پایان نامه ارشد درباره  ،    N، 13000، Buffer)

دانلود پایان نامه ارشد

ml
0.1 M
1%

NaOH 5M
SDS 10%
ddH2O

Solution II
(25 ml)

60 ml
11.5 ml
28.5 ml
5 M
Potasium Acetate
Acetic Acid Glacial
ddH2O

Solution III
(100ml)

• محلول I طبق دستوالعمل فوق تهیه و پس از اتوکلاو در دمای °C 4 نگهداری شد.
• محلول II شماره باید درموقع مصرف و تازه تهیهشود.
• محلول III مطابق روش فوق تهیه و در دمای °C4 نگهداری شد.
2-1- محلولها و بافرهاي مورد نياز براي الکتروفورز DNA بر روي ژل آگارز و رنگآميزي آن
1-2-1 بافر TAE105
از اين بافر به منظور استفاده در الکتروفورز DNA و همچنين ساختن ژل آگارز استفاده ميشود. ليست مواد تشکيل دهندهي اين بافر به شرح زیر است.
TAE 50X
ترکیب غلظت نهایی
EDTA 50 mM
Tris-Hcl 2M
Acetic acid Glacial درصد 5.71 (v/v)
2-2-1- بافر بارگذاري106 DNA
250 میلی گرم بروموفنلبلو (BPB) و يا 250 میلیگرم زايلن سيانول در 33 میلیلیتر تريس اسيدي 150 mM (PH:7.6) حل شد و سپس ml 60 گلسيرول و ml 7 آب مقطر به آن اضافهشد. اين بافر در دماي اتاق نگهداري ميشود.
3-2-1- محلول رنگآميزي107
محلول ذخيره اتيديوم برمايد (sigma) با غلظت 10 ميلي گرم در ميليليتر در آب مقطر حلشد. اين محلول در شرايط تاريکي نگهداري میشود.

پیوست2: محلولها و بافرهاي لازم جهت کار با پروتئينها
1-2- بافر PBS

برای تهیه یک لیتر 10X PBS
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
ddH2O
1.4 M
27 mM
101 mM
18 mM
1lit (pH:7.4 )
محلول تهیهشده در شیشههای کوچک تقسیم و اتوکلاو گردید و در دمای اتاق نگهداریشد.
2-2- محلولها و بافرهاي مورد نياز جهت SDS-PAGE
بافر
ترکیب
مقادیر
Acryl-bis acrylamid mix (30%)
Acrylamid
N,N’-methylenbis acryl amid
50% (W/V)
1.3% (W/V)
Resolving Buffer (pH:8.8)
SDS
Tris-base
0.4% (W/V)
1.5 M
Stacking Buffer (pH:6.8)
SDS
Tris-base
0.4% (W/V)
0.5 M
SDS-PAGE Running buffer (pH:8.3)
SDS
Tris-base
Glycin
0.1%
0.3%
1.44%
SDS-PAGE Sample Solvent (6X Loading Buffer)
Tris-base (pH:6.8)
SDS
Glycerol
β-mercaptoethanol(or dithiothreitol)
Bromophenol blue

100 mM
4% (W/V)
20% (V/V)
200 mM
0.2% (W/V)
APS (ammonium proxy disulfide)
APS

10% (W/V
TEMED: Tetra methylene diamine

• APS باید تازه تهیه شود و TEMED باید در تاریکی و °C4 نگهداری شود.
3-2- محلولها و بافرهاي لازم جهت وسترنبلاتينگ
ليست مواد و بافرهاي مورد نياز جهت انجام وسترنبلاتنيگ در جدول زیر آورده شدهاست.
بافر
ترکیبات
مقادیر
بافر انتقال
(pH:8.3)
Glycin
Tris-Base
SDS
Methanol
14.4 g/l
3.01 g/l
0.25 g/l
200 ml/l
بافر پوشاننده
Bovine Serum Albumin
PBS (1X)
Tween-20
1% (W/V)

0.05 %
بافر شستشو
PBS (1X)
Tween-20

0.05 %
محلول سوبسترا
4-Chloro-1-naphtol
Methanol
Washing Buffer
H2O2
30 mg
10 ml
25 ml
15 μl
• آنتیبادیهای مورد استفاده در وسترن بلاتینگ در (1X) بافر شستشو تهیهگردید.
1-3-2- محلول سوبسترا
مقدار 15 میلیگرم از ماده سوبسترای 4-chloro-1-naphtol در 15 میلیلیتر متانل حلگردید و در دمای -20C° نگهداری شد.

