پایان نامه ارشد درباره انفورماتیک

دانلود پایان نامه ارشد

(Screening)
پس از انتقال DNA نوترکیب به درون سلول میزبان لازم است که کلونهای حاوی پلاسمید نوترکیب مناسب غربال و انتخاب شوند. به این منظور از چند روش زیر استفاده شد.
الف) غیر فعال شدن ژن حساسیت و مقاومت کلون ها به آنتیبیوتیک: پلاسمیدهای ایجاد شده در این تحقیق حامل ژن مقاومت به آنتیبیوتیک آمپیسیلین میباشند به این طریق، کلونهایی که پلاسمید را در طی ترانسفورماسیون دریافت کردهبودند در محیطکشت دارای آنتیبیوتیک آمپیسیلین رشد کرده و از سایر کلونها جداشدند و در ادامه با استفاده از روشهای دقیقتر کلونهای مورد نظر از سایر کلونها تفکیک شدند.
ب) واکنش PCR: با استفاده از روش PCR وجود قطعه خارجی در حامل و نیز نحوه قرار گرفتن آن در DNA حامل مورد بررسی قرار گرفت. در این روش حداقل یکی از پرایمرها مکمل قطعهخارجی بوده و دیگری یا مکمل انتهای دیگر DNA خارجی و یا مکمل DNA حامل بود. همچنین بررسی وجود DNA خارجی با استفاده از یک جفت آغازگر که مکمل حامل در قبل و بعد از محل قرار گرفتن DNA خارجی بود نیز انجامشد، در نتیجه پلاسمیدهای نوترکیب از سایر پلاسمیدها جدا و انتخاب شدند.
ج) برشآنزیمی DNA با استفاده از آنزیم های برش دهنده اختصاصی: DNA پلاسمیدهای نوترکیب که با روش PCR انتخاب شده بودند با یک یا دو آنزیم برش دهنده ویژه برش دادهشدند و همزمان با آن DNA پلاسمیدی حامل، بهعنوان شاهد با همان آنزیمها برش داده شد. نمونههای برش یافته توسط الکتروفورز روی ژل آگارز بررسی شدند. با مقایسه اندازه قطعات حاصل از برش پلاسمیدهای حامل و نوترکیب، کلونهای واجد قطعه DNA خارجی که سنگینتر هستند از سایر پلاسمیدها جدا شدند.
د) تعیین توالی به عنوان تائید نهایی: انتخاب نهایی کلونهای نوترکیب پس از تعیین توالی آنها و مقایسه توالی ژن cstH نوترکیب با توالی ژن cstH طبیعی و توالی DNA اتصالی به آن انجام گرفت.

