پایان نامه ارشد درباره ظرفیت جذب، عرضه کننده، لیپوپروتئین، پلاسمایی

دانلود پایان نامه ارشد

محدودیتهای میباشد که میتوان به مواردی مانند (1) پایین بودن امکان جذب گزینشی (2) محدویت بالای ظرفیت جذب در ریزسازوارههای طبیعی (3) پایین بودن میزان استحصال فلز جذب شده از ریزسازواره (4) عدم امکان بهره برداری دوباره از ریزسازوارههای استفاده شده، اشاره نمود. از اینرو در سالهای اخیر محققین در صدد افزایش بیان پروتئینهای جاذب در ریزسازوارههای نوترکیب بودند ولی این سیستمهای بیان نیز با مشکلاتی از قبیل محدود بودن ظرفیت جذب و عدم امکان بهره برداری دوباره از ریزسازوارههای استفاده شده مواجه میباشند. لذا امروزه بخصوص از دهه 90 به بعد نمايش پپتيد‌‌هاي جذب‌كننده فلزات سنگين روي سطح باكتري از جمله روش‌هاي نوين بيوتكنولوژي در حذف فلزات سنگين در غلظت پايين و افزایش امکان جذب گزینشی مي‌باشد نمايش پپتيد روي سطح باكتري توسط اتصال آن‌ها به ضمائم سطحي يا پروتئين‌‌هاي سطحي باكتري‌ها انجام مي‌شود (Kotrba et al., 1999a, Kuroda and Ueda, 2010, Bae et al., 2002, Bae et al., 2000)

شکل 1-4. ساختار شیمیایی فیتوچلاتین طبیعی(بالا سمت راست) و فیتوچلاتین سنتزشده(پایین سمت راست). به اختلاف پیوند بین گلوتامیک و سیستئین توجه شود. واکنش بین اسیدآمینه سیستئین موجود در فیتوچلاتین و فلز کادمیوم(سمت چپ) (Bae et al., 2000)
12-1 نمایش سطحی باکتریایی
نمایش سطحی پروتئینهای هترولوگ در روی سطح ریزسازوارهها، که بوسیله تکنولوژی DNA نوترکیب امکان پذیر شدهاست علاوه بر کاربردهای وسیعی که در تولید و تهیه واکسنهای باکتریایی، غربالگری کتابخانههای پپتیدی، تولید آنتی بادیها، تولید بیوکاتالیستهای نوترکیب و توسعه بیوسنسورها دارد، به عنوان یک روش استراتژیک جهت حذف فلزات سنگین مورد توجه محقیقین قرار گرفتهاست (Bae et al., 2002, Dong et al., 2006, Narita et al., 2006, Gao et al., 2001).
از باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی در سیستم نمایش سطحی باکتریایی استفاده شدهاست. با توجه به اختلاف ساختار غشاء و دیواره سلولی بین این دو دسته باکتری (شکل 1-5)، در ادامه به بررسی کاربرد دو گروه باکتری در مطالعات مهندسی ژنتیک میپردازیم.

شکل 1-5. ترکیبات سطحی باکتریهای گرممنفی و گرممثبت. همه ساختارهای نشان داده شده در تمامی باکتریها وجود ندارد. برای مثال پروتئین M فقط در تعدادی از باکتریهای استرپتوکوکوس یافت میشود و همچنین تاژک در تعدادی از آنها وجود دارد(Wang and Chen, 2009).

