پایان نامه ارشد درباره ماهیت کار

دانلود پایان نامه ارشد

سلول‌هاي باكتريايي مستعد از CaCl2100 mM وGlycerol 40% به نسبت مساوی استفاده شد.
14-3-2 محلولهای مورد نیاز به منظور نگهداری باکتریها
براي تهيه ذخيره باكتريايي از محلولهاي زير استفاده شد؛ گلسيرول 15% و پپتون 1% براي نگهداري ذخيره باكتريايي در Cº20-، گلسيرول 30% و پپتون 1% براي نگهداري باكتري ها در Cº 70 – بكار بردهشد. باكتريها از روي محيطكشت جامد جمعآوري و در محلول‌هاي فوق پراکندهشده و در Cº20- يا Cº70- نگهداري شدند.
4-2 وسایل و دستگاهها
سانتریفوژ یخچالدار(Sigma 3k 30) ، ترازوی حساس (Metler)،PH متر (JENWAY 30201)، دستگاه حمام آب گرم (Memert)، میکروفیوژ یخچالدار (Heraeus)، اسپکتروفتومتر (Beckman Du530)، همزن مغناطیسی (Kiagen)، میکروسکوپ فلورسنت (Olympus)، دستگاه PCR (Techne)، دستگاهUV-Transilluminator ، سانتریفوژ Beckman، اتوکلاو، انکوباتور و دستگاه جذباتمی (Shimadzu AA670/G)

5-2 روشها
1-5-2 کشت باکتری
یک کلنی منفرد باکتری روی محیط کشتLB Agar (واجد آنتیبیوتیک) گسترش دادهشد و به مدت 16 ساعت در دمای 37 °C انکوبه گردید(Russell, 2001).
2-5-2 استخراج پلاسمید
1-2-5-2 استخراج پلاسمید با روش شکستن قلیایی
1- مقدار 5/1 میلیلیتر از کشت شبانه (معمولا 16 ساعته) توسط سانتریفوژ با دورrpm 4000 و زمان 5 دقیقه رسوب دادهشد. مایع رویی دور ریخته شد و سپس رسوب باکتری در 200 میکرولیتر از محلولI (Suspension Buffer) سوسپانسیون و به مدت 5 دقیقه در دمای اطاق قرار دادهشد.
2- مقدار 400 میکرولیتر از محلولII (Lysis Buffer) به سوسپانسیون باکتریایی فوق اضافهشد و با چند بار معکوس کردن ویال محتویات آن مخلوط گردید (در این مرحله باید از ورتکسکردن و تکان دادن شدید نمونه خودداری نمود، زیرا باعث شکستن DNA کروموزومی و باقی ماندن آن همراه DNA پلاسمیدی می شود) سپس به مدت 5 دقیقه در یخ قرار دادهشد.
3- مقدار 250 میکرولیتر از محلولIII (Neutralization Buffer) به مخلوط فوق اضافه شد، پس از مخلوطکردن به مدت 15 دقیقه در یخ قرار دادهشد.
4- مخلوط فوق با دورrpm 13000، دمای C° 4 و زمان 15 دقیقه سانتریفوژ شد، سپس مایعرویی به ویال جدیدی منتقل گردید. این مایع حاوی DNA پلاسمیدی، کمی پروتئین و RNA میباشد.
با افزودن RNase ملکولهای RNA تجزیه میشوند. RNaseبه مقدار 10 میکروگرم در میلیلیتر به محلول فوق اضافه شد و پس از مخلوط کردن به مدت یک ساعت در دمای °C 37 انکوبه گردید.
نکته:RNase را میتوان همراه با محلول(I) و یا محلول(III) نیز اضافه کرد.

