل 2009 بدست آمد. برخورد با شناسه Q60048[1-71] متعلق به پروتئین CadA میباشد این پروتئین (احتمالا)یک نوع ناقل وابسته به ATP جهت انتقال فلز کادمیم در باکتری لیستریا مونوسیتوژنز 93 بوده و در این تحقیق توالی موتیف اتصالی به کادمیوم از آن استخراج گردید (شکل3-2).
دومین اتصالی (HMA) به فلز کادمیوم در پروتئین CadA از 70 اسیدآمینه تشکیل شدهاست وحامل یک توالی توافقی CXXC (در لوپ 1 مابین زنجیره α1 and α1) است که در اتصال به کادمیوم بسیار کلیدی عمل میکند. لازم به ذکر است که در بسیاری از پروتئینهای اتصالی به فلزات سنگین این توالی توافقی حضور دارد(شکل 3-2).
دو نوع موتیف اتصالی بر پایه اطلات ساختاری HMA در پایگاهداده PDBsum و نیز اطلاعات موجود در منابع (Banci et al., 2006) از این بخش پروتئین CadA استخراج و برای قرار دادن در نواحی مجاز زیرواحد اصلی پیلی CS3 در نظر گرفتهشد(شکل 3-2).

(a1): gi|99031832|pdb|2AJ1|A
MAEKTVYRVDGLSCTNCAAKFERNVKEIEGVTEAIVNFGASKITVTGEASIQQVEQAGAFEHLKIIPEKE
(a2)=M: VDGLSCTNCAAKFERNVKEIEGVTEAI
(a3)=βM: VDGLSCTNCAAKFERNVKEIEGVTEAIVNFGASKITVTGEA
(a)

(b) (c)

شکل3-2. توالی و نمودار شماتیک مربوط به دومینHMA _1 در پروتئین CadA با کد پروتئینی PDB: 2AJ1|A و شناسه ژنتیکی gi|99031832
(a): موتیف های استخراج و طراحی شده از دومین HMA _1 پروتئین CadA به نام هایm و βm نامگذاری شدند که در توالی اصلی بصورت ضخیم با خط زیرین نمایش داده شدند و توالی توافقی که نقش مهمی در اتصال به فلزات را دارد بصورت ایتالیک مشخص شدهاست.(b) ساختار دوم دومینHMA _1 پروتیئنCadA، عناصر ساختار دوم موتیفها به ترتیب شامل حلقه – پیچ- حلقه و حلقه – پیچ- حلقه- زنجیره بتا هستند. (C) موقعیت فضایی عناصر ساختار دوم دومین HMA _1 نسبت به یکدیگر.

نکته دیگر این است که ساختار انتهای آمینی پروتئین CadA در حضور و عدم حضور Cd 2+ با کمک اسپکتروسکوپی X-ray و نیز NMR بررسی شده و نشاندادهاند که گلوتامین موقعیت 61 از لحاظ فضایی در مجاورت موتیف CXXC قرار میگیرد. از طرف دیگر گلوتامین موقعیت 61 در این دسته از پروتئینها کاملا حفظ شده است (و دریک مورد هم بجای گلوتامین، اسیدآمینه آسپارژین جایگزین شده است) (شکل3-3 ). لذا بنظر میرسد این اسیدآمینه در اتصال اختصاصی موتیف به کادمیوم موثر میباشد، نوآوری دوم در این تحقیق این بود که برای جایگاههای 38 و 79 به ترتیب برای موتیف و بتاموتیف اسیدآمینه آسپاریتک در موقعیت 61 نسبت به موتیف CXXC قرار گرفتهاست.

شکل 3-3. تطابق توالی بر مبنای ساختار دوم در منطقه انتهای آمینی انواع پروتئینهای دسته P1-type ATPases. شامل دمین انتهای آمینی پروتیئن CadA متعلق به لیستریا منوسیتوژن، ZntA از باکتری E.coli، دومین CopA از باکتری باسیلوس سوبتلیس و سایر دومین های انتهای آمینی. اسیدآمینه ای که پیشبینی شده به فلزات سنگین متصل میشوند. اسیدهای آمینه سیستئین به رنگ زرد نشان داده شدهاند. علامت ستاره اشاره به پروتیئینهایی دارد که ساختار دوم آنها در اینجا نشان داده شدهاست. مناطقی که به رنگ قرمز مشخص شدهاند مناطق حفاظت شده آب گریز میباشند(Banci et al., 2006).

