پایان نامه ارشد با موضوع گروه کنترل، ژن درمانی، تغییر رنگ

فاکتور‌های رشد منجر به تحریک مهاجرت، اتصال و تکثیر سلول‌های اندوتلیال می‌شوند. VEGF به نوبه‌ی خود باعث تحریک بیان eNOS می‌شود.
2-9-5-1-3. ری اپیتلیالیزاسیون
NO حاصل از iNOS برای تکثیر کراتینوسیت‌ها ضروری است، بطوری که مهار کننده‌ی iNOS باعث تأخیر در ری اپیتلیالیزاسیون می‌شود. IL-1 یک تنظیم کننده برای تکثیر و تمایز کراتینوسیت‌ها محسوب می‌شود. با توجه به اینکه NO به عنوان جاذب IL-1 عمل می‌کند، بطور غیر مستقیم مسئول ری اپیتلیالیزاسیون می‌باشد. همچنین NO کراتینوسیت‌ها را از آپوپتوز محافظت می‌کند، بطوری که با اضافه کردن آنتاگونیست‌های NOS به کراتینوسیت‌هایی که تحت تابش قرار گرفته بودند میزان آپوپتوز افزایش می‌یافت ولی با اضافه کردن دهنده‌های NO مثل S-نیتروزو-N- استیل- پنیسیلامین (SNAP)93 نتیجه‌ی معکوسی بدست می‌آید.
2-9-5-1-4. رسوب ماتریکس و بازسازی
اکثر مطالعات in vivo، ارتباط میان مقادیر بالای NO (حاصل از دهنده‌های NO، L- آرژینین و بیان بالای iNOS از طریق ژن درمانی) با افزایش رسوب کلاژن در زخم‌ها را نشان می‌دهند. همچنین در بیشتر مطالعات in vitro، NO سبب افزایش تولید کلاژن هم در فیبروبلاست‌های زخم و هم در فیروبلاست‌های حاصل از پوست سالم شده است. همچنین NO با تبدیل TGF-β1 غیر فعال به فرم فعال آن، به فعالیت فیبروبلاست‌ها کمک می‌کند (88).

شکل 2-27. مدلی فرضی برای تنظیم ساخت کلاژن. 1. فعال شدن مسیر سیگنال‌دهی فاکتور هسته‌ای- kB (NF-kB). 2. NO می‌تواند باعث مهار اتصال اعضای خانواده‌ی NF-kB به DNA هدف شود. 3. اتصال اعضای خانواده‌ی NF-kB به DNA و رونویسی از iNOS mRNA. 4. مهار تولید NO از iNOS توسط L-NaME. 5. NO با فعال کردن تولید ایزوفرم‌های COX، تولید PGE2 را تنظیم می‌کند. 6. ایندومتاسین با مهار COX میزان تولید PGE2 را پایین می‌آورد. 7. تولید کلاژن و فرآیند ترمیم زخم با فعال شدن رسپتور‌های مختلف PGE2 و پیامبر‌های ثانویه تغییر می‌کنند. LPS: لیپو پلی ساکارید، TLR4: رسپتور شبه تول 4، Traf6: فاکتور مرتبط با رسپتور فاکتور نکروز دهنده تومور، IkB: مهار کننده پلی پپتید کاپا افزایش دهنده ژن در B سل‌ها، NFkB: فاکتور رونویسی هسته‌ای kB، iNOS: نیتریک اکسید سنتتاز القایی، L-NAME: NG- نیترو-L- آرژینین متیل استر، NO: نیتریک اکسید، COX: سیکلواکسیژناز، INDO: ایندومتاسین، PKC: پروتئین کیناز C، cAMP: آدنوزیم مونو فسفات حلقوی (48).

2-9-5-2. کاربرد نیتریک اکسید در درمان زخم
مدارک زیادی برای اثبات نقش NO در ترمیم زخم وجود دارد. تجویز مهار کننده‌های NO سبب تأخیر در ری اپیتلیالیزاسیون و تشکیل کلاژن می‌شود. تأخیر در ترمیم زخم‌های دیابتی با کاهش سنتز NO مرتبط می‌باشد. بنابراین مقادیر بالای NO برای تقویت ترمیم زخم ضروری می‌باشد. مطالعات زیادی حاکی از تسریع روند ترمیم با واسطه‌ی افزایش NO به کمک دهنده‌های NO، سوبسترای NOS یعنی آرژینین وجود دارد. L- آرژینین آمینو اسیدی مهم در ترمیم محسوب می‌شود. حیواناتی که با L- آرژینین تیمار می‌شدند، مقاومت بالا و رسوب کلاژن بیشتری نسبت به گروه کنترل نشان می‌دادند.