3-5-2 استخراج DNA پلاسمیدی با استفاده از کیت
در این روش بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت (شرکت Roche) عمل شد.جزئیات روش کار در پیوست چهار آمدهاست.
4-5-2 بازیافت قطعات DNA از روی ژلآگارز با استفاده از کیت
در این روش بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت (Roche) عمل شد. مراحل کار در پیوست پنج شرح داده شدهاست.
5-5-2 خالصسازی محصول PCR با استفاده از کیت
در این روش نیز بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت (Roche) عمل شد و شرح کاملی از روش انجام کار در پیوست شش آمدهاست.
6-5-2 تهیه باکتریهای مستعد85 برای پذیرش DNA پلاسمید خارجی
دراین تحقیق به روش زیر سلولهای مستعد تهیه گردید.
1-6-5-2 مستعد سازي باکتريها
1- در مرحله اول سویه باکتری E. coli DH5α در 4 میلیلیتر کشت مایع (LB) بهصورت شبانه کشت دادهشده.
2- سپس از این کشت رقت 1/20 تا 1/100 در حجم 50 میلیلیتر تهیه شده و به مدت 2 تا 3 ساعت در حرارت Cº 37 با rpm 200 قرارداده تا به OD600=0.6 – 0.9 رسید.
3- نمونهها برای مدت 10 دقیقه در درون یخ قرارگرفت
4- سپس محیط کشت حاوی باکتری به فالکونهای استریل 50 منتقل و در دور 3000 rpm و دمای Cº4 درجه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد
5- مایع رویی را خالیکرده و فالکن حاوی رسوب باکتری بهصورت وارونه بر روی کاغذ جاذب قرار گرفت و آب آن گرفته شود سپس رسوب را در 25 میلیلیتر CaCl2 100 mMسرد پراکندهگردید و به مدت 30 دقیقه درون یخ انکوبه میشود.
6- مرحله 4 دوباره تکرار شده و اینبار رسوب حاصل را در 4 میلیلیتر از محلول CaCl2 100 mM + 30% Glycerol کاملا پراکنده کرده و درون میکروفیوژهای مناسب تقسیمکرده و در منفي 70 درجه سانتیگراد ذخیره شد.

7-5-2 انتقال پلاسمید به درون باکتری86
فرایند انتقال طبق مراحل زیر انجام شد:
1- یک ویال حاوی 100 میکرولیتر از سلولهای مستعد و ویال حاویDNA پلاسمیدی مورد نظر روی یخ قرار داده شد تا به دمای صفر درجه سانتیگراد برسد. 5-10 میکرولیتر از DNA پلاسمیدی (یا محصول Ligation) به سلولهای مستعد اضافه شدند.
2- با همزدن آرام توسط سرسمپلر DNA و باکتریها را بخوبی مخلوط کرده و سپس به مدت 30 دقیقه در یخ قراردادهشد.
3- شوک حرارتی C° 42 به مدت 90 ثانیه به مخلوط فوق داده شد و بلافاصله نمونه به مدت 3 تا 5 دقیقه بر روی یخ قرار دادهشد.
4- 50 میکرولیتر محیط LB مایع بدون آنتیبیوتیک به مخلوط فوق اضافهشده و به مدت 45 تا 60 دقیقه بسته به نوع آنتیبیوتیک در شیکر انکوباتور در 37 قرارداده شد. این زمان به باکتریها فرصت بازیابی و بیان ژن مقاومت به آنتیبیوتیک پلاسمیدی را میدهد.
5- بعد از این زمان که سلولها، DNA خارجی را دریافت کردهاند میتوان بخشی از آنها را بطور مستقیم کشت داد و بخش دیگر را برای بررسیها در Cº 4 نگهداریکرد.

به منظور کنترل انتقال DNA به داخل سلول، دو واکنش انتقال زیر، بطور همزمان با مراحل فوق انجام شد:
1- انجام مراحل انتقال بدون افزودن پلاسمید بهعنوان کنترل منفی
2- انجام مراحل انتقال با DNA حامل بریده نشده بهعنوان کنترل مثبت