2-1-3 آنالیز ساختاری پروتئین CstH جهت پیشگویی جایگاه مجاز در آن
در اختیار داشتن ساختار سوم پروتئینها کمک شایانی در درک عملکرد ملکولی آنها فراهم میکند. پیشگویی ساختار سوم پروتئینها یکی از زمینههای مطالعاتی مهم در زیستشناسی محاسباتی و شیمی میباشد که کاربرد فراوانی در زیستفناوری، طراحی دقیق و منطقی داروها، غربالگری مجازی و جهش زایی هدفمند دارد. شناسایی جایگاه مجاز پروتئینها که با آنالیز و بررسی ساختار سوم آنها و همچنین بررسیهای ساختار دوم و اول پروتئین ها فراهم میشود از جمله راهکارها جهت تحقق کاربردها و اهداف فوق الذکر پروتئین ها میباشد. لذا در این مطالعه با کمک روشهای نرمافزاری و کامپیوتری (in-silico) که روی ساختار اول، دوم و سوم، دو عضو مهم و اصلی سیستم پیلی CS3 انجام پذیرفت مناطق در دسترس حلال، غیر درگیر(در اتصالات زیرواحدی و چاپرونی) و مجاز شناسایی شدند.

1-2-1-3 شناسایی الگو و همردیفی توالی الگو– هدف
مدلسازی بر پایه الگو (یعنی مدلسازی بر اساس همولوژی توالی و شباهت تا خوردگی پروتئین با پروتئینهای ثبت شده) همراه با رشد PBD و توسعه روشهای پیشگویی، یک ابزار قدرتمند و مهم برای پیشگویی ساختار پروتئینها میباشد. تاکنون، اطلاعات ساختاری درباره سرهم شدن و تجمع94 سیستم CS3 (زیر واحد اصلی و چاپرون آن) گزارش نشدهاست. لذا با عنایت به چارت مدل سازی پروتئینها (شکل2-2) و بکارگیری روشهای مدلسازی ذکرشده در بخش مواد و روشها نتایج زیر حاصل شد. در این بخش از مطالعه، از دو روش برای شناسایی الگو (الگوهای) احتمالی برای دو جز اصلی این سیستم استفاده شد.
پس از تعيين توالي نشانه پروتئينهای مورد مطالعه (CstH،CS3-1، Caf1وCaf1M) توسط سرور Signal P 3.0 و بدستآوردن توالی پروتئينهای بالغ زیرواحد اصلی و چاپرون (جدول3-1)، توالی کامل هریک از این پروتئینها به عنوان موضوع مورد بررسی جهت جستجوی همولوگهای احتمالی در پایگاهداده PDB وکتابخانه الگوها درSwiss-Model یعنی (ExPDB) با دو ابزارBLAST و PSI-BLASTدر نظر گرفتهشد.

جدول 3-1. توالی اسیدآمینهای زیرواحد اصلی و چاپرون دو سیستم CS3 و کپسول آنتیژنی F1
نام پروتئین
تعداد اسیدآمینه کل
تعداد اسیدآمینه انتخابی
توالی انتخابی
CstH

CS3-1

Caf1

Caf1M
168

235

170

258
146

220

149

238
1MLKIKYLLIGLSLSAMSSYSLAAAGPTLTKELALNVLSPAALDATWAPQDNLTLSNTGVSNTLVGVLTLSNTSIDTVSIASTNVSDTSKNGTVTFAHETNNSASFATTISTDNANITLDKNAGNTIVKTTNGSQLPTNLPLKFITTEGNEHLVSGNYRANITITSTIK
MTPIKLIFAALSLFPCSNIYANNITTQKFEAILGATRVIYHLDGNGESLRVKNPQISPILIQSKVMDEGSKDNADFIVTPPLFRLDAKRETDIRIVMVNGLYPKDRESLKTLCVRGIPPKQGDLWANNEKEFVGMKLNVSINTCIKLILRPHNLPKLDINSEGQIEWGIRDGNLVAKNKTPYYFTIVNASFNGKALKTPGTLGPYEQKLYTLPSKISVSGLVKWEIIGDLGESSETKKFNI
MKKISSVIAIALFGTIATANAADLTASTTATATLVEPARITLTYKEGAPITIMDNGNIDTELLVGTLTLGGYKTGTTSTSVNFTDAAGDPMYLTFTSQDGNNHQFTTKVIGKDSRDFDISPKVNGENLVGDDVVLATGSQDFFVRSIGSKGGKLAAGKYTDAVTVTVSNQ
MILNRLSTLGIITFGMLSFAANSAQPDIKFASKEYGVTIGESRIIYPLDAAGVMVSVKNTQDYPVLIQSRIYDENKEKESEDPFVVTPPLFRLDAKQQNSLRIAQAGGVFPRDKESLKWLCVKGIPPKDEDIWVDDATNKQKFNPDKDVGVFVQFAINNCIKLLVRPNELKGTPIQFAENLSWKVDGGKLIAENPSPFYMNIGELTFGGKSIPSHYIPPKSTWAFDLPKGLAGARNVSWRIINDQGGLDRLYSKNVTL
1 توالیهای نشانه به رنگ زرد مشخص شدهاند.
نتیجه پویش با دو ابزارBLAST و PSI-BLASTمعرفی پروتئین چاپرون Caf1M (PDB ID: 1P5U_A) متعلق به باکتری یرسینیا پستیس با پوشش توالی بیش 90% و همسانی 37% به عنوان محتملترین الگو برای چاپرون پیلی CS3 بود که توالی آن در جدول 3-1 آمدهاست.
ولی برخورد معنیداری برای زیرواحد اصلی یعنی CstH از طریق روش مقایسهای) تشابه توالی) بدست نیامد. لذا از روش تاخوردگی برای یافتن الگو برای CstH استفاده گردید.
(2): توالی پروتئین CstH به سرور FFAS03 و phyre2 ارسال گردید که (PDB ID :3pdb_b and d1p5vb) به ترتیب به عنوان بهترین برخورد گزینش شد. الگوهای شناسایی شده بطور متوسط دارای 6/89% ضریب اطمینان، 26% همسانی توالی و 86% پوشش توالی برای CstH )جدول3-2) میباشد.
نکته جالب توجه اینکه الگوهای گزینش شده و توالیهای مورد بررسی، هردو در همان خانواده یعنی به ترتیب متعلق به خانواده چاپرون پیلی با تاخوردگی بتا ساندویچ شبیه ایمونوگلوبین95 و خانواده زیرواحد پیلی با تاخوردگی مشترک با توکسین دیفتریا96 قرار میگیرند. بعبارت دیگر سیستم اسمبلی کپسول آنتی ژنی F1 باکتری yersinia pestis همولوگ سیستم اسمبلی پیلی CS3 باکتری Escherichia coli می¬باشد.
جهت تائید بیشتر شباهت این دو سیستم اسمبلی دو جز اصلی سیستم از لحاظ ساختاری و همچنین توالی اسیدآمینهای با یکدیگر مقایسه شدند. نتایج مقایسه و همردیفی ساختار سوم با کمک دو سرور CE و TM و نیز محاسبه RMSD با کمک ابزارهای موجود در Swiss-PDB Viewer (شکل3-4) نشانداد که نه تنها این دو سیستم از لحاظ ساختار سوم مشابه هم هستند بلکه از لحاظ توالی نیز شباهت قابل قبولی دارند (شکل3-5). که این نتایج تائیدی بر انتخاب الگوی مناسب میباشد.

