پایان نامه ارشد درباره ظرفیت جذب، بازدارندگی، اکسیداسیون، انفورماتیک

دانلود پایان نامه ارشد

از سوسپانسیون روی کاغذ نیتروسلولز نقطه گذاریگردید. پس از انکوبه کردن با آنتیبادی اولیه (Anti-Cs3)، بیان پیلی روی سطح باکتری با آنتی بادی ثانویه goat-anti rabbit IgG بررسیشد که واکنش های مثبت به احتمال زیاد نشاندهنده بیان پیلی Cs3 می¬باشند (شکل3-26). سپس کلونهای مثبت برای آنالیز و بررسی بیشتر با تکنیک وسترنبلات انتخاب شدند.

شکل (3-26). دات بلاتینگ باکتری E. coli بیان کننده پیلی هیبرید با استفاده از آنتیبادی CS3. کنترل مثبت (C+) باکتری E. coli دارای پلاسمیدpPM4567 حامل اپرون طبیعی CS3. کنترل منفی (C -) باکتری E. coli بدون پلاسمید. ستون دوم ردیف اول باکتری E. coli حامل پلاسمید نوترکیب pEYS38cbβm2. ستون ششم ردیف سوم باکتری E. coli حامل پلاسمید نوترکیب pEYS79cbm2. بقیه نمونهها نیز باکتریهای بیان کننده پلاسمیدهای حامل پیلی نوترکیب می¬باشند که در متن به آنها اشاره شدهاست.
2-4-2-3 وسترن بلاتینگ
جهت انجام وسترنبلات پروتئینهای پیلی باکتریهای حامل پلاسمیدهای نوترکیب pEYScbm2 و pEYSmcbβ2توسط ترسیب با %12,TCA102 استخراج شدند. پروتیئن پیلی استخراج شده سپس همراه با نمونههای کنترل مثبت و منفی روی ژل 13% SDS-PAGE با ولتاژ 140 الکتروفورز شدند. سپس نمونه های پروتئین الکتروفورز شده بصورت شبانه با ولتاژ 40 در اتاق سرد روی غشای PVDF انتقال یافت با توجه به اینکه پروتیئن پیلیKD 14.5 و یا 15.5 وزن دارد همانطورکه در شکل3-26 ملاحظه می شود نمونههای حامل پلاسمید نوترکیب اندازه سنگینتری نسبت به باکتری حامل اپرون CS3 (کنترل مثبت) دارند. همچنین شکل شماره 7 نشان میدهد که پروتئینهای استخراجی از کلونهای حامل پیلیهای هیبرید واکنش قوی با آنتیبادی علیه CS3 دارند که بیانگر بیان و ارائه پیلی در سطح باکتریهای نوترکیب و باکتری بیان کننده پیلی طبیعی میباشد. همانطور که در شکل 3-27 ملاحظه میگردد آنتیبادی علیه پیلی دو باند در مجاورت هم تشخیص میدهد دلیل این امر این است که همانطور که در نتایج بخش بیوانفورماتیکی ذکرشد پیلی CS3 دارای سیگنال پپتیدی می¬باشد که دو جایگاه برشی دارد (در محل اسیدهایآمینه شماره 7 و 22 ) که این امر باعث ایجاد دو پروتئین به وزن ملکولی 5/14 و 5/15 کیلودالتونی میشود. باند کوچکتر دارای پهنای بیشتری می¬باشد که میتواند احتمالا به این دلیل است که پروتئین های پیلی بیشتر بعد از اسید¬آمینه شماره 22 بریده میشوند.

(A)

(B)