1-12-1 نمایشسطحی در باکتریهای گرممنفی
باکتریهای گرم منفی دارای یک غشاء پلاسمایی دو لایه متشکل از فسفولیپید و پروتئین در نیمه داخلی و همچنین یک غشا خارجی نامتقارن شامل لیپوپلی ساکارید (LPS) و پروتئینهای مختلف از جمله پورین59ها میباشند. فضای بین دو غشاء داخلی و خارجی پری پلاسم نامیده میشود که شامل پپتیدوگلیکان میباشد(شکل1-5) (Wang and Chen, 2009).
از باکتریهای گرم منفی و گرم مثبت در سیستم نمایش سطحی باکتریایی استفاده میشود. در میان باکتریهای گرم منفی، باکتری Escherichia coli بطور گستردهای برای مهندسی سطح سلول مورد مطالعه قرار گرفتهاست. باکتری E. coli یک باکتری گرم منفی پرطرفدار است زیرا این باکتری علاوه بر داشتن ابزارهای ژنتیکی متنوع، سویههای جهش یافته آن کارایی بالایی جهت ترانسفورماسیون دارند که این امکان را فراهم میکند که کتابخانههای بزرگ پپتیدی و پروتئینی را بسهولت بتوان با کمک این باکتری غربال کرد(Lee et al., 2003).
استراتژیهای متفاوتی جهت ارائه پروتئینهای هترولوگ روی سطح باکتری E. coli ارائه شده است که شامل:
(1)ورود توالیهای هدف در لوپهای سطحی پروتئینهای غشای خارجی مانند پروتئین OmpA و OmpC. مطالعات نشان داده است که لوپهای موجود در ساختار این پروتئین ناحیه مناسبی برای ورود پروتئینهای خارجی میباشند. شکل(1-6) پروتئین OmpC را با لوپهای مجاز برای ورود اپیتوپ خارجی نشان میدهد.
(2)اتصال توالیهای هدف به بخش N ترمینال لیپوپروتئینها. این دسته از پروتیئنها مانند TraT از طریق لیپید به غشا خارجی متصل میشوند. اپیتوپهای ویروسی از پولیوویروس در موقعیتهای مختلفی از TraT با موفقیت وارد شدهاست.
(3) ورود توالیهای هدف بدرون پروتئینهایی که نقش ساختاری در سطح سلول دارند مانند فلاژلیوم و پیلی.(Chang et al., 1999, Saleem et al., 2008, Bae et al., 2000)
بطور کلی استقرار و ارائه پروتئین در سطح باکتری با عبور از دو غشا باکتری امکان پذیر میگردد. باکتریها از طریق دو سیستم ترشحی، پروتئینها را به سطح سلول هدایت میکنند: پروتئینها از(1) مسیر جابجایی آرژنین دوتایی یا مسیرtat (2) ویا مسیر ترشح عمومی یا sec (Palmer et al., 2005) (de Keyzer et al., 2003) از غشای داخلی عبور میکنند سپس پروتئینهای با مقصد غشای خارجی60 (OMP) توسط ماشینهای ویژه نظیر برخی از پروتئینهای پوششی، از پری پلاسم عبور کرده و در غشای خارجی قرار میگیرند (Genevrois et al., 2003). در باکتریهای گرم منفی پروتئين‌هاي سطحي مختلفي شامل پروتئين‌هاي غشاي خارجي مانندLamB ، PhoE وOmpA (Chen and Georgiou, 2002) ليپو‌پروتئين سطحی TraT و ليپوپروتئينهاي متصل به پپتيدوگليکانها (Chang et al., 1999)، پروتئين فلاژلين پیلی باکتريايي (Westerlund-Wikstrom, 2000) و پروتئين فيمبرين تاژک باکتري (Klemm and Schembri, 2000) براي نمايش سطحي پپتيدها در سطح باکتري بکاربرده شدهاست. در میان پروتیئنهای ذکر شده، پیلیها نسبت به سایر حاملها امتیازاتی دارند که در بخشهای بعدی به آنها اشاره خواهیم کرد. شکل (1-6) نشان دهنده ارائه سطحی باکتریایی است که با نمایش پروتیئنهای مختلف در سیستم غشا خارجی تامین میشود(Samuelson et al., 2002).

