پایان نامه ارشد درباره زیست محیطی، ساختار فضایی، انفورماتیک، فیزیولوژی

دانلود پایان نامه ارشد

دیگر اینکه این اتصال همچنین نسبت به pH و سایر کلاترهای فلزی مقاوم میباشد(Bae et al., 2003).
در سال 2006، Qin و همکارانش خواص بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی یک پلی پپتید واجد دمین اختصاصی اتصالی به فلز63 (MBD ) را با بیان کردن در سطح سلول و نیز در سیتوزول مورد بررسی و ارزیابی قراردادند. آنها بدین وسیله میخواستند محیطی که در آن جذب اختصاصی رخ میدهد را شناسایی و بررسی نمایند. لذا دمین اتصالی به فلز64 را بصورت فیوز شده با Lpp-ompA تحت کنترل AraC در سطح سلول بیان کردند و توانایی این دمین اتصالی از لحاظ اتصال به فلزات و حفاظت سلول در برابر ا ثرات سمی جیوه را مورد بررسی قرار دادند و مشاهده کردند علاوه بر داشتن تمایل بالا نسبت به جذب جیوه، از اختصاصیت بالایی نیز برخودار هستند بطوریکه که حتی در حضور غلظتهای بالای کادمیوم و روی با تمایل و اختصاصیت بیشتری جیوه را جذب میکردند.
همچنین محققین پپتیدهای اختصاصی را از طریق غربال کتابخانهای که حامل پپتیدهای اتصالی برای نیکل بود، جدا کرده، و نشان دادند اسیدهای آمینه هیستیدین و آرژنین در اتصال به نیکل مشارکت دارند(Kjaergaard et al., 2001, Dong et al., 2006).
در سال 2007 Saffar و همکاران با ارائه هگزا هیستیدین بر روی سطح باکتریE. coli نشان دادند که میزان جذب نیکل و کادمیوم در باکتریهای نوترکیب نسبت به باکتریهای دستنخورده به میزان چشمگیری افزایش مییابد(Saffar et al., 2007).
از این مطالعات میتوان نتیجهگیریکرد که با ارائه پپتیدهای جاذب فلزات سنگین از طریق وارد نمودن و بیان آنها در پروتیئنهای سطحی میتوان فلزات سنگین را از محیط جدا نمود. در میان پروتئینهای حامل ذکر شده، پیلیها نسبت به سایر حاملها امتیازاتی دارند که از آنجمله میتوان به مواردی مانند گسترش به بیرون از غشا، دسترسی آسان به محیط و فراوان بودن تعداد آنها در سطح سلول اشاره نمود. لذا در این مطالعه از پیلی CS3 برای ارائه پپتید خارجی در سطح باکتری E. coli استفاده شدهاست که در ادامه به سازکار تشکیل پیلیهای باکتریایی بطور کلی وجزئیات ساختاری (ژنتیکی و پروتئینی) پیلی CS3 اشاره خواهیم کرد.
لازم به ذکر است علارغم مطالعات وسیعی که در سطح آزمایشگاهی انجام گرفته متاسفانه اکثر این مطالعات فاقد اطلاعات لازم راجع به چگونگی عملکرد جاذبهای زیستی در شرایط متنوع دنیای واقعی هستند لذا تنظیمات بسیار اساسی و مطالعات دقیق جهت توسعه موفقیتآمیز جاذبهای زیستی برای کاربردی کردن آنها موردنیاز میباشد.