شکل 3-27.) Aو (Bوسترن بلاتینگ باکتری E. coli بیانکننده پیلینوترکیب با استفاده از آنتیCS3. pPM4567 پلاسمید حامل پیلی طبیعی و به عنوان کنترل مثبت میباشد و DH5α باکتری میزان و به عنوان کنترل منفی می¬باشد بقیه نمونهها باکتریهای حامل پلاسمیدهای نوترکیب هستند که مشخصات آنها روی شکل موجوداست.
5-2-3 بررسی نمایش سطحی پیلیهای هیبرید CS3::cbβm و CS3::cbm توسط رنگآمیزی ایمونوفلورسانس
جهت بررسی و ارزیابی بیشتر بیان و ارائه پروتئینهای نوترکیب روی سطح سلول باکتری، از میکروسکوپ ایمونوفلورسانس استفاده شد.سلول باکتریایی بیان کننده این پروتئین ها پس از انکوباسیون با آنتیبادی پلی کلونال علیه CS3 سپس با FITC کانجوگه شده با آنتیبادی علیه آنتیبادی خرگوشی (Swine-anti Rabit IgG conjugated fluoreceine isothiocyanate) انکوبه گردید. همچنانکه در شکل (3-28) نیز نشاندادهشدهاست سلولهای E. coli بیان کننده پیلی در سطح خود رنگ فلورسانت ساطع میکنند ولی در کنترل منفی، نور فلورسانسی ساطع نمیشود. این نتایج بیانگر ارائه پیلی نوترکیب و پیلی طبیعی در سطح باکتری و تأیید نتایج حاصل از دات و وسترنبلات است.

شکل 3-28. تصاویر میکروسکوپ فلوئورسانس باکتریE. coli بیان کننده پیلی نوترکیب با استفاده از آنتیبادی CS3. باکتری میزبان DH5α به عنوان کنترل منفی، باکتری pPM4567 بیان کننده پیلی طبیعی به عنوان کنترل مثبت، سایر نمونهها حامل پلاسمیدهای نوترکیب می¬باشند و مشخصات آنها بر روی تصاویری درج شدهاست.

6-2-3 بررسی خاصیت اتصال به فلز باکتریهای بیان کننده پیلی CS3 نوترکیب
الف) ظرفیت جذب فلز کادمیوم: باکتریهای مهندسی شده ژنتیکی که بطور پیوسته موتیفهای اتصالی به کادمیوم را عرضه مینمایند، جهت جذب و برداشتن کادمیوم از محلول آبی طراحی شدهاند. ابتدا آزمایشات جذب جهت ارزیابی ظرفیت جذب کادمیوم انجام پذیرفت. نتیجه 2 ساعت انکوباسیون سلولهای باکتری E .coli نمایش دهنده موتیف جاذب کادمیوم در سطح با محلولهای حاوی غلظت های متفاوت کادمیوم در شکل(3-29) نشان داده شدهاست. همچنانکه که ملاحظه می شود میزان جذب کادمیوم با افزایش غلظت کادمیوم در محلول افزایش یافته و در حدود 2 ماکرومول برای کنترل مثبت 8 ماکرومول برای نمونههای جهش یافته به ازای یک گرم وزن خشک باکتری بتعادل میرسد سپس افزایش جذب بکندی پیش می رود. آزمایشات مشابهی برای بدست آوردن ظرفیت سایر یونهای فلزی یعنی، نیکل، مس و کروم نیز بطور جداگانهای بر روی باکتریهای کنترل (بیان کننده CS3 بدون دست ورزی) انجام گرفت که به ترتیب مقادیر 9، 12 و9.2 میلی گرم به ازای یک گرم وزن تر باکتری بدست آمد. لازم به ذکر است آزمایش مشابهی بر روی باکتریهای جهش یافته انجام گرفت که در آنها غلظت تعادلی برای سه عنصر نیکل، مس و کروم بسیار پایین تر از کنترل بود.

شکل 3- 29. منحنی ظرفیت جذب کادمیوم در باکتری بیان کننده موتیف اتصالی به کادمیوم و باکتری E. coli میزبان. سلولهای میزبان سلولهای pPM4567 میباشند.