11-5-2 بررسی پروتیئنها
1-11-5-2 استخراج پروتیئن پیلی از باکتری
باکتری بیان کننده پیلی ابتدا از ذخیره 70 – بصورت کشت مایع در ویال 2میلیلیتر در حجم 300 تا 500 ماکرولیتر به مدت 16 ساعت کشت شدند
2- سپس 100 میکرولیتر از کشت مایع به محیط کشتAgar CFA منتقل شد و بمدت 20 ساعت در دمای C° 37 انکوبه گردید
3- باکتریهای رشد یافته با کمک لوپ شیشهای از روی پلیت جمع آوریشد و به ویالهای حاوی 1 میلیلیتر PBS منتقل شد وپس از مخلوطکردن، سوسپانسیون سلولی به مدت 20 تا 30 دقیقه در دمای C° 60 قرار داده شد.
4- سوسپانسیون سلولی حرارت دیده بمدت یک دقیقه ورتکسگردید.
5- با سانتریفوژ در دورrpm 11000 بهمدت 15 دقیقه و در دمای اتاق سلولهای باکتری رسوب دادهشدند.
6- محلول رویی که حاوی پیلی است برداشتهشد و به آن TCA با غلظت نهایی 12 درصد اضافهگردید و به آرامی تکان دادهشد تا مخلوطگردد سپس به مدت یکساعت بر روی یخ قرار دادهشد.
7- مخلوط فوق بمدت 15 دقیقه با دور rpm 13000 سانتریفوژ گردید تا پروتئین پیلی رسوب کند.
8- رسوب پروتئین پیلی درتریس بازی mM 100 حل گردید و تا زمان مصرف در دمای ºC20- نگهداریشد.
2-11-5-2 سنجش پروتیئن به روش برادفورد(Baradford)
روش برادفورد نسبت به روشهای لوری و بیوره سادهتر و سریعتر میباشد. در این روش رنگ کوماسیبریلیانتبلو G-250مستقیما با پروتئین ترکیب شده و میتوان جذبنوری آن را در 595 نانومتر اندازه گیری نمود(Bradford, 1976).
1-2-11-5-2 رسم منحنی استاندارد پروتئین
محلول استاندار پروتیئن (BSA,Bovin Serum Albumin) با رقتهای 1/. تا 9/. میلی گرم در میلیلیتر و یک لوله به عنوان شاهد حاوی یک میلیلیتر آب مقطر تهیهشد. نمونه مورد آزمایش نیز در چند رقت تهیه گردید، سپس به هر لوله 5 میلیلیتر از معرف آماده شده اضافهگردید. پس از ورتکس کردن، نمونهها در طول موج 595 نانومتر در مقابل شاهد خواندهشد. پس از رسم منحنی استاندارد پروتئین غلظت نمونه از روی منحنی محاسبهگردید.
3-11-5-2 وسترنبلاتینگ (Western Blotting)
برای بررسی وجود یک پروتئین خاص در یک نمونه، از واکنش اختصاصی آنتیژن با آنتیبادی استفاده میشود. اگر این آنتیبادی به آنزیمی متصل باشد که بتواند یک سوبسترا را به محصول رنگی تبدیل نماید، آنتیژن قابل ردیابی و آشکارسازی است. اساس وسترنبلات نیز همین واکنش است. ابتدا نمونههای مورد نظر با استفاده از ژل SDS-PAGE الکتروفورز شد. ژل به مدت حداقل 10 دقیقه در بافر انتقال قرارداده شد.
سپس غشاء PVDF (polyvinylidene difluoride microporous membrane filters) و نیتروسلولز را به اندازه ژل بریده و به ترتیب در متانل به مدت یک دقیقه، آب مقطر 5-7 دقیقه و بافر انتقال تازه تهیه شده به مدت 10 دقیقه قرار دادهشد، چند لایه کاغذ صافی با ابعاد مناسب با ژل بریده و در بافر خیس گردید سپس اجزای فوق از پایین به بالا شامل اسفنج، چند لایه کاغذ صافی، ژل، غشاء، چند لایه کاغذ صافی و لایه اسفنج روی هم قرار داده شد. پس از گذاشتن هر لایه حبابهای هوا به کمک غلتک مخصوص ازحد فاصل لایهها خارج گردید و درون تانک مخصوص به گونهای قرار دادهشد که ژل به طرف قطب منفی و غشا PVDFیا کاغذ نیتروسلولز به طرف قطب مثبت باشد. سپس مجموعه را به اتاق سرد منتقل کرده و شدت جریان 40 میلیولت در بصورت شبانه برقرارگردید تا پروتئینها از روی ژل به غشاء انتقال یابند مراحل وسترنبلاتینگ به ترتیب زیر انجامشد.
1- با استفاده از بافر Blocking، مناطق فاقد پروتئین غشا به مدت 1 ساعت در دمای اتاق بلوکهگردید.
2- با استفاده از بافر شستشو غشا برای سه تا چهار بار شستهشد.
3- آنتیبادی اولیه علیه CS3 با تراکم مناسب (1:1000) به غشاء اضافهگردید و به مدت 2 ساعت در مجاورت آنتیبادی در دمای اتاق قرارگرفت.
4- شستشو مانند مرحله 2 انجامگرفت.
5- آنتیبادیثانویه (Goat anti Rabbit-HRP) با نسبت مناسب (1:3000) به مدت حداقل یک ساعت به غشا اضافهشد.
6- شسشو مانند مرحله 2 انجام گرفت
7- 10 میلیلیتر محلول شستشو، 2 میلی لیتر محلول سوبسترا و 15-30 میکرولیتر آب اکسیژنه 30 درصد با هم مخلوط گردیده و بر روی غشاء اضافه شد. پس از انجام واکنش و ظهور باندها، غشاء شستشو دادهشد(Dunbar, 1994).