برای ارزیابی بیشتر اعتبار همردیفی ساختار-توالی بینCaf1 وCstH و همچنین Caf1Mو CS3-1 ، ساختار دوم الگوها و مدل های مربوطه تعیین و با هم مقایسه شدند که نتیجه حاصل حاکی از همردیفی و انطباق منطقی بین آنها بود (شکل3-4)
لازم به ذکر است که مناطق کوچکی دارای شکاف (Gap) و عدم انطباق (Mismatch) بودند (شکل3-4) که این مناطق عمدتا در انتهاهای ملکول مدل قرار دارند، به احتمال زیاد به سبب نقص و یا ماهیت تکنیک تفرق اشعه X می¬باشد که ساختار سه بعدی این نواحی در ملکول الگو تعیین نشدهاست. بنابراین این سرورها الگوی مناسبی برای انتهاهای پروتئینهای هدف نمیتوانند معرفیکنند زیرا این مناطق درگیر در ساختار کمپلکس بین Caf1وCaf1M یعنی Caf1-Caf1M و Caf1-Caf1-Caf1M میباشند و بنابراین مناطق انتهای ملکولهای هدف مدلسازی نشدند که البته این مسئله با پیشگویی ساختار دوم پروتئینها و نیز همردیفی توالی آنها با روشهای مانندClustalW حاکی از شباهت و بعبارتی موثق بودن الگوهای انتخاب شده و بنابراین مدلهای ساختهشده میباشد زیرا همچنانکه در شکل 3-5 مشخص است ساختار دوم دو پروتئین شباهت قابل قبولی با یکدیگر دارند.

(a):
Cs3 : AAGPTLTKELALNVLSPAALDATWAPQDNLTLSNTG-V-SNTLVGVLTLSNTSIDTVSIA
Caf1 : ————– VEPARITLTYKEGAPITIMDNGNIDTELLVGTLTLGGYKTGTTS-T
Cs3 Sec.Cons :ccccc??eeeeeeccccccccccccccceeeecccc-c-cceeeeeeeeccccceeeeee
Caf1 Sec.Cons : ————- ecceeeeeeecccceeeeeeccccceeeeeeeeeeeececccee-e
Cs3 : STNVSDTSKNGT-VTFAHETNNSASFAT-TISTDNANITL——DKNAGNTIVKTTNG
Caf1 :SVNFTDAAGDPMYLTFTSQDGNNHQFTTKVIGKDSRDFDISPKVNGENLVGDDVVLAT-G
Cs3 Sec.Cons :ecccccccccce-eeeeeeccccceeee-eeeccccceee——eccccceeeeeccc
Caf1 Sec.Cons : eeeeecccccceeeeeeecccccceeeeeeeecccccccceeccccceeccceeeeee-c
Cs3 :

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد درباره انفورماتیک Next Entries پایان نامه ارشد درباره Sec.Cons.، Query، cs3_1، caf1M