14-1 سازکار تشکیل پیلی باکتریایی
زیرواحدهای پیلیها مانند بسیاری از پروتئینهای ساختاری مونتاژی، دارای توالی نشانه انتهای آمینی هستند که امکان انتقال آنها به پریپلاسم را از طریق مسیر ترشحیSec فراهم میکند. بعد از برش توالی نشانه، زیر واحدهای پیلی، پیلین(Pilin) با کمک چاپرون مربوطه، تاخوردگی و ساختار فضایی نهایی خود را بدست میآورند. علی رغم پایین بودن همولوژی بین توالیهای پیلیهای مختلف، همه زیرواحدهای پیلی ساختار شبه ایمونوگلوبینی دارند با این تفاوت که زنجیره بتای موازی با جهت مخالف (زنجیره G) در پیلیها وجود ندارد که همین امر یک شکاف آبگریزی در ساختار زیرواحد اصلی پیلیها بوجود میآورد که بدون حضور چاپرون یا نسخههای زیرواحد اصلی این ساختار ناپایدار میباشد. در پری پلاسم زنجیره بتای G1 چاپرونها (زنجیره دهنده) بصورت موازی وارد شکاف هیدروفوبی شده و بدین ترتیب ساختار غیر کلاسیک شبه ایمونوگلولین بوجود میآورند. انتهای آمینی زیرواحدهای اصلی پیلی، شامل زنجیره β حفاظت شده میباشد که شباهت زیادی به زنجیره بتای دهنده G1 (G1 donor β-strand) چاپرونها دارد. مونتاژ زیرواحدها از طریق واکنش جابجایی که در آن زنجیره بتای انتهای آمینی زیرواحد دوم با آرایش ضدموازی و مطلوب از لحاظ انرژی با زنجیره بتای دهنده G1 متعلق به چاپرون با آرایش موازی جایگزین شده و بدین وسیله ساختارکلاسیک شبه گلوبولینی حاصل میشود. واکنشهای جایگزینی و اتصال زیرواحدهها تا تشکیل فیبرهای کامل ادامه مییابد شکل (1-7).
لازم به ذکر است که فیبرها ممکن است بصورت ساختارهای مارپیچی با دو زیرواحد در هر پیچ (فیبریلهای نازک و قابل انعطاف) سازمان یابند و یا ممکن است فیبرهای بصورت ساختارهای مارپیچی با 3 الی 4/3 زیرواحد در هر پیچ (فیبریلهای ضخیم و شکننده) سازمان یابند. همچنین ممکن است ساختارهای بیشکل و غیررشتهای (کپسولی شکل) را در سطح سلول تشکیل دهند که میتوان به ساختار پیلی CS3 در باکتری E. coli و آنتیژن F1 غشایی در باکتری Yersinia pestis اشاره نمود.
زیرواحدهای اصلی کپسول F1 که Caf1 نامیده میشود از طریق مسیر حفاظت شده چاپرون /آشر(CU/pathways) مونتاژ شده و ساختار بیشکل کپسول را بوجود میآورد. مطالعات ساختاری و عملکردی کمپلکسهای Caf1M-Caf1 و Caf1-Caf1 نشان داد که تشکیل این کمپلکسها با سازکار تشکیل پیلی CS3 یکسان میباشد (جدول1-4). لذا بنظر میرسد اطلاعات بدست آمده و همچنین اطلاعات موجود در زمینه اتصالات ساختاری زیرواحدهای کپسول F1 قابل تعمیم به پیلی CS3 میباشد(Nuccio and Baumler, 2007, Sauer et al., 2000, Sauer et al., 2004, Sauer et al., 2002, Soto and Hultgren, 1999).