4-11-5-2 لکهگذاری برای سلولهای باکتری
برای بررسی سریع حضور یک پروتئین خاص در نمونه از عمل لکه گذاری (Dot Blotting) استفاده شد. این عمل همانند وسترنبلات میباشد با این تفاوت که:
نمونه های باکتری یا پروتئینی به جای اینکه ابتدا بر روی ژل SDS-PAGE الکتروفورز شوند، مستقیما بر روی کاغذ نیتروسلولز به صورت لکه گذاشتهشدند. مقدار 2-5 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری با تراکم 6/. الی 6/ 1 =A600 nm یا 5-10 میکرولیتر از پروتئین پیلی روی کاغذ نیتروسلولز قرار داده شد و تمام مراحل مربوط به وسترنبلاتینگ (مراحل 1 تا 7 قسمت قبل) عینا انجام شد و در نهایت بعد از آشکارسازی (مرحله 7) پروتئین بصورت لکههایی بر روی کاغذ ظاهرشد(Rodas et al., 2011).
12-5-2 رنگ آمیزی ایمینوفلوروسنس
برای نمایش پپتید یا پروتئین خاص روی سطح باکتری می توان از رنگ آمیزی ایمینوفلوروسنس استفاده کرد. روش کار بدین شرح است.
1- از کشتشبانه باکتری در محیط مایع، 100 میکرولیتر روی محیط CFA آگار کشت شد سپس بعد از 18- 20 ساعت کشت شبانه، سوسپانسیون سلولی تهیه شده و حدود 3-5 میکرولیتر از آن روی لام میکروسکوپ گسترش تهیهشد
2- با قرار دادن لام در محیطخشک بصورت شبانه در دمای اتاق باکتریها روی لام تثبیت شدند.
3- با مقدار 50-100 میکرولیتر از آنتیبادی اولیه (رقت 1:1000 در بافر PBS) سطح نمونه پوشانده شد. آنتیبادی اولیه در این تحقیق پلیکلونال آنتیبادی بر علیه CS3 بود.
4- لام به مدت یک ساعت در دمای اتاق انکوبهشد.
5-سپس چند بار با بافر PBS شستشو دادهشد.
6- سطح نمونه با آنتیبادیثانویه که کانجوگه با فلوروسین است. با رقت 1:20 در بافر PBS پوشانده شد.
7- سپس لام به مدت یک ساعت در دمای اتاق انکوبه شد.
8- شستشو مانند مرحله 5 انجام گرفت.
9- سلولهای رنگ شده زیر میکروسکوپ فلوروسنت قابل مشاهدهبودند(Peiser et al., 2000).

13-5-2 بررسی میزان جذب یون فلز
بررسی توانایی سلولهای باکتری در اتصال به یونهای فلزات سنگین توسط دستگاه جذب اتمی (Shimadzu) AA670/G انجامشد. مراحل کار بدین شرح است
1- باکتری مورد نظر روی پلیت CFAآگار کشت دادهشد.
2- باکتریهای رشد یافته از روی سطح پلیت جمع آوریشدند.
3- سلولها در دو مرحله با بافر pH:7.4 1mM Tris-Hcl شستشو دادهشدند.
4- سپس سلولها در 10 میلیلیتر بافر فوق سوسپانسیون شده و OD600 آنها اندازه گیری شد.
5- بر اساس ارتباط بینOD600 و وزن تر سلول( بر اساس گزارشات موجود OD600 برابر 1 معادل 200 میلیگرم وزن تر باکتری می باشد)، 200 میلی گرم باکتری در 40 میلیلیتر بافر دارای مقدار معین از فلز سنگین سوسپانسیون شد.
6- سوسپانسیو سلولی در بافر دارای فلز سنگین در شیکرانکوباتور با دور rpm100در دمای °C30 به مدت 10-15 دقیقه انکوبهگردید.
7- سپس سلولها با سانتریفوژ دور پایین رسوب داده شدند.
8- رسوب سلولی به صورت شبانه در آون با دمای°C 105 خشک شد.
9- وزن خشک سلول اندازه گیری شد سپس به ازای هر 4 میلی گرم باکتری خشک، 500 میکرولیتر اسیدنیتریک 65% به رسوبات اضافهشد و یک ساعت در بن ماری دمای جوش انکوبهگردید.
10- غلظت هریک از فلزات کادمیوم، مس، نیکل و کروم به ترتیب در طول موجهای8/228،8/324،232 و 9/357 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتری مدل (Shimadzu) AA670/G اندازه گیریشد.

