آلودگی احتمالی صورت گرفت.
شکل 3-2. نگهداری از حیوانات آزمایشگاهی
3-13-1. روش‌های نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی
3-13-1-1. نیاز‌های محیطی موش کوچک آزمایشگاهی
نگهداری موش‌ها نیاز به ابزار غیر معمول و ویژه‌ای ندارد. نگهداری و پاسداری از آنها نسبتاً ساده است و به همین دلیل به عنوان یک حیوان آزمایشگاهی بسیار مناسب است. با این حال مانند دیگر حیوانات، آماده کردن محیط، تغذیه و شیوه‌ی مدیریت مناسب برای تأمین نیاز‌های آنها و جهت حفظ سلامتی و تندرستی موش‌های آزمایشگاهی ضروری است. محیطی که برای زیست انسان مطلوب است برای موش‌ها نیز مناسب است. بایستی توجه داشت که دمای درون قفس موش معمولاً یک تا چهار درجه‌ی فارنهایت گرم‌تر و رطوبت آن 5 تا 10 درصد بیشتر و همچنین غلظت‌های بیش‌تری از آمونیاک و سایر گاز‌های بد بو وجود دارد. با وجود این، سفارش‌های ضروری که جهت حفظ محیط زندگی انسان به کار بسته می‌شود برای محیط زیست موش‌ها نیز قابل اجرا است. دمای مناسب برای محیط زیست موش 19-27 درجه سانتیگراد سفارش شده است. در دمای بالاتر از 32 درجه سانتیگراد مرگ و میر موش‌ها زیاد است. رطوبت نسبی برای موش میان 40 تا 70 درصد توصیه شده است. همچنین باید توجه داشت که هوای اتاق 10-15 بار در ساعت تهویه شود. این کار به منظور بیرون کردن گاز آمونیاک و دیگر بو‌ها و نیز عوامل بیماریزا انجام می‌گیرد. نور اتاق موش باید به وسیله‌ی یک زمان سنج خودکار به شیوه‌ای تنظیم شود که 12 ساعت روشن و 12 ساعت تاریک باشد. شدت نور توصیه شده برابر 100 شمع فوت مربع در محیط کار است. این شدت نور برای فعالیت حیوان کافی به نظر می‌رسد. نور لازم جهت انجام اعمال زیستی موش به مراتب کمتر از مقدار فوق می‌باشد. لازم به یادآوری است که تنها بخش اندکی از نور اتاق وارد بعضی از قفس‌های موش می‌شود.
سروصدای بوجود آمده در محیط زیست موش باید به صورت حساب شده‌ای کنترل شود. سروصدای بیش از اندازه سبب اختلال در زاد و ولد حیوانات آزمایشگاهی می‌شود. برخی از صداهای گوش خراش شبیه زنگ باعث ایجاد تشنج در موش‌ها می‌گردد. این نوع حملات را تشنجات ناشی از صدا می‌نامند. بعضی از نژاد‌های موش مثل DBA/2 برای بروز این نوع تشنجات آماده‌تر از نژاد‌های دیگر می‌باشند.
3-13-1-2. بستر مناسب
تهیه‌ی بستر مناسب برای موش‌ها چندین هدف را برآورد می‌کند. بستر به عنوان عایقی حرارتی عمل کرده، ادرار و مدفوع موش‌ها را به خود می‌کشد. همچنین حیوان برای ساختن آشیانه نیز از آن استفاده می‌کند. بستر یاد شده بایستی جذب کننده بوده و به آسانی قابل خوردن توسط حیوان نباشد. ضمناً به دور از مواد آلوده و زیان‌آور بوده و برای حیوان راحت باشد. این نوع بستر از موادی مانند خاک اره، چوب کالج، تراشه چوب صنوبر و چوب ذرت و تراشه چوب جنگلی ساخته و پرداخته می‌شود. تراشه چوب درخت سرو باعث پایین آمدن آستانه تشنج در موش‌هایی که داروی تزریقی دریافت می‌کنند می‌گردد و بنابراین استفاده از آن سفارش نمی‌شود.