الف ب
شکل 1-7. دیاگرام شمایتک از سرهمبندی پیلی توسط مسیر چاپرون و آشر. (الف) در طی انتقال زیرواحدهای پیلی از غشای سیتوپلاسیم (CM)با مسیر عمومی ترشحی(Sec) ابتدا پپتید نشانه انتهایآمینی بریده میشود سپس در پریپلاسم(PP) تاخوردگی شبه ایمونوگلوبولینی زیر واحدهای پیلی با زنجیره دهنده چاپرون (C) کامل میشود (پیکان مشکی). اندرکنش کمپلکسهای زیرواحد پیلی/ چاپرون با پروتئین آشر65 (U) موجب تسهیل جابجایی زنجیره دهنده چاپرون با زنجیره انتهایآمینی دومین زیرواحد میشود و بدین ترتیب زیرواحدها به ساختارهای فیبری سازمان یافته و از غشای خارجی (OM) عبور داده میشوند. همچنانکه که در شکل نشان داده شدهاست برخی از فیلامنتها یک راس یا کلاهک چسبنده در انتهای خود دارند که در اتصال آنها بسیار موثر است. (ب) مکانسیم تشکیل پیلی که تحت عنوان دیاگرام تکمیل زنجیره دهنده خوانده میشود: در طی فرایند تشکیل و سوار شدن زیر واحدهای پیلی ابتدا ملکول چاپرون زنجیره G1(زرد) خود را جهت تکمیل ساختار Ig زیرواحد پیلی (سفید) به اشتراک میگذارد از آنجائیکه این تاخوردگی به صورت غیر مرسوم بوده، زیرا زنجیره G1 در جهت موازی با زنجیره F قرار دارد لذا ساختار حاصل به نام ساختار شبه گلوبولینی نامیده میشود.سپس انتهایآمینی پیلی دوم که در این شکل بصورت یک زنجیره قرمز رنگ (زنجیرهk) نمایش داده شدهاست با زنجیره دهنده چاپرون معاوضه میشود که در نتیجه تاخوردگی و تاخوردگی مرسوم ایمونوگلوبینی تشکیل میشود یعنی گسترش انتهایآمینی در فرمت ضد موازی قرار میگیرد و این فرایند تشکیل ساختار ضدموازی با چاپرون سپس تبدیل به ساختار موازی با جانشین شدن زیرواحد بعدی با چاپرون، تا تشکیل پیلی کامل ادامه مییابد(Sauer et al., 2002, Nuccio and Baumler, 2007).

جدول1-4. ارگانلهای سطحی باکتریایی که از طریق مسیر چاپرون-آشر اسمبل میشوند(Sauer et al., 2000).

1-14-1 پیلیهای باکتریایی و پیلی CS3
پیلیها که فیمبریه هم نامیده می‌شوند، فیبریلهای شبیه مو به اندازه 004/0تا 008/0 میکرون هستند. این ارگانل با میکروسکوپ الکترونی در سطح باکتریهای مختلف قابل رویت هستند. آنها مستقیم‌تر، نازکتر و کوتاهتر از فلاژلها میباشند. این رشته‌ها در غشای پلاسمایی سلول باکتریها لنگر می‌اندازد و به نام اندامکهای اتصالی نیز نامیده میشوند زیرا باکتریها را قادر ميسازند به بافتهاي خاص ميزبان متصل‌شوند. انواع مختلفي از فيمبريه‌ها بخصوص در باکتريهاي گرم منفي شناسايي شده‌است. ساختار يک پیلی شامل صدها زيرواحد يکسان و اصلي است که پیلین نامیده میشود و چند پروتئین کوچک که در اتصال و تجمع پیلی نقش دارند، تشکیل شداست. البته لازم به ذکر است که پروتیئینهای کمکی در همه پیلیها وجود ندارد. زیرواحدهای اصلی پیلی از اندرکنش انتهایآمینی و کربوکسیلی روی هم قرار گرفته و پیلی شکل میگیرد(Soto and Hultgren, 1999)
زیر واحد اصلی پیلی که در ایمنیزایی نیز نقش دارد دارای نواحی بسیار متغیر میباشد. این نواحی نقاط مناسب برای ورود پپتیدهای خارجی میباشند. انواع مختلف پیلی برای کاربرد آن در سیستم نمایش سطحی وجود دارد. در دهههای اخیر طیف وسیعی از پپتیدهای هترولوگ به طور موفقیت آمیز روی پیلیهای مختلف به منظور کاربردهای بیوتکنولوی، واکسنولوژی و اهداف زیست محیطی نمایش دادهشدهاند. جدول 1-5، خلاصهای از اپیتوپ و پپتیدهای نمایش داده شده روی پیلیهای مختلف را نشان میدهد. (Klemm and Schembri, 2000).
از انواع پیلیها میتوان پیلی P fimbriae باکتری E. coli را نام برد که دو ناحیه بسیار متغیر HR1 و4 HR دارد. توالی 8-20 اسید آمینهای از اپیتوپ ویروس FMD(Food and mouth disease virus) بدون ایجاد تغییر در بیوژنز پیلی، وارد این نواحی متغیر شدهاست (van Die et al., 1990).