تحقیقاتی که در زمینه‌ی سیستم‌های تولید کننده NO و کمپلکس‌های NO صورت گرفته است، بکارگیری NO در درمان زخم را پر رنگ‌تر کرده است. یک سیستم شیمیایی با بکارگیری از سدیم نیتریت و آسکوربات، تولید و ذخیره‌ی NO را برای پوست فراهم می‌کند. به منظور جلوگیری از آسیب پوستی به دلیل طبیعت اسیدی مخلوط حاصله، یک غشای پلیمر پلی استر هیدروفیل نفوذپذیر در مخلوط جاگذاری می‌شود. این سیستم در گشادی رگ‌ها در پوست انسان و از بین بردن میکروب‌ها مؤثر است. این سیستم در درمان زخم‌های پوستی و عفونت‌های زخم مزمن کاربرد دارد. NO به پلیمر‌های گوناگونی ایموبیلیزه می‌شود تا به صورت کنترل شده رها شود. پلیمر پلی اتیلن ایمین سلولز دی آزنیوم دیولات94 (NONOate) که غیر محلول و غیر سمی‌ بوده، یک دهنده‌ی NO با پایه‌ی پلیمری (یکی از انواع جدید ترکیباتی است که NO را در حالت کنترل شده‌ای در محیط آبی رها می‌کند) می‌باشد. پلیمر پلی اتیلن ایمین سلولز NONOate به صورت موضعی به زخم‌های پوستی ایجاد شده در رت‌ها اثر داده شدند. زخم‌هایی که با این پلیمر اثر داده شده بودند در روز‌های 7، 10 و 17 نسبت به زخم‌های گروه کنترل، درصد بالایی از بسته شدن زخم‌ها را نشان دادند. پانسمان هیدروژلی ساخته شده از اتصال پلی وینیل الکل (PVA)95 با دهنده‌ی NO به عنوان حامل رها کننده‌ی NO برای زخم‌ها استفاده می‌شود. در صورتی که این پانسمان هیدروژلی در شرایط in vitro به فیبروبلاست‌ها اثر داده شد، افزایش تولید ماتریکس خارج سلولی از فیبروبلاست‌ها دیده شد و زمانی که به زخم‌ها اثر داده شد، افزایش بافت گرانولاسیون و ضخامت بافت زخم مشاهده شد. یکی دیگر از کمپلکس‌های دهنده‌ی NO، کمپلکس NO- ناپروکسن می‌باشد که یک مشتق ناپروکسن رها کننده‌ی NO است. زمانی که این کمپلکس به زخم‌های جراحی اثر داده شد، 62% افزایش رسوب کلاژن را به همراه داشت.
دهنده‌های NO برای درمان عفونت‌ها و زخم‌های دیابتی استفاده می‌شوند. SNAP در فرم کرم به زخم‌های پوستی که آلوده به لیشمانیا هستند اثر داده می‌شود. تیمار با کرم منجر به درمان عفونت زخمی ‌طی سی‌امین روز شد، در حالی که در زخم کنترل پیشرفت چندانی مشاهده نشد. دهنده NO، مولسیدومین96 (N- اتوکسی کربومیل-3- مورفولینیل- سیدنونیمین) به زخم‌های دیابتی اثر داده شد. نتایج نشان می‌داد که دهنده‌ی NO سبب افزایش رسوب کلاژن و مقاومت در هر دو گروه کنترل و گروه زخم دیابتی می‌شد. سیلدنافیل97، یک مهار کننده‌ی فسفو دی استراز می‌باشد و به عنوان ترکیب جدیدی است که با مهار هیدرولیز cGMP98 باعث طولانی‌تر شدن اثر NO می‌شود. سیلدنافیل سیترات در افزایش آنژیوژنز و گشادی رگ‌ها در زخم ایجاد شده در سگ‌ها شد (88).