3-13-1-3. رعایت اصول بهداشتی در نگهداری و پرورش موش کوچک آزمایشگاهی
حفظ سلامت حیوانات آزمایشگاهی مستلزم رعایت اصول بهداشتی است. اتاق حیوان‌ها باید تمیز و مرتب باشد و قفس‌های موش‌ها یک تا سه بار در هفته مطابق اصول بهداشتی تمیز شوند. قفس‌های کثیف باید به یک جای ویژه تمیز کردن قفس‌ها منتقل شده و گرد وخاک آنها نیز گرفته شود. قفس‌ها را نباید در اتاق حیوانات تمیز کرد زیرا این عمل ممکن است موجب پراکنده شدن گرد و خاک و ذرات آلوده در هوا شود. برای بیرون کردن مواد اضافی درون قفس می‌توان از جارو برقی و یا سیستمی‌که با هوای فشرده کار می‌کند، استفاده نمود. پس از تمیز کردن گرد و خاک قفس، باید آنرا در راستای اصول بهداشتی پاکیزه کرد. دلخواه‌ترین روش، شستن قفس در یک دستگاه مکانیکی است که به همین منظور ساخته شده است. از ماشین شستشوی قفس نیز می‌توان استفاده کرد. در این ماشین از مواد پاک کننده و آب با دمای 82 درجه سانتیگراد استفاده می‌شود.
در صورتی که گروه موش‌ها کوچک باشد از شستشوی با دست همراه با یک پاک کننده می‌توان استفاده کرد. آنگاه قفس را با آب کاملاً شسته و سپس آن را در یک محلول ضد عفونی کننده مناسب غوطه‌ور می‌سازند. پس از آماده کردن بستر مناسب می‌توان قفس را دوباره مورد استفاده قرار داد. در موقع لزوم بطری‌های آب موش‌ها باید با بطری‌های کاملاً ضد عفونی شده یا بهداشتی دارای آب تازه و پاک، جابجا شود. جهت پر کردن دوباره بطری‌ها، در صورتی که شسته نمی‌شوند، بهتر است آب بطری‌ها را کاملاً خالی و سپس از نو پر نمود. کلیه بطری‌ها بایستی حداقل هفته‌ای یکبار برابر اصول بهداشتی تمیز شوند. کف قفس‌ها، سرپوش و ظروف غذا و غیره باید تمیز شده و به طور منظم، همواره پیش از تماس با حیوانات مختلف به خوبی ضدعفونی شوند.
برای پیشگیری از آلودگی‌ها، غذا و بستر موش‌ها باید مورد بازرسی منظم قرار گیرند. استفاده از یک ابزار مناسب دسته‌دار به جای دست، روش منحصر به فردی می‌باشد زیرا میزان آلودگی را کم می‌کند. دست افرادی که مستقیماً با حیوانات کار می‌کنند، عامل انتقال بیماری در میان حیوانات است. به همین دلیل هنگام کار با موش‌ها از دستکش یا انبری که نوک آن لاستیکی است استفاده می‌شود زیرا تمیز و بهداشتی کردن این وسایل آسان می‌باشد.
3-13-1-4. تغذیه
موش‌ها نیز مانند سایر حیوانات، احتیاج به تغذیه مناسب و جیره غذایی متعادلی دارند. موش‌ها در برابر کمبود غذا نسبت به حیوانات دیگر حساس‌تر هستند. مهم‌ترین علامتی که در کمبود غذایی مشاهده می‌شود لاغری مفرط، مرگ زودرس، اسهال و کانی بالیسم یا هم نوع خواری است. یک موش سفید بالغ به طور متوسط روزانه نیاز به 10-15 کالری انرژی دارد و روی این اصل مواد قندی قسمت اعظم غذای موش را تشکیل می‌دهد. از این میزان مواد قندی 24-26% آن را می‌توان از سلولز تأمین نمود. پروتئین‌ها با منشأ گیاهی یا حیوانی می‌توانند 15 تا 28% احتیاجات پروتئینی حیوان را تأمین کنند ولی مصرف بیش از حد 28% پروتئین ممکن است عوارضی را در موش به وجود آورد. نسبت کلسیم به فسفر نباید از 5/1 کمتر و از 5/2 بیشتر باشد. موش قادر نیست ویتامین و اسیدآمینه مورد نیاز خود را در بدن بسازد و روی این اصل این ترکیبات را از طریق مواد خوراکی به بدن حیوان می‌رسانند.