شکل1-6. عرضه سطحی در باکتریهای گرم منفی: دایرههای سبز نشاندهنده پروتئینهای هترولوگ مسافر میباشند.) a ( سیستمهای عرضه سطحی در باکتریهای گرم منفی: S-layer protein،OmpC ،PhoA ،OmpA ،lipoprotein ، IgA protease، Pilin،Lpp–OmpA ، OprF، INP61 و Flagella (b) سیستم عرضه سطحی با استفاده از پروتیئن INP، که مثالی از اتصال انتهای آمینی میباشد. INP یک حامل بسیار پایدار برای عرضه پروتئینهای خارجی به بزرگی60 کیلو دالتون میباشد. ( c ) سیستم عرضه سطحی با استفاده از پروتیئن غشای خارجیC (OmpC)، که نماینده روش اتصال ساندویچی میباشد.در این سیستم یک پپتید پلی هیستیدینی با طول بیش از 162 اسیدآمینه در هفتمین لوپ خارجی (L7) پروتیئن OmpC وارد شده و بطور کاملا کارآمد در سطح سلول باکتری.E. coli .بیان شد.

2-12-1 نمایش پروتئینهای هترولوگ در باکتریهای گرم مثبت
بیان سطحی در باکتریهای گرم مثبت نسبت به باکتریهای گرم منفی دارای یکسری امتیازاتی است که از آنجمله میتوان به مواردی مانند: کوتاه بودن مسیر انتقال پپتیدها از سیتوپلاسم به سطح سلول، نیز ضخیم و مقاوم بودن دیواره سلولی باکتریهای گرم مثبت نسبت به استرسهای مکانیکی اشاره نمود (شکل1-5). از اینرو بنظر میرسد باکتریهای گرم مثبت نسبت به باکتریهای گرم منفی جهت کاربردهای زیستفناوری مناسبتر باشند (Narita et al., 2006, Lee et al., 2003).
همانند E. coli در میان باکتریهای گرم مثبت، باکتریهای Staphylococcus Xylosus و Staphylococcus carnosus بیشتر مورد مطالعه قرار گرفتهاند. پروتیئن SpA62 از باکتری S. auresus و پروتئین PgsA از باکتری Bacillus subtilis. بیشتر از سایر پروتئینها بعنوان سیستم مهندسی سطح سلول استفاده شدهاند. با همه امتیازات ذکر شده مطالعات کمتری در مورد بیان سطحی باکتریهای گرممثبت بخصوص در زمینه کاربرد در پاکسازی زیستی صورت گرفتهاست. در این خصوص میتوان به بیان دو پپتید پلی هیستیدیل، His3-Glu-His3 و His6 در سطح دو باکتری S. xylosus and S. carnosus اشاره نمود که برای اولین با توسط Samuelson انجامگرفت و نشان دادند که پپتیدهای عرضه شده قادر به اتصال به دو فلز نیکل و کادمیوم میباشد(Samuelson et al., 2000). با این حال مستندات کمتری از کاربرد باکتریهای گرم مثبت جهت حذفزیستی موجود است اما بنظر میرسد بدلیل برتریهای این باکتریها برای مهندسی سطح سلول در آینده این استراتژی مورد توجه بیشتری قرار گیرد (Saleem et al., 2008).

