ml
0.1 M
1%
NaOH 5M
SDS 10%
ddH2O
Solution II
(25 ml)
60 ml
11.5 ml
28.5 ml
5 M
Potasium Acetate
Acetic Acid Glacial
ddH2O
Solution III
(100ml)
• محلول I طبق دستوالعمل فوق تهیه و پس از اتوکلاو در دمای °C 4 نگهداری شد.
• محلول II شماره باید درموقع مصرف و تازه تهیهشود.
• محلول III مطابق روش فوق تهیه و در دمای °C4 نگهداری شد.
2-1- محلولها و بافرهاي مورد نياز براي الکتروفورز DNA بر روي ژل آگارز و رنگآميزي آن
1-2-1 بافر TAE105
از اين بافر به منظور استفاده در الکتروفورز DNA و همچنين ساختن ژل آگارز استفاده ميشود. ليست مواد تشکيل دهندهي اين بافر به شرح زیر است.
TAE 50X
ترکیب غلظت نهایی
EDTA 50 mM
Tris-Hcl 2M
Acetic acid Glacial درصد 5.71 (v/v)
2-2-1- بافر بارگذاري106 DNA
250 میلی گرم بروموفنلبلو (BPB) و يا 250 میلیگرم زايلن سيانول در 33 میلیلیتر تريس اسيدي 150 mM (PH:7.6) حل شد و سپس ml 60 گلسيرول و ml 7 آب مقطر به آن اضافهشد. اين بافر در دماي اتاق نگهداري ميشود.
3-2-1- محلول رنگآميزي107
محلول ذخيره اتيديوم برمايد (sigma) با غلظت 10 ميلي گرم در ميليليتر در آب مقطر حلشد. اين محلول در شرايط تاريکي نگهداري میشود.
پیوست2: محلولها و بافرهاي لازم جهت کار با پروتئينها
1-2- بافر PBS
برای تهیه یک لیتر 10X PBS
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
ddH2O
1.4 M
27 mM
101 mM
18 mM
1lit (pH:7.4 )
محلول تهیهشده در شیشههای کوچک تقسیم و اتوکلاو گردید و در دمای اتاق نگهداریشد.
2-2- محلولها و بافرهاي مورد نياز جهت SDS-PAGE
بافر
ترکیب
مقادیر
Acryl-bis acrylamid mix (30%)
Acrylamid
N,N’-methylenbis acryl amid
50% (W/V)
1.3% (W/V)
Resolving Buffer (pH:8.8)
SDS
Tris-base
0.4% (W/V)
1.5 M
Stacking Buffer (pH:6.8)
SDS
Tris-base
0.4% (W/V)
0.5 M
SDS-PAGE Running buffer (pH:8.3)
SDS
Tris-base
Glycin
0.1%
0.3%
1.44%
SDS-PAGE Sample Solvent (6X Loading Buffer)
Tris-base (pH:6.8)
SDS
Glycerol
β-mercaptoethanol(or dithiothreitol)
Bromophenol blue
100 mM
4% (W/V)
20% (V/V)
200 mM
0.2% (W/V)
APS (ammonium proxy disulfide)
APS
10% (W/V
TEMED: Tetra methylene diamine
• APS باید تازه تهیه شود و TEMED باید در تاریکی و °C4 نگهداری شود.
3-2- محلولها و بافرهاي لازم جهت وسترنبلاتينگ
ليست مواد و بافرهاي مورد نياز جهت انجام وسترنبلاتنيگ در جدول زیر آورده شدهاست.
بافر
ترکیبات
مقادیر
بافر انتقال
(pH:8.3)
Glycin
Tris-Base
SDS
Methanol
14.4 g/l
3.01 g/l
0.25 g/l
200 ml/l
بافر پوشاننده
Bovine Serum Albumin
PBS (1X)
Tween-20
1% (W/V)
0.05 %
بافر شستشو
PBS (1X)
Tween-20
0.05 %
محلول سوبسترا
4-Chloro-1-naphtol
Methanol
Washing Buffer
H2O2
30 mg
10 ml
25 ml
15 μl
• آنتیبادیهای مورد استفاده در وسترن بلاتینگ در (1X) بافر شستشو تهیهگردید.
1-3-2- محلول سوبسترا
مقدار 15 میلیگرم از ماده سوبسترای 4-chloro-1-naphtol در 15 میلیلیتر متانل حلگردید و در دمای -20C° نگهداری شد.