فصل سوم
مواد و روش‌ها

3-1. مواد و وسایل و دستگاه های بکار رفته در آزمایش
موش Balb/c (8-12 هفته)
لیپو پلی ساکارید سالمونلا انتریکا
کیت سنجش نیتریک اکسید
کیت سنجش هیدروژن پراکسید
کیت سنجش سیکلواکسیژناز-2
کتامین
زایلازین
مورفین
پتیدین
جنتامایسین
ست جراحی
PBS
فرمالین 10%
اتانول 70%
لایزینگ بافر
سلول‌های فیبروبلاست
FBS
تریپسین
محیط کشت DMEM
XTT
PMS
پنیسیلین استرپتومایسین
رنگ تریپان بلو
لام نئوبار
بیوپسی پانچر
هود لامینار
انکوباتور CO2
میکروسکوپ اینورت
پیپت پاستور 10 ml
فلاسک کشت 25, 75 cm2
فالکن 15, 50 ml
تیوب‌های استریل 2 ml
پلیت 96 خانه
الایزا ریدر
پیپتور
ورتکس
سمپلر و سر سمپلر

3-2. طرز تهیه‌ی محلول‌ها و معرف‌های بکار رفته
3-2-1. محیط کشت DMEM
محیط کشت DMEM با گلوکز بالا و غنی شده با L-glutamate به صورت آماده از شرکت آریوژن خریداری می‌گردید. بسته‌های خریداری شده به حجم 500 ml بود و به منظور جلوگیری از آلودگی، در فالکون‌های 50 ml تقسیم شده و در یخچال نگهداری شدند.
FBS
در این پژوهش از سرم جنین گاو استفاده شد. نقش سرم در محیط کشت تأمین فاکتور‌های رشد هورمون‌ها و برخی اسید آمینه‌ها و پیش‌ساز‌های اسید نوکلئیک و اسید چرب می‌باشد. به منظور غیر فعال کردن کمپلمان موجود در آن، در بن ماری در دمای 56 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه حرارت داده شد. پس از غیر فعال کردن کمپلمان‌ها، FBS در لوله‌های فالکون استریل تقسیم و در فریزر 20- درجه نگهداری شد. میزان مصرف آن در محیط کشت DMEM 10% می‌باشد.
3-2-2. بافر PBS
یک عدد قرص PBS در 200 ml آب مقطر دو بار تقطیر حل شد. سپس با استفاده از فیلتر استریل شده و در لوله‌های فالکون 50 ml استریل، الیکوت و در 20- نگهداری شد.
3-3. کشت سلول‌های فیبروبلاست
سلول‌های فیبروبلاست از بانک سلولی آزمایشگاه کشت سلولی دانشگاه تربیت مدرس تهیه شده و در شرایطی استریل به آزمایشگاه مربوطه منتقل شدند. به منظور آماده‌سازی محیط کشت فیبروبلاست، به محیط کشت DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco) FBS و پنسیلین- استرپتومایسین در شرایط کاملاً استریل مخلوط و در یخچال نگهداری شد. هر بار پیش از مصرف، دمای آن به کمک حمام آب گرم به 37 درجه سانتی‌گراد رسانیده می‌شد. محیط کشت DMEM مشتق از MEM می‌باشد که حاوی حداقل مواد لازم برای رشد سلول (اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها و نمک‌ها) می‌باشد. بافر PBS به صورت استریل و از اختلاط KCl،KH2PO2 ، NaCl، Na2HPO4 تهیه و به عنوان محلول شستشو قبل از جداسازی سلول‌ها و همچنین به عنوان رقیق کننده تریپسین مورد استفاده قرار گرفت. این بافر هم در یخچال نگهداری و قبل از مصرف به دمای 37 درجه سانتی‌گراد رسانیده شد.
