پایان نامه ارشد درباره انفورماتیک، مدل پیشنهادی، سوخت و سازی، عرضه کننده

دانلود پایان نامه ارشد

(B)
شکل 4- 1. ساختار دمین متصل شونده به فلز واقع در انتهای آمینی پروتئین CadA باکتری لیستریا مونوسیتوژن و مدل پیشنهادی برای نحوه پیوند فلز با موتیف. (A) موتیف اتصالی به کادمیوم از این دمین استخراج شدهاست. اتصالات واندروالس که دربردارنده اسیدهایآمینه هیدروفوب میباشند به رنگ آبی مشخص شدهاند، لیگاندهای پروتئینی به رنگ زرد نشان دادهشده و برخی از اسیدهایآمینه بسیار حفاظت شده به رنگ قرمز نمایش دادهشدهاند. به موقعیت فضایی سیستئین 14 و 17 و همچنین گلوتامین 61 توجه نمائید. (B) مدل پیشنهادی برای اتصال فلز به موتیف متصل شونده به فلز کادمیوم، خطوط شکسته نشانگر فواصل زیاد بین Cd-S میباشد (Banci et al., 2006)

3-4 مقایسه موتیفهای طراحیشده جهت جذب یون کادمیوم توسط باکتریهای نوترکیب ساختهشده در این پروژه با مطالعات پیشین
تخلیه فلزات سنگین ناشی از فعالیت های کشاورزی، صنعتی و دفاعی، محیطزیست را با خطرات جدی مواجه نمودهاست. روشهای مرسوم جهت زدودن آلایندهها از آب در حد استاندارها کافی نبوده، لذا تحقیقات بیشتری را در این حوزه می طلبد که پروژه اخیر یک نمونه از تحقیقاتی است که بر روی توسعه جاذبهای زیستی با تمایل، ظرفیت و اختصاصیت بالا جهت جذب کادمیوم متمرکز شدهاست.
موجودات یوکاریوتی میزان فلزات آزاد فعال را از طریق محبوس کننده های داخل سلولی کنترل می کنند. گلوتاتی(GSH)، فیتوکلاتین وابسته به گلوتاتیون (PCs) و متالوتیونینهای غنی از سیستئین (Winklemann and Winge, 1994) از عمده پپتیدهای محدود کننده فلزات هستند که بوسیله سلولها بکار گرفته میشوند. تلاشهای پیشین برای تولید این پپتیدها در باکتری E. coliبرای افزایش توانایی خاصیت اتصال فلزی آنها در برخی موارد موفقیت آمیز بودهاست. به عنوان مثال نشان داده شدهاست که باکتریهای E .coli بیان کننده MTهای نوروسپورا کراسا میتوانند بطور کارآمدی مس، کادمیوم و سایر فلزات را جذب کنند. با این حال بیان این پروتئینهای غنی از سیستئین بدلیل تداخل با مسیر اکسیداسیون و احیا در سیتوزول چندان هم بیاشکال و موفقیتآمیز نیستند (Pazirandeh et al., 1998, Bardwell, 1994) و مهمتر اینکه، بیان داخل سلولی MTها مانع از استفاده مجدد جاذب زیستی به سبب گیر افتادن آنها میشوند .(Gadd and White, 1993)یک رویکرد هوشمندانه برای گذر از این موانع، بیان سطحی متالوتیونینها بودهاست. با این حال استفاده از پپتیدها و پروتئینهای برزگی که در طبیعت برای جذب فلزات بکار میرود چندان هم موفقیت آمیز نبودهاست زیرا علاوه بر مشکلات بیان این پروتئینها در پروتئینهای سطحی(به دلیل اندازه بزرگ آنها)، بیان آنها از لحاظ سوخت و سازی نیز هزینه زیادی را دربردارد. لذا طراحی از ابتدا104 پپتیدهای مختلف متصلشونده به فلز راه حل دیگری میباشد که توسط گروهی از محقیقین جهت افزایش تمایل و اختصاصیت جذب فلزات بکار رفتهاست(Sousa et al., 1996) and Samuelson et al., 2000, Kotrba et al., 1999b). برای مثال نشان داده شدهاست پپتیدهای با توالیهای غنی از سیستئین و هیستیدین که با تمایل و افنیتی بالایی به Cd2+ و Hg2+ متصل میشوند. در سال 1996، Sousa وهمکارانش با قرار دادن یک یا دو دسته هگزا هستیدین در پروتئین LamB نشان دادند. سویههایی که