پیوست3- محیط کشت LB
این محیط با ترکیب زیر تهیه و پس از رساندن pH محیط به 7 در دمای Cº 121 به مدت 15 دقیقه اتوکلاو میشود در صورت نیاز به آنتیبیوتیک، وقتی دمای محیط کشت به حدود Cº 50 رسید به آن اضافه شد و سپس در حدود 20-30 میلیلیتر در هر پلیت ریخته و بعد از سفتشدن محیط در دمای Cº4 نگهداریگردید.

غلظت نهایی
ترکیب

1% (w/v)
Trypton
0.5% (w/v)
yeast extract
1% (w/v)
NaCl
1.5% (w/v)
Agar
1 Lit
ddH2O

پیوست 4 – مراحل استخراج DNA با کمک کیت
1- مقدار 1- 1.5 میلیلیتر از کشت شبانه (معمولا 16 ساعته) باکتری در ویال 2 میلی لیتری ریخته شد و توسط سانتریفوژ با دور rpm 4000 و زمان 5 دقیقه رسوب دادهشد. مایعرویی دور ریختهشد و سپس 250 میکرولیتر بافر سوسپانسیون به رسوب اضافه شده، ورتکس گردید تا سوسپانسیون کاملا یکنواخت تشکیلی شود.
2- بعد از آن 250 میکرولیتر بافر لیز کننده به سوسپانسیون باکتریایی فوق اضافه شد و با 5-6 بار معکوس کردن ویال، محتویات آن مخلوط گردید و 5-6 دقیقه در دمای اتاق قرار دادهشد.
3- بعد از آن 350 میکرولیتر بافر متصل شونده (Binding Buffer) به مخلوط فوق اضافه شد و با چند بار معکوس کردن ویال، محتویات آن مخلوط گردید وبه مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار دادهشد.
• بافر متصل شونده (Binding Buffer) باید سرد باشد.
4- مخلوط فوق با دور به مدت 15 دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد.
5- ستون خالص سازی را درون ویال جمعآوری گذاشته و مایع رویی حاصل از سانتریفوژ مرحله قبل را به ستون انتقال داده و سپس به مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ انجامگرفت.
6- محتویات درون ویال جمع آوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار دادهشد و سپس 500 میکرولیتر بافر شتشو( Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
7- محتویات درون ویال جمعآوری دور ریخته و ستون در همان ویال قرار داده شد و سپس 700 میکرولیتر بافر شتشوII (Washing Buffer II) به ستون اضافه شد و به مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
8- ستون درون یک ویال جدید 1.5 میلی لیتری استریل قرار گرفت.
9-50 تا 100 میکرولیتر بافر محلول سازی (Elution Buffer) به ستون اضافه و برای مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد.میتوان بجای Elution Buffer از آب دوبار تقطیر استریل هم استفادهکرد.

پیوست 5- مراحل بازیافت قطعات DNA از روی ژلآگارز با استفاده از کیت
در این روش بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت (Roche) عمل شد.
1- به ازای هر 100 میلی گرم وزن ژل 300 میکرولیتز بافر متصل شوند (Binding Buffer) اضافه شد و به مدت 15-30 ثانیه ورتکس گردید.
2- پس از ورتکس کردن لوله میکروفیوژ به مدت 10 دقیقه در دمای C °56 گرماگذاری شد و هر 2-3 دقیقه ورتکس کردن تکرار شد.
3- به ازاء هر 100 میلی گرم ژل 150 میکرولیتر ایزوپروپانل اضافه شد و با چند بار معکوس کردن ویال محتویات آن خوب مخلوط گردید.
4- ستون خالص سازی را درون ویال گذاشته و محتویات مرحله 3 را به ستون انتقال داده و سپس به مدت 30-60 ثانیه با حداکثر دور در دمای اتاق سانتریفوژ شد.
5- ستون خالص سازی را درون ویال جمع آوری گذاشته و مایع رویی حاصل از سانتریفوژ مرحله قبل را به ستون انتقال داده و سپس به مدت 30-60 ثانیه با دور rpm 13000 سانتریفوژ انجام گرفت.
6- محتویات درون ویال جمع آوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار داده شد و سپس 500 میکرولیتر بافر شتشو( Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
7- محتویات درون ویال جمعآوری دور ریخته و ستون در همان ویال قرار دادهشد و سپس 200 میکرولیتر بافر شستشو (Washing Buffer) به ستون اضافه شد و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
8- ستون درون یک ویال جدید 1.5 میلی لیتری استریل قرار گرفت.
9-50 تا 100 میکرولیتر بافر محلول سازی (Elution Buffer) به ستون اضافه و برای مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد. میتوان بجای Elution Buffer از آب دوبار تقطیر استریل هم استفاده کرد.
10- پس از سانتریفوژ محتویات درون ویال حاوی DNA خالص شده است. میتوان این DNA را نیز رسوب داد و برای مصارف بعدی استفاده کرد. برای نگهداری محلول بدست آمده در دمای -20 قرار دادهشد.