8-5-2 واکنش زنجیرهای پلیمراز(Polymerase chain reaction, PCR)
موادی که در یک واکنش PCR استفاده می شود بطور خلاصه شامل: DNA الگو، دی اکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTP)، آنزیم Taq DNA پلی مراز و یا pfu DNA پلی مراز(و یا سایر آنزیم های پلی مرازی بسته به ماهیت کار) و بافر مخصوص آن آنزیم، کلرید منیزیم (MgCl2) برای آنزیم Taq DNA پلی مراز و سولفات منیزیم (MgSo4) برای آنزیم Pfu می باشد.
سه مرحله اصلی PCR عبارتند از: دناتوره شدن، جفت شدن آغازگر و پلی مریزه شدن که در این تحقیق دمای جفت شدن تمامی آغازگرهای استفاده شدهºC 56 بودند.
1-8-5-2 SOEing-PCR (Splicing by overlap extension PCR)
SOE- PCR جهت ایجاد جهشهای حذف و یا اضافه و جهشهای نقطهای در یک توالی DNA قابل استفاده است. مبنای این روش طراحی و استفاده از پرایمرهای کایمریک و پرایمرهای دو انتهای ژن می باشد بنحوی که پرایمر های کایمریک محل ایجاد جهش را دربرمی گیرد و قطعات بدست آمده یک قسمت مشابه در انتهای 5´ دارند.سپس دو قطعه تکثیر شده تخلیص میشود تا پرایمرهای اولیه حذف شوند و دوباره در یک واکنش PCR دوم مخلوط می شوند که فقط حاوی دو پرایمر نواحی انتهایی می باشد. در این تحقیق با استفاده از آغازگر های (CS3FF ,-F2 ,-R ,-F1 و CS3RR) و (CS3FF ,-F2 ,-R ,-BF1 و CS3RR) به ترتیب. قطعات نوکلئوتیدی 81 و 123 جفت بازی که کد کننده موتیف و بتاموتیف جاذب کادمیوم میباشند پس از طراحی در غالب پرایمر طی واکنش SOEingPCR (Splicing by overlap extension PCR) مطابق شکل 2-3 در طی دو مرحله PCR در مناطق مجاز(به عنوان مثال در محل اسیدآمینه 38 پروتئینCStH بالغ) زیرواحد اصلی پیلی CS3 (CStH) وارد شدند (Karkhane et al., 2009).
PCR اول
تکثیرهای اولیه PCR کاملا شبیه به دستورالعمل استاندار PCR انجام شد. در واکنش PCR اول ابتدا با استفاده از آغازگرهای(38-R وCS3-FF) و (38-F1 و CS3RR و یا 38-BF1 و CS3RR) دو واکنش PCR انجام شده سپس محصول PCR از روی ژل بازیافت شد و به عنوان الگو برای PCR دیگری با پرایمرهای (38-F2 و CS3RR) مورد استفادهقرارگرفت
PCR دوم
PCR دوم شامل یک مرحله SOEing و یک واکنش PCR با دستوراالعمل معمولمیباشد. برای انجام SOEing دو محصول تکثیر شده در واکنشهای PCR اول (PCR1 وPCR3) پس از بازیافت از روی ژل به نسبت 1:1 از لحاظ مولی باهم مخلوط شدند و چون دارای نواحی مشترک می باشند (دو پرایمر -F2 و -R که در دو واکنش PCR مورد استفاده قرار گرفتند دارای نواحی مشترک می باشند) از طریق ناحیه مشترک به یکدیگر متصلشده و و طی هفت سیکل و بدون افزودن آغازگر تکثیر شدند. سپس آغازگرهای دو انتهای ژن (CS3-FF و CS3-RR) به واکنش در حال انجام اضافهشد و ادامه واکنش مطابق روشهای معمول PCR طی 30 سیکل تکمیل گردید(جدول2-10) .
جدول2-10. ترکیبات استفاده شده در یک واکنش SOEing-PCR
مقادیر(میکرولیتر)
مواد
5/1
10X PCR Buffer
1
10mM dNTP
5/1
50mM MgSo4
1 (از هرکدام)
(10pmol) primer
5/0
pfuDNA Polymerase
5
(50 ng) DNA
تا 50 میکرولیتر
ddH2O