هیستیدین را در سطح خود ارائه مینمایند به میزان 11 بار بیشتر از سویههای بدون آن کادمیوم را جذب مینمایند. در مطالعه دیگری Mejare و همکارانش در سال 1998، پپتید His-Ser-Gln-Lys-Val-Phe را در پروتئین OmpA کلون و در سطح باکتری E. coli بیان کردند. نتایج نشانداد سلولهایی که این پپتید را بیان میکنند در محیط سمی دارای CdCl2 میتوانند رشدکنند، که این امر حاکی از آنست که اتصال کادمیوم به پپتید ارائه شده در سطح مانع از سمیت آن میگردد(Mejare et al., 1998). همچنین نشان دادهشد که سلولهای بیانکننده سایر توالیهای غنی از هیستدین (Gly-His-His-Pro-His-Gly) و سیستئین (Gly-Cys-Gly-Cys-Pro-Cys)- با تمایل بیشتری نسبت به سایر عناصر دو ظرفیتی به جیوه متصل میشوند. همچنین آنها نشان دادند با ورود این توالی غنی از سیستئین (MBSs) در ژنLamB میزان جذب یون کادمیوم از nmol/mg125 وزن خشک باکتری در نمونه های کنترل به nmol/mg227 وزن خشک باکتری رسیدهاست بعبارت دیگر باکتریهای نوترکیب افزایش 8/1 برابری جذب کادمیوم نسبت به سلولهای کنترل نشان میدهند.
Xu و Lee در سال 1999 توالی هگزاهیستیدین را با تعداد 1،2 ،3 و6 عدد وارد پروتئین OmpC باکتری E. coli نمودند. میزان جذب کادمیوم در این باکتریهای نوترکیب به ترتیب 1/26 ،9/23، 9/18و nmol/mg32وزن خشک سلول در مقایسه با باکتری طبیعی با میزان جذب nmol/mg3/10 بود (Xu and Lee, 1999).
Samuelson و همکارانش در سال 2000 باکتریهای نوترکیب S.xylosus و S.carnosus ایجاد کردند که روی دیواره سلولی آنها پپتید هگزاهیستیدین با دو نوع توالیHis3-Gly-His3 و His6 بیان میشد. این باکتریهای نوترکیب قادر به جذب یونهای نیکل و کادمیوم بودند(Samuelson et al., 2000).
دسته دیگری از پپتیدهای متصل شونده به فلزات سنگین، فیتوکلاتینهای سنتزی (Glu-Cys)nGly میباشند که تمایل بیشتری نسبت به MTها جهت اتصال به کادمیوم دارند.در سال 2000، Bae و همکارانش فیتوکلاتینهای سنتزی (Glu-Cys)n Gly) را جهت افزایش جمع آوری زیستی Cd+2 استفاده کردند آنها بدین منظور ژنهای سنتزی آنالوگهای فیتوکلاتین با توالیهایEC8 (n = 8), EC11 (n = 11), و EC20 (n = 20))به ژن Lpp-ompA متصلکرده و در سطح باکتری E. coli عرضه نمودند و در کار دیگری EC20 را بصورت پریپلاسمی در باکتری بیانکردند . نتایج نشان داد که میزان جذب یون کادمیم در سلولهای نمایش دهنده EC8 و EC20 به ترتیب nmol/mg18 و nmol/mg 60 وزن خشک باکتری میرسد همچنین میزان جذب سلولهای عرضهکننده EC20 بصورت سطحی نسبت به سلولهای عرضه کننده EC20 بصورت پریپلاسمی 2 برابر بود(Bae et al., 2000). در سال 2002 Bae و همکارانش فیتوکلاتین سنتزی EC20 را با استفاده از Lpp-OmpA روی سطح باکتری E.coli بیان کرده ونشان دادند که بیان پروتیئن هیبرید باعث افزایش جذب کادمیوم و جیوه میگردد.(Bae et al., 2002).
Valls و همکارانش در سال 2000 برای اولین بار متالوتیونین را جهت جذب کادمیم از خاکهای آلوده در سطح باکتری Ralstonia eutropha بیان کردند در این مطالعه توالی DNA کد کننده متالوتیونین به دومین β اوتوترانسپورتر، پروتئاز IgA از Neisseria gonorrhoeae متصل شد و بدین ترتیب پروتئین هیبرید به سطح غشای خارجی هدایتگردید. نتیجه این بررسی نشانداد که سویه دستکاری شده ژنتیکی eutropha R. مقدار بیشتری کادمیم را از محیط مایع جمع میکند و جالب اینکه تلقیح eutropha R. بیان کننده متالوتیونین به خاک آلوده به کادمیم بطور قابل ملاحظهای سمیت این فلز برای گیاه تنباکو را نیز کاهش داد(Valls et al., 2000). تحقیق دیگری در سال 2006 جهت بررسی اثر بیان EC20 در باکتری سودوموناس حاکی از افزایش جذب کادمیم میباشد (Saleem et al., 2008).