14-5-2 ویژگیهای پلاسمیدهای استفادهشده در این مطالعه
اپرون کامل پیلی CS3 به نام (cst) از E.coli مولد انترتوکسین از سویه PE486 در جایگاه برش آنزیمی HindIII پلاسمید pBC قرار دادهشده و بدین ترتیب پلاسمید pPM4567 با اندازه حدود 8Kbp حاصل شد( شکل2-4)،که بعلت بزرگی اندازه آن کار با آن سخت بوده لذا زیرواحد اصلی پیلی (CstH) بطول حدود bp655 که سازنده واحدهای پلیمر پیلی بوده و بهعنوان ژن یا پروتئین ناقل تحت دست ورزی قرار میگیرد بطور جداگانه در پلاسمید pBSK کلون و پلاسمید pPM4555 ایجاد گردید(Yakhchali 1996) (شکل2-4).

شکل2-4. نقشه ژنتیکی پلاسمیدهای دارنده ژن کامل اپرون cst (pPM4567) و ژنcstH (pPM4555).

15-5-2 بررسی های آماری
در تمامی آزمایشات که نیاز به بررسیهای آماری داشت از نرمافزار SPSS و از آزمونهای موردنظر استفادهشد. جهت رسم نمودارها از نرمافزار Excel استفاده شد.

1-3 نتایج بررسی های بیوانفورماتیکی
مقدمه
امروزه مطالعات بیوانفورماتیک یکی از ابزارهای کارآمد در تکنولوژی مهندسی ژنتیک جهت پیش بینی، طراحی، و ساخت پروتئینهای هیبرید جاذب فلزات سنگین (کادمیوم) محسوب میشود در این مطالعه با بررسی بانکهای اطلاعاتی، موتیفهای متصل شونده به کادمیم را شناسایی کرده و از طرف دیگر جایگاههای مجاز پذیرش پپتید خارجی (Permesive Site) ژن cstH (زیرواحد ساختاری پیلی CS3) را به کمک سرورهای پیشگویی کننده، پیشبینی و سپس موتیفهای فوق الذکر در هر یک از جایگاههای مجاز وارد شده و با نرمافزارهای کامپیوتری امکان در سطح قرار گیری آنها را بررسیشد. سپس با فنون مهندسی ژنتیک، توالی موتیف های مربوطه در ژن cstH، کلون و پیلی CS3 هیبرید حاوی موتیف و در سطح باکتری عرضه گردید و جذب فلزات توسط این سیستمها با کمک روش های مناسب مورد مطالعه قرارگرفت.

1-1-3 شناسایی و طراحی موتیف(پپتید) متصل شونده به فلزات
باکتریهای مقاوم به فلزات کاربرد فراوانی در پاکسازی زیستی دارند که این توانایی توسط سه سیستم متفاوت، که در بخش مقدمه به آنها اشاره شد، ایجاد می شود.
در این تحقیق موتیف(های) اتصال به کادمیوم از طریق جستجوی نام این فلز در پایگاهداده Prosite بدست آمد (Falquet et al., 2002).
Prosite، پایگاهدادهای برای موتیفها و پترنهاست. از جستجو برای موتیفهای متصل شونده به کادمیوم در این پایگاه چهار سند به شرح زیر بدست آمد:
1- PDOC00661 پروفایل و نشان دمینArsR-type

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد درباره ماهیت کار Next Entries پایان نامه ارشد درباره مدل سازی