شکل 2-3. SOEing-PCR برای وارد کردن موتیف متصلشونده به فلز سنگین در جایگاه مجاز 38 و ساخت وکتور بیانی. (A) پلاسمید pPM4555 حامل ژن cstH. (B) تصویر کلی از ترتیب و آرایش توالیهای وارد شونده که به عنوان آغازگر طراحی و استفاده شدند. (C) مراحل SOEing-PCR برای واردکردن موتیف در ژن cstH. (D) ساخت پلاسمید نوترکیب pEYS38cbm1 (در شکل به نام pEYS38m1 معرفی شده است)حامل ژن هیبرید cstH::cbm . ( (Eساخت پلاسمید بیانی حامل اپرون cst نوترکیب حاوی DNAکدکننده موتیف متصل شونده به فلز سنگین
9-5-2 کلونینگ ژن جهش یافته cstHدر وکتورpBR322
ساخت DNA نوترکیب در مهندسی ژنتیک از اتصال DNA به یک حامل صورت می گیرد. معمولا قطعه خارجی که وارد پلاسمید میشود یا محصول PCR است که در این صورت اگر واکنش PCRبا آنزیم pfu انجام گرفتهباشد انتهاهای محصول PCR صاف بوده و در وکتوری که با آنزیمهای برشدهنده ایجاد کننده انتهاهای صاف بریده شده، کلون میگردد. یا اینکه DNA خارجی محصول واکنش برش آنزیمی میباشد که در اینصورت معمولا پلاسمید حامل با آنزیمی بریده میشود که DNA خارجی با آن بریده شده و بدین ترتیب دو ملکول (وکتور و DNA خارجی) دارای انتهاهای قابل جفتشدن هستند، تولید شدند
به منظور همسانه ژن cstH جهشیافته، مراحل زیر بر طبق روشهای استاندارد مولکولی انجام شد(Russell, 2001) :
1) ابتدا ناقل pBR322 از درون باکتری DH5α E. coli بوسیله کیت استخراج DNAاستخراج گردید. برش آنزیمی بر روی ناقل pBR322 طبق جدول 2-11 در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 4 ساعت صورت گرفت. پس از انجام الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1درصد و اطمینان از بریده شدن کامل ناقل، قطعه مورد نظر به کمک کیت استخراج از روی ژل، تخلیص شد.
جدول2-11. واكنش برشآنزيمي پلاسمید pPR322

ترکیبات
حجم(میکرولیتر)
آب مقطر
14
pBR322
20
بافر(10X) B فرمنتاز
4
EcoRV
2

2) پس از الکتروفورز محصول نهایی PCR بر روی ژل آگارز 1درصد و اطمینان از صحت اندازه آن، قطعه مورد نظر به کمک کیت استخراج از روی ژلآگارز تخلیص شد.

3) کیفیت و کميت پلاسميد و ژن جهش یافته cstH خالص شده از ژل، به وسيله الکتروفورز بر روی ژل آگارز یک درصد و سپس روش اسپکتروفتومتری (260 نانومتر و 280 نانومتر) بررسی شد.

4) الحاق محصول PCR با ناقل برشخورده pBR322 توسط آنزیم لیگاز T4 و در واکنش آنزیمی (جدول2-12) به مدت یک شب در 22 درجه سانتیگراد صورت گرفت.

جدول 2-12. تركيبات مورد استفاده براي واكنش الحاق

ترکیبات
حجم(میکرولیتر)
آب مقطر
4
بافر لیگاز T4 (X10)
3
ژن موتانت cstH
15
ناقل برش خورده pBR322
6
لیگاز T4 (5 U/µl)
2

5) محصول الحاق (پلاسميد نوتركيب pEYS38m1) با روش شوكحرارتي به سلولهای مستعد E. coli DH5α منتقل و سلولهای تراریخت روي محیطکشت جامد حاوي آمپیسیلین (غلظت µg/ml 100) كشت و در انکوباتور 37 درجه سانتيگراد به مدت 18 ساعت نگهداری شد.

10-5-2 تائید صحت کلونهای واجد پلاسمید نوترکیب

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد درباره Amp، CStH، cstH::cbm، cst Next Entries پایان نامه ارشد درباره انفورماتیک