در بررسی دیگری در سال 2006، Deng و همکارانش سیستم انتقال یون کادمیوم را به همراه متالوتیونین در باکتری E .coli بیان کردند و نشاندادند که در باکتریهای مهندسی شده میزان جذب کادمیوم نسبت به باکتری کنترل 6 برابر افزایش مییابد. جدول4-1 خلاصهای از مقایسه میزان جذب یون کادمیوم در اثر ورود پپتید در سیستمهای مختلف و نتایج این مطالعه نشان میدهد.
در اکثر این مطالعات که اغلب هم از متالوتیونینها، فیتوکلاتینهای سنتزی و پپتیدهای غنی از سیسئین و هیستیدین استفاده میشود اشکال عمده این پپتدها فقدان اختصاصیت در آنها میباشد که منجر میشد سیستم نتواند بین کاتیونهای مانندCd2+ ، Hg2+، Pb2+ ، Cu2+ و Zn2+ تفکیک قائل شود. این امر مشکلات زیادی را بخصوص در بازیافت فلزات بوجود می آورد .(Saleem et al., 2008) به عنوان مثال MBP استفادهشده در این تحقیقات علاوه بر جذب کادمیوم، فلزاتی مانند مس و نیکل را نیز به همان میزان یا در مقادیر بیشتری جذب مینماید (5/276، 2/656 و 4/1137 به ترتیب برای یونهای نیکل، کادمیوم و مس) (Saffar et al., 2007). در برخی موارد برای رسیدن به اختصاصیت از ارائه کتابخانه پپتیدی روی سطح ریزسازوارههای استفاده میکنند که این روشها علارغم مهیا کردن امکان گزینش لیگاندهای جدید و اختصاصی Ahalya N, 2003, Bae, 2000)) ولی به سبب اینکه هزینه و زمان زیادی باید صرفشود، مطلوب نمیباشند. بطورکلی از این نتایج میتوان چنین استنتاج کرد که شاید بکارگیری موتیفهای اختصاصی جهت حذف اختصاصی فلزات بهترین و مناسبترین راه حل برای برطرف کردن این نقیضه باشد و بتواند با اختصاصیت و تمایل بیشتری یون کادمیوم را جذب نماید و در حذف و پالایش آلودگی پسابهای حاوی این دسته از فلزات بکاررود. لذا در این مطالعه ما روشهای مهندسی ژنتیک را با دیدگاهها و مسیرهای بیوانفورماتیکی تلفیق کرده و در نتیجه موتیفهای اتصالی اختصاصی به فلزات سنگین را طراحی کردیم و نشان دادیم نه تنها باکتریهای دارای پلاسمید های نوترکیب کادمیوم بیشتری نسبت به سویههای کنترل فاقد موتیف جذب میکنند بلکه نسبت به کادمیوم اختصاصی نیز عمل میکنند. نکته قابل تامل در موتیفهای استفادهشده در این تحقیق علاوه بر ویژگی خاص آنها، وجود دو اسیدآمینه سیستئین و همچنین اندازه نسبتا بزرگ آنها (27 و 41 اسیدآمینهای) میباشد. بررسی های نتایج وسترن بلات پیلیهای نوترکیب نسبت به پیلی وحشی نشان میدهد که میزان بیان پیلیهای نوترکیب در حدود یک هشتم تا یک دهم پیلی های وحشی میباشد. لذا با توجه به مطالب ارائهشده در بخشهای قبلی مبنی تاثیر ترکیب اسیدآمینهای و اندازه پپتیدهای ورودی بر میزان بیان، در اینجا نیز احتمالا کاهش بیان متاثر از حضور اسیدهایآمینه سیستئین و همچنین اندازه تا حدی بزرگ پپتیدهای بیانی میباشد. بنابراین به نظر میرسد که اگر مقدار مساوی از پیلیهای موتانت و نیز پیلیهای دست نخورده در یک آزمایش جذب فلز استفادهگردد میزان جذب کادمیوم پیلی موتانت نسبت به پیلی دست نخورده بسیار بیشتر میگردد.