فرآورده‌های غذایی موش به صورت پلت موجود می‌باشد. محتویات غذای موش معمولاً در برگیرنده حبوبات، مکمل‌های پروتئینی همانند سویا و شیر خشک، همچنین چربی به شکل روغن ذرت یا چربی‌های حیوانی، ویتامین‌ها و مواد معدنی است. غذای موش باید از یک سازمان یا فروشنده اسم و رسم دار خریداری شود که توجهات لازم را از نظر تهیه غذا‌های مقوی و بدون پاتوژن‌ها، هورمون‌ها، آنتی‌بیوتیک و سایر دارو‌های معمول داشته باشد. همراه بودن این ترکیبات با غذا ممکن است تأثیر شایان توجهی در نتایج آزمایش داشته باشد.
شکل 3-3. نحوه قرار گیری موش های آزمایشگاهی در قفس های مخصوص
3-14. اجرای الگوی زخم
موش‌هایی با وزن 20-30 گرم با تزریق داخل صفاقی کتامین و زایلیزین در طول مدت جراحی بیهوش گردیدند. متعاقب آن مو‌های قسمت پشتی موش‌ها به کمک خودتراش برقی تراشیده و توسط اتانول 70% ضدعفونی شد. چهار زخم مدور یکسان با فواصل مساوی از یکدیگر در ناحیه‌ی پشتی موش‌ها توسط بیوپسی پانچر با ضخامت 3 میلی‌متر ایجاد شد. الگوی زخم مورد استفاده برای این تحقیق بر اساس کار مورتون و مالون و به صورت excision wound model اجرا شد. بافت‌های پوستی با دقت تمام تشریح و خارج شدند و زخم‌های ایجاد شده در طول مدت تحقیق بدون هیچ پوششی باز ماندند. روز اجرای الگوی زخم به عنوان روز صفر زخم محسوب شد. 24 ساعت بعد از روز اجرای الگو، دو تا از چهار تا زخمی‌که در سمت راست بدن موش‌ها ایجاد شده بود با لیپو پلی ساکارید تیمار شدند و دو تای دیگر هم که در سمت چپ بدن موش‌ها بودند به عنوان زخم‌های کنترل انتخاب شدند. این تیمار‌ها به مدت 3 روز، در ساعت مشخص و توسط یک نفر صورت گرفت.
موش‌ها به چهار گروه مساوی که شامل پنج موش در هر گروه می‌شد تقسیم‌بندی شدند و هر موش به طور جداگانه در یک قفس مجزا قرار داده شد که در شرایط استاندارد و با تغذیه‌ی مناسب نگهداری شدند. گروه اول در روز اول بعد از اثر لیپو پلی ساکارید مورد بیوپسی قرار گرفت، گروه دوم در روز دوم پس از تیمار لیپو پلی ساکارید، گروه سوم در روز سوم و گروه چهارم هم در روز هفتم پس از تیمار لیپو پلی ساکارید مورد بیوپسی قرار گرفت. این نمونه‌های بافتی پوستی برای آزمایشات بیوشیمیایی و پاتولوژیکی آماده‌سازی شدند، به این صورت که یک زخم کنترل و یک زخم تیمار از یک موش به عنوان یک نمونه در روز مشخص برای بررسی پاتولوژیکی گرفته شد و همچنین یک زخم کنترل و یک زخم تیمار از همان موش به عنوان یک نمونه در روز مشخص برای بررسی‌های بیوشیمیایی انتخاب شد. تمام مراحل جراحی بر اساس کمیته‌ی اخلاقی انیستیتو پاستور ایران و تحت شرایط استاندارد صورت گرفت.
