پایان نامه ارشد درباره انفورماتیک، روشهای ارزیابی، اکسیداسیون، آرایش فضایی

دانلود پایان نامه ارشد

مقایسه با بسیاری از روشهای فیزیکوشیمیایی فراهمکند. لذا استفاده از عوامل زیستی برای حذف (و نیز باز یافت آنها) از آبهای آلوده سالهاست که مورد بررسی قرارگرفته و طی سالهای اخیر کاربرد تکنولوژی میکروبی و نیزتوسعه جاذبهای فلزی با تمایل و قدرت انتخاب بالا جهت حذف فلزات سنگین از محیطهای آلوده مورد توجه قرارگرفتهاست.(Kurodaet al., 2010 Wernerus et al., 2004,) مهندسی ژنتیک میکروبهای بیان کننده پروتئینهای جاذب فلزات سنگین افق جدیدی را در تحقیقات حذف زیستی گشودهاست.
بیان داخلی و پریپلاسمی پپتیدهای جاذب فلزات در میکروبهای تراریخت هرچند باعث افزایش خاصیت جذب فلز در باکتری شدهاست، اما بیان داخل سلولی این پروتئینها و پپتیدها در باکتریها با مشکلاتی مانند کاهش استفاده مجدد103 از جاذبهای زیستی (به سبب رهایی و آزادسازی کند و آهسته فلزات تجمعیافته) و نیز تداخل پروتئینهای غنی از سیتئین با سیستمهای اکسیداسیون و احیای موجود در سلولهای میکروبی و در نتیجه مرگ سلول، مواجه بودهاست. لذا میبایست روشهای دیگری جهت استفاده میکروبی اتخاذکرد (Bae et al., 2000, Kotrba et al., 1999b, Kuroda et al., 2010)
بیان سطحی میکروبی امکان بیان پروتئینهای کارا و فعال را روی سطح میکروبها امکان پذیر ساختهاست و از زمان گزارش اولین سیستم عرضه سطحی در اواسط 1980، انواعی از سیستمهای جدید برای عرضه باکتریایی گرم منفی و گرم مثبت و مخمرها گزارش شدهاست. مهندسی سطح سلول به عنوان یک فناوری جدید با کاربردهای بالقوه در واکسنهای زنده، کنترل زیستی پاتوژنها، توسعه و بهبود بیوکاتالیستها و غربالگری کتابخانههای پپتیدی مورد توجه قرار گرفتهاست و در دهههای اخیر، بیان سطحی پروتئینهای هترولوگ جهت افزایش جذب آلایندههای شیمیایی و بخصوص حذف فلزات سنگین حوزه جدید و پرطرفداری را در تحقیقات زیستی بوجود آوردهاست (Kuroda et al., 2010, Bae et al., 2000, Qin et al., 2006)

2-4 کاربرد پیلی CS3 جهت نمایش سطحی و نقش مطالعات بیوانفورماتیکی در شناسایی مناطق مجاز ورود پپتیدهای بیگانه در آن
انواع مختلفي از تاژک‌ها بخصوص در باکتريهاي گرم منفي شناسايي شده‌است. پیلی‌ها ارگانل‌هاي اتصالي باکتريها هستند که آنها را قادر ميسازد به بافتهاي خاص ميزبان متصل‌شوند. اين ساختارهاي نخ مانند طويل به تعداد زیادی در سطح سلول وجود دارد .(Hedegaard et al., 1989) ساختار يک فيمبريه شامل صدها زيرواحد يکسان و اصلي است که بطور عمده از طريق اندرکنش اسيدهاي آمينه انتهای آمینی و کربوکسیلی روي هم قرارگرفته و پيلي بیشکل را بوجود میآوردند ( (Schembri et al., 2000a, Schembri et al., 2000b, Soto et al., 1999 (شکل1-7).