ب ) سینتیک جذب:
برای تعیین سرعت جذب کادمیوم توسط سلولهای باکتری تغییریافته ژنتیکی،آزمایش وابسته به زمان برای این دسته از سلولها و نیز سلولهای بیان کننده پیلی طبیعی E. coli ( بعنوان کنترل) در حضور کادمیوم با غلظت 16µM از آن فلز انجام گرفت. همانطور که در شکل(3-30) نشانداده شدهاست ، بالاترین بازده جذب کادمیوم در 15 دقیقه ابتدای آزمایش صورت میگیرد در این محدوده زمانی همچنین بیشترین اختلاف جذب بین باکتری های تغییریافته ژنتیکی و باکتریهای کنترل وجود دارد. فرایند جذب را بدین ترتیب میتوان تشریح کرد که بعد از یک مرحله جذب سریع، کارایی جذب تنزل یافته وحدود 2 ساعت بعد از شروع واکنش به تعادل میرسد. نکته حائز اهمیت اینکه پس از حداکثر جذب کاهش قابل توجهی در منحنی جذب باکترهای مهندسی شده نسبت به باکتریهای کنترل دیده میشود که ممکن است بعلت آشفتگی و آشوبناشی از مخلوط کردن سیستم در انکوباتور چرخش دارباشد که اثر آن در باکتریهای مهندسی شده مشهودتر از باکتریهای کنترل (بدون دستورزی) میباشد. توجیه دیگر برای این مسئله می تواند این میباشد که تعداد پیلیها در سطح باکتریهای مهندسیشده کمتر از باکتریهای کنترل میباشد بهمین دلیل اثر از دست دادن تعداد اندکی پیلی در این دسته از باکتریها خیلی سریع در نتیجه مشاهده میگردد.

شکل3-30. بررسی اثر عامل زمان بر جذب کادمیوم در باکتریهای مهندسی شده. نمونه مهندسی شده مورد استفاده در این منحنی pEYS38cbβm2 و سلولهای میزبان نیز سلولهای pPM4567 میباشند. غلظت محلول کادمیوم استفاده شده 16 µM میباشد

1-6-2-3 جذب کادمیم
فلزات معمولا بصورت نمک در طبیعت وجود داشته و در آب محلول می¬باشند و به صورت یونهای فلزی توسط باکتریها جذب میشوند. ولی از آنجائیکه در محیط هیپوتونیک ممکن است باکتریها دچار تورژسانس و لیز شوند لذا پس از بررسی منابع مختلف از لحاظ حلالیت نمک فلزات و تست اکثر آنهاTris-HCl 1mM (pH 7.4) به عنوان حلال مناسب برای حل کردن فلزات انتخاب گردید. پس از انتخاب نوع حلال، غلظت کاری بر اساس بررسی جذب در طیف غلظتهای کادمیوم که از µM7 شروع شده و به µM 35 ختم میگردید، انجامپذیرفت(شکل3-31).
برای بررسی و مقایسه توانایی باکتریهای نوترکیب مختلف در اتصال به یونهای فلز سنگین،ابتدا کلونهای نوترکیب (pPEYS38cbm2, pPEYS38cbβm2 ,pPEYS66cbm2 ,pPEYS79cbm2 ,pPEYS79cbβm2 , ،pPEYS92cbm2, pPEYS107m2 ,pPEYS107cbβm2) روی محیط CFA آگار حاوی آنتیبیوتیک آمپیسیلین و نمونههای کنترل مثبت pPM4567 روی محیط CFA آگار حاوی آنتیبیوتیک کلرامفنیکل به مدت 20 ساعت کشت شدند. بعد از جمعآوری باکتریها از روی سطح پلیت و دوبار شستشو با بافر Tris-HCl 1mM (pH 7.4)، سلولها توسط سانتریفوژ با دور 5000 الی 7000 رسوب دادهشدند و پس از خشک شدن بصورت شبانه در آون °C 105 و حل کردن در اسیدنیتریک، میزان کادمیوم بوسیله دستگاه جذب اتمی اسپکتروفتومتر اندازه گیری شد (شکل 3-27). همچنانکه ملاحظه می شود سلولهای بیانکننده پیلیهای هیبرید در مقایسه با سلولهای کنترل (سلولهای بیان کننده پیلی طبیعی) مقدار کادمیم بیشتری را جمع کردهاند. میزان جذب کادمیوم در سلولهای بیان کننده پیلی نوترکیب 33/11 تا 9 /13 برابر سلولهای بیان کننده پیلی بدون دستورزی می¬باشد. بنابراین این نتایج بوضوح نشان میدهد که حضور موتیف و بتاموتیف توانایی سویه DH5α برای جمعآوری یونهای کادمیوم را به میزان قابل توجهی افزایش میدهد.