پیوست3- محیط کشت LB
این محیط با ترکیب زیر تهیه و پس از رساندن pH محیط به 7 در دمای Cº 121 به مدت 15 دقیقه اتوکلاو میشود در صورت نیاز به آنتیبیوتیک، وقتی دمای محیط کشت به حدود Cº 50 رسید به آن اضافه شد و سپس در حدود 20-30 میلیلیتر در هر پلیت ریخته و بعد از سفتشدن محیط در دمای Cº4 نگهداریگردید.
غلظت نهایی
ترکیب
1% (w/v)
Trypton
0.5% (w/v)
yeast extract
1% (w/v)
NaCl
1.5% (w/v)
Agar
1 Lit
ddH2O
پیوست 4 – مراحل استخراج DNA با کمک کیت
1- مقدار 1- 1.5 میلیلیتر از کشت شبانه (معمولا 16 ساعته) باکتری در ویال 2 میلی لیتری ریخته شد و توسط سانتریفوژ با دور rpm 4000 و زمان 5 دقیقه رسوب دادهشد. مایعرویی دور ریختهشد و سپس 250 میکرولیتر بافر سوسپانسیون به رسوب اضافه شده، ورتکس گردید تا سوسپانسیون کاملا یکنواخت تشکیلی شود.
2- بعد از آن 250 میکرولیتر بافر لیز کننده به سوسپانسیون باکتریایی فوق اضافه شد و با 5-6 بار معکوس کردن ویال، محتویات آن مخلوط گردید و 5-6 دقیقه در دمای اتاق قرار دادهشد.
3- بعد از آن 350 میکرولیتر بافر متصل شونده (Binding Buffer) به مخلوط فوق اضافه شد و با چند بار معکوس کردن ویال، محتویات آن مخلوط گردید وبه مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار دادهشد.
• بافر متصل شونده (Binding Buffer) باید سرد باشد.
4- مخلوط فوق با دور به مدت 15 دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد.
5- ستون خالص سازی را درون ویال جمعآوری گذاشته و مایع رویی حاصل از سانتریفوژ مرحله قبل را به ستون انتقال داده و سپس به مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ انجامگرفت.
6- محتویات درون ویال جمع آوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار دادهشد و سپس 500 میکرولیتر بافر شتشو( Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
7- محتویات درون ویال جمعآوری دور ریخته و ستون در همان ویال قرار داده شد و سپس 700 میکرولیتر بافر شتشوII (Washing Buffer II) به ستون اضافه شد و به مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
8- ستون درون یک ویال جدید 1.5 میلی لیتری استریل قرار گرفت.
9-50 تا 100 میکرولیتر بافر محلول سازی (Elution Buffer) به ستون اضافه و برای مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد.میتوان بجای Elution Buffer از آب دوبار تقطیر استریل هم استفادهکرد.
پیوست 5- مراحل بازیافت قطعات DNA از روی ژلآگارز با استفاده از کیت
در این روش بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت (Roche) عمل شد.
1- به ازای هر 100 میلی گرم وزن ژل 300 میکرولیتز بافر متصل شوند (Binding Buffer) اضافه شد و به مدت 15-30 ثانیه ورتکس گردید.
2- پس از ورتکس کردن لوله میکروفیوژ به مدت 10 دقیقه در دمای C °56 گرماگذاری شد و هر 2-3 دقیقه ورتکس کردن تکرار شد.
3- به ازاء هر 100 میلی گرم ژل 150 میکرولیتر ایزوپروپانل اضافه شد و با چند بار معکوس کردن ویال محتویات آن خوب مخلوط گردید.
4- ستون خالص سازی را درون ویال گذاشته و محتویات مرحله 3 را به ستون انتقال داده و سپس به مدت 30-60 ثانیه با حداکثر دور در دمای اتاق سانتریفوژ شد.
5- ستون خالص سازی را درون ویال جمع آوری گذاشته و مایع رویی حاصل از سانتریفوژ مرحله قبل را به ستون انتقال داده و سپس به مدت 30-60 ثانیه با دور rpm 13000 سانتریفوژ انجام گرفت.