در باکتریهای گرم منفی پروتئینهای غشای خارجی و ارگانلهای پلیمری سطحی یعنی تاژک و پیلی بیشترین تحقیقات و کاربرد را متوجه خود نمودهاند. بیان قطعات پپتیدی روی سطح باکتریهای گرم منفی کاربردهای هیجان انگیزی برای آنها در زیست فناوری، کاربردها و تحقیقات داروسازی و پزشکی، رقم زدهاست. سیستمهای بیانی بر پایه تاژکها و پیلیها دارای امتیازاتی نسبت به سایر سیستمهای پروتئینی غشای خارجی هستند که از آنجمله میتوان موارد زیر را برشمرد. (1) پیلیها به تعداد زیادی در حدود نیم میلیون در سطح سلول بیان می شوند از اینرو زمانی که عرضه سطحی با ظرفیت بالا مورد نیاز است، هیچکدام از سیستم های باکتریایی توانایی رقابت با سیستم های پیلی و فلاژل را ندارند، (2) آنها ایمونوژن های قوی میباشند، (3) پیلیها دارای خاصیت چسبندگی هستند و میتوانند باکتریها را برروی سطوح تثبیت نمایند و (4) مهمتراینکه برخلاف سایر سیستمهای غشای خارجی، براحتی میتوان پیلیها را از سطح باکتری جدا و خالص کرد. تاکنون بیشترین استفاده از ارائه پپتیدی جهت توسعه واکسنهای نوترکیب بوده است. با این حال پتانسیل بکارگیری این تکنولوژی برای توسعه و سایر کاربردها مانند ساخت کتابخانه تصادفی و یا در جهت ساخت و تولید کاتالیستها و نیز جاذبهای زیستی وجوددارد.
اگرچه انواع مختلف و متنوعی از توالیهای هترولوگ در پیلیها ارائه شدهاند ولی محدویتهایی نیز در استفاده از این ساختارها در ارتباط با اندازه و ترکیب پپتیدهای ورودی وجود دارد که شامل (1) پپتیدهای ارائه شده میبایست ترجیحا هیدروفیل و ضرورتا فاقد توالیهای سیستئین باشند. زیرا پروتیئن های دارای پلهای گوگردی(S-S) در عبور از دیواره سلولی دچار اختلال میشوند. (2) گزارشات نشان میدهد پروتئینهای ساختاری اکثر پیلیها، توالیهای با اندازه نسبتا متوسط (اسیدآمینه 10±30) را بدون عکسالعمل خاصی پذیرفته و در سطح سلول ارائه مینمایند ولی پپتیدهای خارجی بزرگ عملکرد آنها را تحت تاثیر و تخریب قرار میدهند.
پيلي CS3 که بوسيله بسياري از سويههاي اشريشياکلي مولد انتروتوكسين بيان مي‌شود، به عنوان يک سيستم مناسب عرضه سطحي باکتريايي براي نمايش پپتيدهاي هترولوگ مانند اپي‌توپ‌هاي متصل شونده به فلزات استفاده شده‌است. ساختار اين پيلي مانند ساير پيليها شامل هزاران زير واحد اصلي و يکسان است که CstH ناميدهمي‌شود(Yakhchali and Manning, 1997) و استراتژي بکارگیری آن مشابه سایر پروتئین‌هایی که بدین منظور استفاده می‌شود، شامل وارد کردن توالي هترولوگ درون محل‌هاي مجاز و بدین طریق ارائه آن در سطح مي‌باشد (Hedegaard et al., 1989, Saffar, 2005). در این مطالعه از پیلی CS3 به عنوان سیستم نمایش دهنده سطحی استفاده شد. این پیلی بخوبی مطالعه شدهاست و ژنهای سازنده آن شناسایی، کلون و تعیین توالی شدهاست (Manning et al.,1985, Jalajakumari et al., 1989). این پیلی بسیار نازک (~2nm) و قابل انعطافتر نسبت به سایر پیلیها میباشد(Levine et al., 1984) بنابراین نواحی در معرض آن نسبت به پیلیهای ضخیم، بیشتر است.
زیرواحد اصلی پیلی CS3 که پروتئین CstH میباشد تعداد زیادی اسیدآمینه پرولین و گلایسین دارد که این امر باعث ایجاد خمش و در نتیجه ایجاد نواحی در معرض (نواحی کویل) در آن میگردد. علاوه بر این در توالی CstH هیچ اسیدآمینه سیستئینی وجود ندارد که این خود یک امتیاز محسوب میشود.