شکل 3-31. مقایسه جذب کادمیوم در سلولهای کنترل و سلولهای نوترکیب. سلولهای کنترل (pPM4567) بیان کننده پیلی طبیعی و سلولهای نوترکیب بیان کننده پیلی نوترکیب می¬باشند.
2-6-2-3 اختصاصیت اتصال
جهت ارزیابی اختصاصیت جذب موتیف های طراحی شده نسبت به کادمیوم ، میزان جذب کادمیوم سلولهای باکتری در حضور فلزات دیگر(2+ Cu2+,Ni وCr2+) نیز بررسی شد. روش آزمایش همانند جذب کادمیوم به تنهایی بود با این تفاوت که اینبار به جای کادمیوم به تنهایی مخلوط نمک فلزات کادمیوم، کروم، نیکل و مس با غلظتهای به ترتیب 12،23، 20 و 18 ماکرومول اضافه گردید همچنانکه در جدول3-4 ملاحظه میگردد سلولهای مهندسی شده میزان کادمیم بیشتری را نسبت به سلولهای کنترل در حضور سایر فلزات جذب مینمایند. با این حال ظرفیت جذب کادمیوم در حضور سایر فلزات کاهش مییابد، که نشان میدهد حضور سایر فلزات اثر بازدارندگی بر جذب کادمیوم دارد و این اثر بازدارندگی در سلولهای کنترل نسبت به سلولهای مهندسی شده مشهودتر میباشد (جدول3-4).

جدول 3- 4. اثر رقابتی یونهای Ni2+ ,Cu2+ و Cr3+ بر جذب کادمیوم در حضور کادمیوم.
سلولهای بیان کننده پیلی

مقدار فلز جذب شده بر حسب نانومول به ازای یک میلی گرم وزن خشک باکتری
(nmol/mg of cells [dry wt])

Cd2+

Ni2+

Cr2+

Cu2+
pEYS38cbm2
24.452±2.72
NDa
ND
ND

pEYS38cbβm2
20.56±2.08
6.729±0.88
48.1908±- b
40.8923±8.95

pEYS66cbm2
19.876±4.29

10.0932±2.56
ND

pEYS79cbm2
22.2504±3.36616

ND
ND
47.318 ±8.08

pEYS79cbβm2
19.6256± 3.0724

ND
ND
ND
pEYS92cbm2
19.8984 ± 1.3388

ND
30.64 ±-
-c
pEYS107cbm2
23.4488 ± 4.72152

ND
19.656 ±-
28.72 ± 5.04

pEYS107cbβm2
16.94384 ± 4.29432

ND
34.28 ±-
31.12 ±5.29
pPM4567(Control)
0.3251± 0.24
2.5233±0.38
20.5314±-
22.8295±1.77
aND, not detectable
b-, not etermined

1-4 مزیت بیان سطحی بر سایر سیستمهای بیان پروتئین
آلودگی به سبب مواد شیمیایی از جمله فلزات سنگین بحرانی است که نتایج بسیار مخرب بر روی بیوسفر داشته است. فراوانترین آلاینده ها در فاضلاب ها و پسماندها، فلزات سنگین می باشند. فعالیت های انسانی مانند استخراج معادن و دفع پسماندهای صنعتی منجر به تجمع فلزات در محیط و سرانجام در زنجیره غذایی شده و مشکلات بهداشتی و اکولوژیکی فراوانی را بوجود آوردهاست. بنابراین حذف فلزات سنگین از فاضلاب ها و چرخه حیات موضوع مهمی در بهداشت عمومی محسوب میشود. روشهایی مانند رسوبدهی، فیلتراسیون و اکسیداسیون و احیا از جمله روشهای متداول در حذف فلزات سنگین از پسابها هستند ولی این روشها توانائی لازم جهت کاهش آلایندهها تا سطح قابل قبول ازلحاظ بهداشتی را ندارند. مطالعات مختلف نشاندادهاست که روشهای زیستی میتواند شرایط اقتصادی و کارآمدتری را در

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد درباره پلاسمیدهای، کلونهای، (B)، ژلآگارز Next Entries پایان نامه ارشد درباره انفورماتیک، روشهای ارزیابی، اکسیداسیون، آرایش فضایی