سلول‌های فیبروبلاست تحت شرایط استریل در فلاسک T-75 و در انکوباتور با دمای 37 درجه و %5 CO2و رطوبت 95% کشت داده شدند. سلول‌ها هر روز برای بررسی میزان رشد و تکثیر و همچنین آلودگی احتمالی یا تخریب سلولی زیر میکروسکوپ معکوس مورد مشاهده قرار گرفتند و محیط کشت آنها به هنگام لزوم (مثلاً کاهش pH محیط و تغییر رنگ آن از قرمز به زرد) تعویض گردید. هنگامی‌که سلول‌ها تقریباً 90% سطح فلاسک را می‌پوشاندند، پاساژ سلولی انجام می‌گرفت و پس از پاساژ دهم، از سلول‌ها برای انجام مطالعات سیتوتوکسیسیتی استفاده شد. برای پاساژ، مایع رویی فلاسک دور ریخته شد و برای اینکه محیط کشت به طور کامل خارج شود محلول استریل PBS اضافه گردیده و تخلیه شد. در این مرحله به فلاسک عاری از محیط کشت، تریپسین آماده اضافه شد و فلاسک به مدت یک دقیقه در انکوباتور نگهداری شد تا سلول‌های چسبیده به کف جدا شده و به صورت معلق درآیند. سپس محتویات فلاسک به لوله‌های فالکن استریل منتقل شدند تا با دور RPM 1500‌ به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شوند. پس از اتمام سانتریفیوژ، مایع رویی فالکن‌ها در زیر هود تخلیه شده و مجدداً محیط کشت اضافه شد و با عمل پیپتاژ کلمپ‌های سلولی از هم باز شدند. در این مرحله سلول‌های موجود در سوسپانسیون بدست آمده با استفاده از رنگ‌آمیزی تریپان بلو و لام نئوبار با کمک میکروسکوپ معکوس، شمارش شدند.
3-4. آماده‌سازی غلظت‌های مختلف لیپو پلی ساکارید
در این تحقیق از LPS سالمونلا انتریکا که از شرکت سیگما خریداری شده بود برای تیمار فیبروبلاست‌ها استفاده شد. به منظور جلوگیری از آلودگی، محلول استوک LPS به میزان 2/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در آب دو بار تقطیر استریل تهیه شده و در میکروتیوب‌های استریل در یخچال نگهداری شدند. جهت رقیق‌سازی LPS و بدست آوردن غلظت‌های مختلف از محیط کشت فیبروبلاست به عنوان رقیق کننده استفاده گردید. غلظت‌ها به صورت نیم لگاریتمی‌ و در محدوده‌ی 100، 6/31، 10، 16/3، 1 میکرو گرم تا 316، 100، 6/31، 10، 16/3 نانوگرم تهیه شدند. با توجه به اینکه LPS تمایل زیادی به چسبیدن به دیواره‌ی ظرف دارد قبل از هر بار استفاده عمل ورتکس انجام می‌گردید.
3-5. تیمار لیپو پلی ساکاریدی فیبروبلاست‌ها
پس از تهیه‌ی غلظت‌های مختلف LPS، محتویات هر میکروتیوب به ردیف‌های traff 12 خانه منتقل شدند. برای تیمار، سلول‌ها به دو گروه تقسیم‌بندی شدند. گروه اول گروهی بود که تیمار آنها بدون انکوباسیون 24 ساعته بود یعنی دقیقاً همان روزی که سلول‌ها در پلیت کشت داده شدند بدون هیچ وقفه‌ای تیمار هم برای آنها انجام گرفت. گروه دوم گروهی بود که سلول‌هایی که از 24 ساعت قبل در پلیت‌های 96 خانه در انکوباتور کشت داده شده بودند توسط LPS تیمار گردیدند. به ازای هر 50 ماکرولیتر سلول، 50 ماکرو لیتر هم از غلظت‌های مختلف LPSدر هر ردیف اثر داده شد. سپس پلیت‌های تیمار داده شده به مدت 24، 48 و 72 ساعت در انکوباتور نگهداری شدند تا برای رنگ‌آمیزی XTT آماده شوند.
3-6. رنگ‌آمیزی XTT
24 ساعت قبل از انجام این رنگ‌آمیزی، سلول‌ها در پلیت 96 خانه کشت داده شدند. بطوری که به هر چاهک 100 ماکرولیتر از محیط کشت اضافه گردید. هر تست یک بلانک داشت که فقط حاوی محیط کشت بود. برای شروع کار، معرف XTT و معرف فعال