6- محتویات درون ویال جمع آوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار داده شد و سپس 500 میکرولیتر بافر شتشو( Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
7- محتویات درون ویال جمعآوری دور ریخته و ستون در همان ویال قرار دادهشد و سپس 200 میکرولیتر بافر شستشو (Washing Buffer) به ستون اضافه شد و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
8- ستون درون یک ویال جدید 1.5 میلی لیتری استریل قرار گرفت.
9-50 تا 100 میکرولیتر بافر محلول سازی (Elution Buffer) به ستون اضافه و برای مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد. میتوان بجای Elution Buffer از آب دوبار تقطیر استریل هم استفاده کرد.
10- پس از سانتریفوژ محتویات درون ویال حاوی DNA خالص شده است. میتوان این DNA را نیز رسوب داد و برای مصارف بعدی استفاده کرد. برای نگهداری محلول بدست آمده در دمای -20 قرار دادهشد.
پیوست 6- خالص سازی محصول PCR با استفاده از کیت
در این روش بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت (Roche ) عمل شد.
1- به ازاء 100 میکرولیتر محصول PCR، 500 میکرولیتر بافر متصل شوند (Binding Buffer) اضافه شده و به خوبی مخلوط شد.
2- ستون خالص سازی درون ویال گذاشته و محتویات مرحله 1 را به ستون انتقال داده و سپس به مدت یک دقیقه با دور rpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
3- محتویات درون ویال جمعآوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار دادهشد و سپس 500 میکرولیتر بافر شتشو(Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
4- محتویات درون ویال جمعآوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار داده شد و سپس 200 میکرولیتر بافر شتشو(Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت. ستون درون یک ویال جدید 1.5 میلی لیتری استریل قرار گرفت.
5- 50 تا 100 میکرولیتر بافر محلول سازی (Elution Buffer) به ستون اضافه و برای مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد.میتوان بجای Elution Buffer از آب دوبار تقطیر استریل هم استفادهکرد.
6- پس از سانتریفوژ محتویات درون ویال حاوی DNA خالص شدهاست. میتوان این DNA را نیز رسوب داد و برای مصارف بعدی استفادهکرد. برای نگهداری محلول بدست آمده در دمای-20 قرار داده شد.
پیوست 7- مناطق در انتراکشن زیرواحد اصلی پیلی CS3 با پروتئینهای دیگر
پیشگویی با روش meta-PPISP
پیشگویی با روش cons-PPISP
پیشگویی با روش meta-PPISP
L 15 0.649 0.000 0.424 0.130 N
S 16 0.519 0.000 0.438 0.106 N
P 17 0.049 0.000 0.479 0.142 N
A 18 0.072 0.000 0.483 0.202 N
A 19 0.477 0.190 0.465 0.215 N
L 20 0.350 0.390 0.447 0.218 N
D 21 0.329 0.390 0.412 0.267 N
A 22 0.033 0.390 0.431 0.237 N
T 23 0.170 0.190 0.445 0.196 N
W 24 0.012 0.390 0.566 0.317 N
A 25 0.071 0.190 0.540 0.138 N
P 26 0.009 0.000 0.579 0.152 N
Q 27 0.718 0.000 0.555 0.286 N
D 28 0.022 0.000 0.525 0.159 N
N 29 0.156 0.000 0.513 0.097 N
L 30 0.958 0.000 0.559 0.217 N
T 31 0.298 0.000 0.517 0.128 N
L 32 0.987 0.000 0.561 0.286 N
S 33 0.915 0.000 0.489 0.171 N
N 34 0.923 0.000 0.469 0.165 N
T 35 0.947 0.000 0.488 0.222 N
G 36 0.832 0.000 0.509 0.169 N
V 37 0.773 0.000 0.559 0.237 N
S 38 0.041 0.000 0.549 0.178 N
N 39 0.000 0.000 0.539 0.000 –
T 40 0.940 0.190 0.507 0.306 N
L 41 0.767 0.390 0.538 0.390 P
V 42 0.061 0.000 0.612 0.169 N
G 43 0.000 0.000 0.000 0.000 –
V 44 0.008 0.590 0.539 0.380 P
L 45 0.009 0.390 0.527 0.356 P
T 46 0.255 0.190 0.452 0.273 N
L 47 0.021 0.190 0.466 0.207 N
S 48 0.048 0.190 0.412 0.195 N
N 49 0.020 0.190 0.434 0.190 N
T 50 0.063 0.190 0.445 0.162 N
S 51 0.642 0.190 0.450 0.312 N
I 52 0.095 0.190 0.435 0.179