شکل 3-4. روز صفر پس از اجرای الگوی زخم
3-15. تیمار موضعی لیپو پلی ساکارید
به منظور بررسی پتانسیل التهابی لیپو پلی ساکارید به طریق invivo، محلول تهیه شده لیپو پلی ساکارید به مدت 3 روز و 24 ساعت بعد از اجرای الگوی زخم به صورت موضعی و مستقیماً به بستر زخم اثر داده شد. همانطور که قبلاً ذکر شد دو تا از چهار تا زخمی‌که در سمت راست بدن موش‌ها ایجاد شده بود، با دوز یکسانی از LPS (μg 100) مورد تیمار قرار گرفتند. گروه کنترل زخم‌ها هم به صورت موضعی به مدت 3 روز و 24 ساعت بعد از اجرای الگوی زخم در همان شرایط یکسان با PBS تیمار شدند.
روز اول
روز دوم روز سوم روز هفتم
شکل 3-5. روزهای مختلف پس از اجرای الگوی زخم
عکس 3-6. نحوه‌ی گرفتن بیوپسی از محل زخم و تقسیم‌بندی نمونه‌ها به منظور انتقال به آزمایشگاه‌های بیوشیمی و پاتولوژی. نمونه‌های پاتولوژی در فرمالین 10% و نمونه‌های مربوط به بخش بیوشیمی در ازت مایع نگهداری شدند.
3-16. آماده‌سازی لیزات بافت
نمونه‌های بافت با بافر لیز کننده‌ای که حاوی فسفات بافر سالین (PBS 0.05% Tween20) و مهارکننده‌ی پروتئاز(pro-block cocktails anti-protease, manufacturers Gouldbio Inc. USA) بود هموژنیزه گردیدند. هر ویال پروبلاک با 500 ماکرولیتر از diluter موجود در کیت حل شد و به ازای هر 500 ماکرولیتر از آن، 50 میلی‌لیتر بافر PBS استفاده شد. همچنین لازم به ذکر است که به ازای هر 1/0 گرم از بافت پوست، 1 میلی‌لیتر از بافر PBS حاوی پروبلاک استفاده شد. سپس بافت‌های حاوی بافر لیز کننده در دستگاه هموژنایزر 10000 دور در دقیقه هموژن شدند. بافت‌های هموژن شده به مدت 10 دقیقه با دور 4000rpm سانتریفیوژ شدند و سوپرناتانت‌های حاصل به منظور اندازه‌گیری NO، H2O2، COX-2 جمع‌آوری گردیدند.
3-17. تعیین میزان نیتریک اکسید برای نمونه‌های بافتی لیز شده
سنجش نیتریک اکسید به کمک کیت رنگ سنجی (Nitric Oxide assay kit, Biovision, Ca, USA) انجام گرفت. با توجه به اینکه نیمه عمر نیتریک اکسید کم بوده و ناپایدار است سریعاً به نیتریت و نیترات، اکسید می‌شود. که این محصولات برای تعیین میزان نیتریک اکسید مد نظر قرار می‌گیرند. اساس این کیت در دو مرحله خلاصه می‌شود. در مرحله‌ی اول نیترات توسط نیترات ردوکتاز به نیتریت تبدیل می‌شود. در مرحله‌ی دوم با استفاده از معرف گریس105، نیتریت به ترکیبی با رنگ ارغوانی تبدیل می‌شود.
3-17-1. آماده‌سازی نمونه‌ها:
85 ماکرولیتر از نمونه‌ها برای هر سنجش استفاده شد که دو مرتبه باید انجام می‌گرفت. در صورتی که کمتر از این مقدار استفاده شود باید با بافر حجم آنها را به 85 ماکرولیتر رساند. برای هر نمونه یک بلانک در نظر گرفته شد.
3-17-2. روش کار:
برای بلانک‌های هر نمونه (با حجم 85 ماکرولیتر) مقدار 115 ماکرولیتر از بافر اضافه
