پایان نامه ارشد درباره  ،    N، 13000، Buffer)

دانلود پایان نامه ارشد

ml
0.1 M
1%

NaOH 5M
SDS 10%
ddH2O

Solution II
(25 ml)

60 ml
11.5 ml
28.5 ml
5 M
Potasium Acetate
Acetic Acid Glacial
ddH2O

Solution III
(100ml)

• محلول I طبق دستوالعمل فوق تهیه و پس از اتوکلاو در دمای °C 4 نگهداری شد.
• محلول II شماره باید درموقع مصرف و تازه تهیهشود.
• محلول III مطابق روش فوق تهیه و در دمای °C4 نگهداری شد.
2-1- محلولها و بافرهاي مورد نياز براي الکتروفورز DNA بر روي ژل آگارز و رنگآميزي آن
1-2-1 بافر TAE105
از اين بافر به منظور استفاده در الکتروفورز DNA و همچنين ساختن ژل آگارز استفاده ميشود. ليست مواد تشکيل دهندهي اين بافر به شرح زیر است.
TAE 50X
ترکیب غلظت نهایی
EDTA 50 mM
Tris-Hcl 2M
Acetic acid Glacial درصد 5.71 (v/v)
2-2-1- بافر بارگذاري106 DNA
250 میلی گرم بروموفنلبلو (BPB) و يا 250 میلیگرم زايلن سيانول در 33 میلیلیتر تريس اسيدي 150 mM (PH:7.6) حل شد و سپس ml 60 گلسيرول و ml 7 آب مقطر به آن اضافهشد. اين بافر در دماي اتاق نگهداري ميشود.
3-2-1- محلول رنگآميزي107
محلول ذخيره اتيديوم برمايد (sigma) با غلظت 10 ميلي گرم در ميليليتر در آب مقطر حلشد. اين محلول در شرايط تاريکي نگهداري میشود.

پیوست2: محلولها و بافرهاي لازم جهت کار با پروتئينها
1-2- بافر PBS

برای تهیه یک لیتر 10X PBS
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
ddH2O
1.4 M
27 mM
101 mM
18 mM
1lit (pH:7.4 )
محلول تهیهشده در شیشههای کوچک تقسیم و اتوکلاو گردید و در دمای اتاق نگهداریشد.
2-2- محلولها و بافرهاي مورد نياز جهت SDS-PAGE
بافر
ترکیب
مقادیر
Acryl-bis acrylamid mix (30%)
Acrylamid
N,N’-methylenbis acryl amid
50% (W/V)
1.3% (W/V)
Resolving Buffer (pH:8.8)
SDS
Tris-base
0.4% (W/V)
1.5 M
Stacking Buffer (pH:6.8)
SDS
Tris-base
0.4% (W/V)
0.5 M
SDS-PAGE Running buffer (pH:8.3)
SDS
Tris-base
Glycin
0.1%
0.3%
1.44%
SDS-PAGE Sample Solvent (6X Loading Buffer)
Tris-base (pH:6.8)
SDS
Glycerol
β-mercaptoethanol(or dithiothreitol)
Bromophenol blue

100 mM
4% (W/V)
20% (V/V)
200 mM
0.2% (W/V)
APS (ammonium proxy disulfide)
APS

10% (W/V
TEMED: Tetra methylene diamine

• APS باید تازه تهیه شود و TEMED باید در تاریکی و °C4 نگهداری شود.
3-2- محلولها و بافرهاي لازم جهت وسترنبلاتينگ
ليست مواد و بافرهاي مورد نياز جهت انجام وسترنبلاتنيگ در جدول زیر آورده شدهاست.
بافر
ترکیبات
مقادیر
بافر انتقال
(pH:8.3)
Glycin
Tris-Base
SDS
Methanol
14.4 g/l
3.01 g/l
0.25 g/l
200 ml/l
بافر پوشاننده
Bovine Serum Albumin
PBS (1X)
Tween-20
1% (W/V)

0.05 %
بافر شستشو
PBS (1X)
Tween-20

0.05 %
محلول سوبسترا
4-Chloro-1-naphtol
Methanol
Washing Buffer
H2O2
30 mg
10 ml
25 ml
15 μl
• آنتیبادیهای مورد استفاده در وسترن بلاتینگ در (1X) بافر شستشو تهیهگردید.
1-3-2- محلول سوبسترا
مقدار 15 میلیگرم از ماده سوبسترای 4-chloro-1-naphtol در 15 میلیلیتر متانل حلگردید و در دمای -20C° نگهداری شد.