یکی از پیشرفتهای چشمگیر در سالهای اخیر، بهره‌گیری از ابزارهای بیوانفورماتیکی جهت کسب اطلاعات با ارزش ساختاری و عملکردی پروتئین‌ها و کاربرد آنها در مهندسی پروتئین‌ها از جمله ارائه سطحی هترولوگها می‌باشد،‌‌اطلاعاتی که گاه برای یافتن آنها با استفاده از روش‌های آزمایشگاهی ماهها و سالها وقت صرف می‌شد.
جهت عرضه و نمایش پپتیدهای خارجی باید آنها را در مکان‌هایی از پروتئین به نام مناطق‌مجاز وارد کرد. تصور می‌شود نواحی در معرض محیط و قابل دسترس و آبدوست که ساختار کویل(coil) نیز دارند کاندیدای مناسبی‌، برای مناطق مجاز و وارد کردن پپتیدهای بیگانه جهت عرضه سطحی هستند(Macdonald and Johnson, 2001, Sujatha and Balaji, 2006, Hedegaard et al., 1989).
در دهه‌های گذشته پیشگویی مناطق مجاز، با روشهای آزمایشگاهی و با صرف هزینه و زمان زیاد مانند وارد کردن پپتیدها یا اپی‌توپهای کوچک گزارشگر و بیان آنها انجام می‌پذیرفت واغلب اوقات نیز بکار بردن چنین مناطقی برای پپتیدهای خارجی بدلیل مطابقت نداشتن با اپی‌توپ‌های گزارشگر با شکست مواجه می‌شد (chlehuber.2004, Armstrong.1995) ولی اکنون با بکار‌گیری و انتخاب الگوریتم‌های دقیق و یاری جستن از نرم افزارهای کامپیوتری و روشهای بیوانفورماتیکی جهت پیشگویی مناطق آب دوست (مناطق هیدروفیل)، ساختار دوم و ساختار سه بعدی پروتئین و …. ، پیشگویی مناطق مجاز پروتئین با اطمینان بیشتری انجام می‌شود و بدین ترتیب انجام پروژه‌‌ های پیچیده مهندسی پروتئین، بر مبنای پیشگویی ساختاری، آنالیز استرئوشیمیایی و انرژتیک آنها با استفاده از روش‌های بیوانفورماتیک و در مدت زمان بسیار کوتاه نسبت به دهه‌های گذشته دور از ذهن نیست (Cheng et al., 2007, Vivona et al., 2008).
در این مطالعه به کمک نرمافزارها، سرورها و روشهای پیشگویی ساختار دوم پروتئین، روشهای ارزیابی وضعیت پروتئین از لحاظ احتمال بیان بصورت اینکلوژنبادی، تعیین منحنی‌های مسیر آبدوست و آبگریز پروتئین، آنالیز تطابق و همردیفی توالی مورد بررسی با توالی‌های موجود در بانکهای اطلاعات زیستی، ارائه مدلهای ساختار سوم از طریق روشهای مقایسه توالیها و بندکشی و آنالیز مدلهای حاصل از لحاظ مناطق قابل دسترس و مناطق درگیر در اتصالات پروتئینی، موقعيتهاي38-39 ، 66 -67 ،79-80 ،92-93 و 108-107 در پروتئین CStH بالغ به عنوان مناطق مجاز زیرواحد CStH پیلی CS3 برای وارد کردن پپتیدهای خارجی پیش‌بینی و مورد تجربه قرارگرفت. مقایسه نتایج این تحقیق با تجارب آزمایشگاهی قبلی برای نمایش سطحی هگزاهیستیدین، پپتید غنی از سیستئین (قابلیت اتصال به فلزات را دارد) (Saffar, 2005)، سم مقاوم به حرارت اشریشیاکلی مولد انتروتوکسین (Heat Stable Enterotoxin) و شاخص آنتی‌ژنیک انتروتوکسین NSP4 روتاویروس(Hosseini et al., 2002) نشان‌داد که نقاط مجاز پیش‌بینی شده نه تنها با نتایج آزمایشگاهی قبلی مطابقت دارد (منطقه 66 در مطالعات پیشین به عنوان محل مجاز برای ورود پپتیدهای بیگانه