پیوست 6- خالص سازی محصول PCR با استفاده از کیت
در این روش بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده کیت (Roche ) عمل شد.
1- به ازاء 100 میکرولیتر محصول PCR، 500 میکرولیتر بافر متصل شوند (Binding Buffer) اضافه شده و به خوبی مخلوط شد.
2- ستون خالص سازی درون ویال گذاشته و محتویات مرحله 1 را به ستون انتقال داده و سپس به مدت یک دقیقه با دور rpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
3- محتویات درون ویال جمعآوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار دادهشد و سپس 500 میکرولیتر بافر شتشو(Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت.
4- محتویات درون ویال جمعآوری را دور ریخته و دوباره ستون در همان ویال قرار داده شد و سپس 200 میکرولیتر بافر شتشو(Washing Buffer) به ستون اضافه نموده و به مدت یک دقیقه با دورrpm 13000 سانتریفوژ صورت گرفت. ستون درون یک ویال جدید 1.5 میلی لیتری استریل قرار گرفت.
5- 50 تا 100 میکرولیتر بافر محلول سازی (Elution Buffer) به ستون اضافه و برای مدت 30-60 ثانیه با دورrpm 13000 سانتریفوژ شد.میتوان بجای Elution Buffer از آب دوبار تقطیر استریل هم استفادهکرد.
6- پس از سانتریفوژ محتویات درون ویال حاوی DNA خالص شدهاست. میتوان این DNA را نیز رسوب داد و برای مصارف بعدی استفادهکرد. برای نگهداری محلول بدست آمده در دمای-20 قرار داده شد.

پیوست 7- مناطق در انتراکشن زیرواحد اصلی پیلی CS3 با پروتئینهای دیگر

پیشگویی با روش meta-PPISP
پیشگویی با روش cons-PPISP
پیشگویی با روش meta-PPISP
L      15    0.649   0.000   0.424   0.130       N
S      16    0.519   0.000   0.438   0.106       N
P      17    0.049   0.000   0.479   0.142       N
A      18    0.072   0.000   0.483   0.202       N
A      19    0.477   0.190   0.465   0.215       N
L      20    0.350   0.390   0.447   0.218       N
D      21    0.329   0.390   0.412   0.267       N
A      22    0.033   0.390   0.431   0.237       N
T      23    0.170   0.190   0.445   0.196       N
W      24    0.012   0.390   0.566   0.317       N
A      25    0.071   0.190   0.540   0.138       N
P      26    0.009   0.000   0.579   0.152       N
Q      27    0.718   0.000   0.555   0.286       N
D      28    0.022   0.000   0.525   0.159       N
N      29    0.156   0.000   0.513   0.097       N
L      30    0.958   0.000   0.559   0.217       N
T      31    0.298   0.000   0.517   0.128       N
L      32    0.987   0.000   0.561   0.286       N
S      33    0.915   0.000   0.489   0.171       N
N      34    0.923   0.000   0.469   0.165       N
T      35    0.947   0.000   0.488   0.222       N
G      36    0.832   0.000   0.509   0.169       N
V      37    0.773   0.000   0.559   0.237       N
S      38    0.041   0.000   0.549   0.178       N
N      39    0.000   0.000   0.539   0.000       –
T      40    0.940   0.190   0.507   0.306       N
L      41    0.767   0.390   0.538   0.390       P
V      42    0.061   0.000   0.612   0.169       N
G      43    0.000   0.000   0.000   0.000       –
V      44    0.008   0.590   0.539   0.380       P
L      45    0.009   0.390   0.527   0.356       P
T      46    0.255   0.190   0.452   0.273       N
L      47    0.021   0.190   0.466   0.207       N
S      48    0.048   0.190   0.412   0.195       N
N      49    0.020   0.190   0.434   0.190       N
T      50    0.063   0.190   0.445   0.162       N
S      51    0.642   0.190   0.450   0.312       N
I      52    0.095   0.190   0.435   0.179   

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه ارشد درباره of، and، the، by Next Entries پایان نامه ارشد درباره  ،    N،    -، T