پیوست3- محیط کشت LB
این محیط با ترکیب زیر تهیه و پس از رساندن pH محیط به 7 در دمای Cº 121 به مدت 15 دقیقه اتوکلاو میشود در صورت نیاز به آنتیبیوتیک، وقتی دمای محیط کشت به حدود Cº 50 رسید به آن اضافه شد و سپس در حدود 20-30 میلیلیتر در هر پلیت ریخته و بعد از سفتشدن محیط در دمای Cº4 نگهداریگردید.

غلظت نهایی
ترکیب

1% (w/v)
Trypton
0.5% (w/v)
yeast extract
1% (w/v)
NaCl
1.5% (w/v)
Agar
1 Lit
ddH2O

پیوست 4 – مراحل استخراج DNA با کمک کیت
1- مقدار 1- 1.5 میلیلیتر از کشت شبانه (معمولا 16 ساعته) باکتری در ویال 2 میلی لیتری ریخته شد و توسط سانتریفوژ با دور rpm 4000 و زمان 5 دقیقه رسوب دادهشد. مایعرویی دور ریختهشد و سپس 250 میکرولیتر بافر سوسپانسیون به رسوب اضافه شده، ورتکس گردید تا سوسپانسیون کاملا یکنواخت تشکیلی شود.
2- بعد از آن 250 میکرولیتر بافر لیز کننده به سوسپانسیون باکتریایی فوق اضافه شد و با 5-6 بار معکوس کردن ویال، محتویات آن مخلوط گردید و 5-6 دقیقه در دمای اتاق قرار دادهشد.
3- بعد از آن 350 میکرولیتر بافر متصل شونده (Binding Buffer) به مخلوط فوق اضافه شد و با چند بار معکوس کردن ویال، محتویات آن مخلوط گردید وبه مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار دادهشد.
• بافر متصل شونده (Binding Buffer) باید سرد باشد.
4- مخلوط فوق با دور به مدت 15 دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد.
5- ستون خالص سازی را درون ویال جمعآوری گذاشته و مایع رویی حاصل از سانتریفوژ مرحله قبل را به ستون انتقال داده و سپس به مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ انجامگرفت.
6- محتویات درون ویال جمع آوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار دادهشد و سپس 500 میکرولیتر بافر شتشو( Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
7- محتویات درون ویال جمعآوری دور ریخته و ستون در همان ویال قرار داده شد و سپس 700 میکرولیتر بافر شتشوII (Washing Buffer II) به ستون اضافه شد و به مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
8- ستون درون یک ویال جدید 1.5 میلی لیتری استریل قرار گرفت.
9-50 تا 100 میکرولیتر بافر محلول سازی (Elution Buffer) به ستون اضافه و برای مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد.میتوان بجای Elution Buffer از آب دوبار تقطیر استریل هم استفادهکرد.

پیوست 5- مراحل بازیافت قطعات DNA از روی ژلآگارز با استفاده از کیت
در این روش بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت (Roche) عمل شد.
1- به ازای هر 100 میلی گرم وزن ژل 300 میکرولیتز بافر متصل شوند (Binding Buffer) اضافه شد و به مدت 15-30 ثانیه ورتکس گردید.
2- پس از ورتکس کردن لوله میکروفیوژ به مدت 10 دقیقه در دمای C °56 گرماگذاری شد و هر 2-3 دقیقه ورتکس کردن تکرار شد.
3- به ازاء هر 100 میلی گرم ژل 150 میکرولیتر ایزوپروپانل اضافه شد و با چند بار معکوس کردن ویال محتویات آن خوب مخلوط گردید.
4- ستون خالص سازی را درون ویال گذاشته و محتویات مرحله 3 را به ستون انتقال داده و سپس به مدت 30-60 ثانیه با حداکثر دور در دمای اتاق سانتریفوژ شد.
5- ستون خالص سازی را درون ویال جمع آوری گذاشته و مایع رویی حاصل از سانتریفوژ مرحله قبل را به ستون انتقال داده و سپس به مدت 30-60 ثانیه با دور rpm 13000 سانتریفوژ انجام گرفت.
6- محتویات درون ویال جمع آوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار داده شد و سپس 500 میکرولیتر بافر شتشو( Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
7- محتویات درون ویال جمعآوری دور ریخته و ستون در همان ویال قرار دادهشد و سپس 200 میکرولیتر بافر شستشو (Washing Buffer) به ستون اضافه شد و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
8- ستون درون یک ویال جدید 1.5 میلی لیتری استریل قرار گرفت.
9-50 تا 100 میکرولیتر بافر محلول سازی (Elution Buffer) به ستون اضافه و برای مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد. میتوان بجای Elution Buffer از آب دوبار تقطیر استریل هم استفاده کرد.
10- پس از سانتریفوژ محتویات درون ویال حاوی DNA خالص شده است. میتوان این DNA را نیز رسوب داد و برای مصارف بعدی استفاده کرد. برای نگهداری محلول بدست آمده در دمای -20 قرار دادهشد.