استفاده شدهبود و در این تحقیق نیز به عنوان یکی از مناطق مجاز پیشگویی گردید) بلکه پیش بینی نقاط جدید با امتیاز پیشگویی و همچنین بیان و خاصیت جذب بالا نسبت به ناحیه 66 (به شکلهای 27-3 و 3-28 بخش نتایج مراجعه شود) بیانگر قابل اتکا بودن نتایج مطالعات نرم‌افزاری (حداقل در این نوع پروتئین ها و کاربرد مورد نظر) بوده و حتی به عنوان یک ضرورت در این قبیل از تجربیات محسوب میشود. از نتایج این تحقیق میتوان چنین برداشت نمود که یکی از راهکارها جهت بهینهسازی سیستمهای جاذب فلزات سنگین، انتخاب جایگاه مجاز مناسب برای ورود پپتیدهای جاذب فلزات سنگین میباشد. در این تحقیق جایگاههای مجاز 38 و 107 نسبت به سایر جایگاهها کارایی بالای در جذب را نشان میدهد. یکی از دلایل احتمالی جذب بالا نزدیکی و همسایگی این مناطق نسبت به دو منطقه اتصالی عمده ملکولهای زیرواحدهای پیلی یعنی نواحی انتهای آمینی و انتهای کربوکسیلی میباشد. بنظر میرسد تاثیر متقابل پپتیدهای ورودی و پروتئین حامل نسبت به سایر جایگاهها کمتر میباشد بعبارت دیگر هر دو ملکول از لحاظ ساختار و فعالیت کمتر دچار اختلال میشوند. نکته قابل توجه دیگر در رابطه با خصوصیات جایگاه ورود، ظهور انتخاب و Selectivity بالای جایگاه 38 نسبت به سایر مکانهای پذیرش پپتید بیگانه میباشد. پاسخ احتمالی برای این موضوع در زمینه و ترکیب اسیدآمینهای محل مجاز نهفتهاست. همچنانکه که در بخش مقدمه گفتهشد در اغلب پروتئینهای ناقل کادمیوم، در موقعیت 44 نسبت به توالی توافقی (C-X-X-C) موتیف اتصالی به فلز سنگین، اسیدآمینه آسپارتیک و در برخی موارد گلوتامیک قرار گرفتهاست. بررسی ترکیب اسید آمینهای پروتئین CstH نیز نشانداد با ورود موتیف 27 اسیدآمینهای جاذب کادمیوم، شرایط زمینهای فوق برای توالی توافقی فراهم میشود و اسیدآمینه آسپارتیک (اسیدآمینه شماره 64 پروتئین CstH) در فاصله 44 اسیدآمینهای نسبت به اسیدآمینه سیستئین توالی توافقی (C-X-X-C) قرار میگیرد و بدین ترتیب آرایش فضایی مناسبی برای پیوند و اتصال به کادمیوم در مقایسه با سایر فلزات فراهم میشود (شکل4-1).
در اینجا لازم است این نکته اضافه شود که: اگرچه علم زیستفناوری برای ارائه پروتئینهای هترولوگ بعنوان بیوکاتالیستها و بیوجاذبها یک تکنولوژی جدید و بسیار توسعه یافتهتر از متدهای مرسوم میباشد با این حال بسیاری از مطالعات تا کنون فقط در سطح آزمایشگاه انجام گرفتهاست واکثر آنها فاقد اطلاعات مربوط به عمل بیوجاذبها تحت نفوذ شرایط مختلف محیط واقعی هستند و تنظیمات بسیار اساسی جهت توسعه موفقیت آمیز جاذبهای زیستی لازم است و حتی تحت شرایط آزمایشگاهی، درجه سودمندی سیستمهای توسعه یافته، تحت پارامترهای وسیع و متنوع محیطی (شرایط زنده و غیرزنده) ارزیابی نشدهاست.

(A)

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد درباره ظرفیت جذب، بازدارندگی، اکسیداسیون، انفورماتیک Next Entries پایان نامه ارشد درباره انفورماتیک، مدل پیشنهادی، سوخت و سازی، عرضه کننده