نوع دیگر پیلی، پیلی تیپ I میباشد. این نوع پیلی به سلولهایی که دارای واحدهای مانوز میباشد، متصل میشود. پیلی تیپ I دارای دو زیرواحد مهم FimH و FimA میباشد که به عنوان حامل اپیتوپ خارجی از آنها استفاده شدهاست(Chen and Schifferli, 2000).
پيلي CS3 که بوسيله بسياري از سويههاي اشريشياکلي مولد انتروتوكسين بيان مي‌شود، به عنوان يک سيستم مناسب عرضه سطحي باکتريايي براي نمايش پپتيدهاي هترولوگ استفاده شدهاست. ساختار اين پيلي مانند ساير پيليها شامل صدها زير واحد اصلي و يکسان است که CstH ناميده مي‌شود(Yakhchali and Manning, 1997) و استراتژي بکارگیری آن مشابه سایر پروتئین‌هایی که بدین منظور استفاده می‌شود، شامل وارد کردن توالي هترولوگ درون محل‌هاي مجاز (مناطق مجاز محلهاي هستند که پپتيدهاي خارجي را،بدون اينکه مداخله‌اي در ساختار و عملکرد پروتئين حامل و پپتیدخارجی داشته باشد، را مي‌پذيرند) و بدین طریق ارائه آن در سطح سلول مي‌باشد(Saffar, 2005, Hedegaard and Klemm, 1989). لذا در برخی از مطالعات از آنها به عنوان حامل مناسبی برای نمایش سطحی باکتریایی پپتیدهای جاذب فلزات سنگین استفاده شدهاست (Saffar et al., 2007, Saffar, 2005). معهذا ساختارهای فوق علاوه بر کادمیوم فلزات دیگر نظیر نیکل، روی و سرب را نیز جذب میکنند. توسعه و بهبود این سیستم جهت جذب اختصاصی یا با تمایل اتصال بیشتر به یک فلز به سبب مزایا و کاربردهايی نظیر افزایش ظرفیت جذب سیستم در رقابت با عناصر دیگر، ساخت سنسورها و نیز استحصال فلز خالص از پسابهای صنعتی و معدنی جهت استفاده مجدد ازآنها در صنایع از اهمیت خاصی برخوردار است.
همچنانکه ذکر شد اسيدهايآمينه ناحيه انتهایآمینی و کربوکسیلی زيرواحد اصلي در ساخت پيلي درگير هستند. ولي بقيه مناطق با توجه به ماهيت اسيدهايآمينه آن مي‌تواند در دسترس محيط و يا مخفي از آن باشد که اين مناطق ميتوانند کانديدايي براي مناطق مجاز بشمار روند. لذا بنظر میرسد آگاهي از مسير آب دوستي پروتئين CstH، ساختار دوم و نیز ساختار سوم زيرواحد CstH براي شناسايي و يافتن مناطقي که بتوانند در سطح پيلي و در دسترس محيط قرار گيرند و پذيراي پپتيد خارجي باشند، بسيار ضروري و سودمند است و امروزه اين اطلاعات توسط ابزارها و روشهای بيوانفورماتيکي استخراج میگردند.
لذا در این مطالعه با بررسی بانک اطلاعاتی، موتیفهای جاذب کادمیوم را استخراج کرده و از طرف دیگر جایگاههای مجاز پذیرش پپتید خارجی (Permesive site) ژن CstH (سابیونیت ساختاری پیلی CS3) را به کمک سرورهای پیشگویی کننده، پیشبینی کرده سپس موتیفهای فوق الذکر را در هر یک از جایگاههای مجاز وارد کرده و با ابزارهای بیوانفورماتیکی امکان در سطح قرار گیری آنها بررسی گردید تا مناسبترین ساختار برای بررسیهای آزمایشگاهی66 حاصل گردد. سپس با فنون مهندسی ژنتیک، توالی موتیف مربوطه جهت جذب اختصاصی

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد درباره ظرفیت جذب، عرضه کننده، لیپوپروتئین، پلاسمایی Next Entries پایان نامه ارشد درباره انفورماتیک، شبکه عصبی، شبیه سازی، منابع طبیعی