پیوست 6- خالص سازی محصول PCR با استفاده از کیت
در این روش بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت (Roche ) عمل شد.
1- به ازاء 100 میکرولیتر محصول PCR، 500 میکرولیتر بافر متصل شوند (Binding Buffer) اضافه شده و به خوبی مخلوط شد.
2- ستون خالص سازی درون ویال گذاشته و محتویات مرحله 1 را به ستون انتقال داده و سپس به مدت یک دقیقه با دور rpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
3- محتویات درون ویال جمعآوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار دادهشد و سپس 500 میکرولیتر بافر شتشو(Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
4- محتویات درون ویال جمعآوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار داده شد و سپس 200 میکرولیتر بافر شتشو(Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت. ستون درون یک ویال جدید 1.5 میلی لیتری استریل قرار گرفت.
5- 50 تا 100 میکرولیتر بافر محلول سازی (Elution Buffer) به ستون اضافه و برای مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد.میتوان بجای Elution Buffer از آب دوبار تقطیر استریل هم استفادهکرد.
6- پس از سانتریفوژ محتویات درون ویال حاوی DNA خالص شدهاست. میتوان این DNA را نیز رسوب داد و برای مصارف بعدی استفادهکرد. برای نگهداری محلول بدست آمده در دمای-20 قرار داده شد.

پیوست 7- مناطق در انتراکشن زیرواحد اصلی پیلی CS3 با پروتئینهای دیگر

پیشگویی با روش meta-PPISP
پیشگویی با روش cons-PPISP
پیشگویی با روش meta-PPISP
L      15    0.649   0.000   0.424   0.130       N
S      16    0.519   0.000   0.438   0.106       N
P      17    0.049   0.000   0.479   0.142       N
A      18    0.072   0.000   0.483   0.202       N
A      19    0.477   0.190   0.465   0.215       N
L      20    0.350   0.390   0.447   0.218       N
D      21    0.329   0.390   0.412   0.267       N
A      22    0.033   0.390   0.431   0.237       N
T      23    0.170   0.190   0.445   0.196       N
W      24    0.012   0.390   0.566   0.317       N
A      25    0.071   0.190   0.540   0.138       N
P      26    0.009   0.000   0.579   0.152       N
Q      27    0.718   0.000   0.555   0.286       N
D      28    0.022   0.000   0.525   0.159       N
N      29    0.156   0.000   0.513   0.097       N
L      30    0.958   0.000   0.559   0.217       N
T      31    0.298   0.000   0.517   0.128       N
L      32    0.987   0.000   0.561   0.286       N
S      33    0.915   0.000   0.489   0.171       N
N      34    0.923   0.000   0.469   0.165       N
T      35    0.947   0.000   0.488   0.222       N
G      36    0.832   0.000   0.509   0.169       N
V      37    0.773   0.000   0.559   0.237       N
S      38    0.041   0.000   0.549   0.178       N
N      39    0.000   0.000   0.539   0.000       –
T      40    0.940   0.190   0.507   0.306       N
L      41    0.767   0.390   0.538   0.390       P
V      42    0.061   0.000   0.612   0.169       N
G      43    0.000   0.000   0.000   0.000       –
V      44    0.008   0.590   0.539   0.380       P
L      45    0.009   0.390   0.527   0.356       P
T      46    0.255   0.190   0.452   0.273       N
L      47    0.021   0.190   0.466   0.207       N
S      48    0.048   0.190   0.412   0.195       N
N      49    0.020   0.190   0.434   0.190       N
T      50    0.063   0.190   0.445   0.162       N
S      51    0.642   0.190   0.450   0.312       N
I      52    0.095   0.190   0.435   0.179   

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد درباره of، and، the، by Next Entries پایان نامه با کلید واژه های مواد غذایی، پوشش گیاهی، ارزش اقتصادی، زیست محیطی