13-1 افزایش جذبزیستی فلزات سنگین در باکتریهای گرم منفی با روش¬های مهندسی ژنتیک با تاکید بر نمایشسطحی
تا کنون انواع مختلفی از پروتئینهای اتصالی به فلزات مانند گلوتاتیون، فیتوچلاتینهای وابسته به گلوتاتیون و متالوپروتئینهای غنی از سیستئین و فیتوچلاتینهای سنتزی برای افزایش جمعآوری و تجمع فلزات سنگین استفاده شدهاست.
Kotrba و همکارانش در سال 1999 خواص اتصال به فلزات، سویههای ارائه کننده پپتیدهای کوچک بصورت فیوژن با LamB در سطح را بررسیکردند. آنها در این بررسی توالیهای کوچک متصلشونده به فلز مانند HP وCP (Gly-Cys -Gly-Cys-Pro-Gly-Cys-Gly-Cys) که به روش مهندسی ژنتیکی درون پروتئین LamB قرارداده شده بود را در سطح باکتری E. coli بیان کردند و نشان دادند که قدرت جذب Cu+2 و Zn +2نسبت به حالت وحشی 4 برابر بیشتر بود(Kotrba et al., 1999b).
در سال 2000 ، Bae و همکارانش فیتوچلاتینهای سنتزی (ECs) را جهت افزایش جمعآوریزیستی Cd+2 استفاده کردند. آنها بدین منظور ژنهای سنتزی آنالوگهای فیتوچلاتین(Glu-Cys)n Gly (EC8 (n = 8), EC11 (n = 11), و EC20 (n = 20))را به ژن Lpp-ompA فیوز کرده و در سطح باکتری E.coli ارائه نمودند و نیز EC20را بصورت پریپلاسمی در باکتری بیان کردند. نتایج نشان داد که به ازای 1 میلی گرم وزن خشک سلول ارائه دهنده EC8 ، 18 میلی گرم +2 Cdجذب میشود در حالی که در سلولهای ارائه کننده EC20 بیش از 100 میلیگرم Cd+2به ازای یک میلیگرم وزن خشک سلول جمعمیگردد و همچنین میزان جذب سلولهای عرضه کننده EC20 بصورت سطحی نسبت به سلولهای عرضه کننده EC20 بصورت پری پلاسمی 2 برابر بود(Bae et al., 2000).
Valls برای اولین بار متالوتیونین را جهت جذب کادمیوم از خاکهای آلوده در سطح باکتری Ralstonia eutropha معرفیکرد. در این مطالعه توالی DNA کد کننده متالوتیونین به دومین بتای اوتوترانسپورتر، پروتئاز IgA ازباکتری Neisseria gonorrhoeae متصل شد و بدین ترتیب پروتئین هیبرید به سطح غشای خارجی هدایت گردید. نتیجه این بررسی نشان داد که سویه دستکاری شده ژنتیکی مقدار بیشتری کادمیوم از محیط مایع جمع میکند و جالب اینکه تلقیح R. eutropha بیان کننده متالوتیونین به خاک آلوده به کادمیوم بطور قابل ملاحظهای سمیت این فلز را در گیاه تنباکو کاهش داد(Saleem et al., 2008).
در سال 2001، Kjaergaard و همکارانش یک پپتید جدید متصل شونده به فلز روی (Zn2+) را از کتابخانه پپتیدی بر پایه پیلی FimH گزارش کردند(Kjaergaard et al., 2001).
در تمامی مطالعات فوق که اغلب شامل پپتیدهای غنی از سیستئین بودند یک مسئله عمده فقدان اختصاصیت بود که مشکل بزرگ در بازیافت اختصاصی فلزات سنگین مانند جیوه بوجود میآورد. جهت بررسی اختصاصیت جذب از ویژگی باکتریهای مقاوم به جیوه استفاده کردند. مطالعات نشان دادهاست برخی از باکتریهای مقاوم به جیوه دارای یک اپرون جیوه میباشند که شامل یک ژن تنظیمی MerR و سایر ژنهای دخیل در انتقال و سمزدایی یون جیوه درون سلول است. پروتئین MerR دارای سه دمین میباشد که (1) دمین انتهای آمینی به DNA اتصال یافته (2) دمین انتهای کربوکسیلی به Hg2+ و منطقه مابین که عملکرد آن هنوز شناخته نشدهاست. اختصاصیت این پروتئین برای اتصال به Hg2+ با تشکیل آرایش سه وجهی تیولات با مرکزیت جیوه تامین میشود(O’Halloran et al., 1989).
در سال 2003 Bae و همکاران با عرضه MerR در سطح باکتری E. coli آنرا برای جذب اختصاصی جیوه از محیط بکاربردند و نشان دادند عرضه سطحی MerR ظرفیت جذب یون جیوه را به میزان 6 برابر نسبت به باکتریهای مهندسی نشده، افزایش میدهد و جالب اینکه این اتصال بسیار اختصاصی بوده بطوریکه در حضور 100برابر غلظت اضافی کادمیوم و روی، هیچ کاهشی در اختصاصیت و اتصال فلز جیوه به MerR مشاهده نشد و نکته جالب

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد درباره مصرف انرژی، فیزیولوژی Next Entries پایان نامه ارشد درباره زیست محیطی، ساختار فضایی، انفورماتیک، فیزیولوژی