4-1. مقایسه میزان جذب یون کادمیم در سیستمهای نمایش سطحی مختلف و نتایج حاصل از این تحقیق
منابع
میزان جذب یون کادمیم
( nmol/mg of cells [dry wt])
پپتید وارد شده
سیستم نمایش دهنده
(Bae et al.2000)

60
(Glu-Cys)20Gly
Lpp-OmpA
(Bae et al.2000)

18
(Glu-Cys)8Gly
Lpp-OmpA
(Tafakori et al 2012)

20.35
SmtA-ChBD
Lpp-OmpA
(Tafakori et al 2012)

26.4
MtnA-ChBD
Lpp-OmpA
Sousa et al.1996

7±2
(His6)1
LamB
(Xu &Lee.1999)
18.9.
(His6)1
OmpC
(Xu &Lee.1999)

26.1
(His6)3
OmpC
(Xu &Lee.1999)

32
(His6)6
OmpC
(Saffar.2005)

652
(His6)1
CS3
(Saffar.2005)

510
MBP
CS3
(Kotrba et al.1999)

196
(HP)1
LamB
(Sousa et al.1998)

30±4
Metallothionein
LamB
This work

173.6
a38cbm
CS3
This work

141.6
38cbβm
CS3
This work

103.2
66cbm
CS3
This work

177.6
79cbm
CS3
This work

127.2
79cbβm
CS3
This work

206.4
92cbm
CS3
This work

204.8
107cbm
CS3
This work

137.6
107cbβm
CS3

در چند مورد آخر عدد موجود در نام پپتید وارد شده، نشاندهنده شماره اسید آمینه محل ورود پپتید جاذب فلز سنگین میباشد

همچنانکه که پیشتر نیز اشارهشد هدف اصلی این تحقیق همراه کردن روشهای نوین بیوانفورماتیکی با متدهای مهندسی ژنتیک جهت طراحی موتیفهای اختصاصی اتصالی به فلزات و یافتن مکانهای مجاز ورود این پپتیدها درپیلی CS3 و عرضه آن در سطح باکتریE .coli به منظور جذب و حذف فلزات سنگین (کادمیوم) بود که با موفقیت انجام پذیرفت. اما بهینه سازی رشد باکتری، افزایش میزان جذب فلزات، تثبیت باکتری، مشاهده فلزات انباشت شده با میکروسکوپ الکترونی، تثبیت باکتری، تهیه بیوفیلترو در نهایت کاربردی کردن استفاده از این باکتری در تصفیه فاضلاب های

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد درباره انفورماتیک، روشهای ارزیابی، اکسیداسیون، آرایش فضایی Next Entries پایان نامه ارشد درباره انفورماتیک