پایان نامه ارشد با موضوع تغییر رنگ، رطوبت نسبی

کننده PMS سریعاً قبل از آغاز آزمایش به دمای 37 درجه رسانیده شد. برای آماده‌سازی محلول واکنشگر کافی برای یک پلیت 96 خانه 120 ماکرولیتر PMS و 6 میلی‌لیتر XTT نیاز بود. بعد از اضافه کردن محلول واکنشگر به هر چاهک، پلیت مربوطه به مدت 2 و 4 ساعت در انکوباتور نگهداری شد. سپس میزان جذب نوری نمونه‌ها توسط الایزا ریدر (ELISA-reader) با طول موج 450-500 نانومتر سنجیده شد.
حساسیت روش XTT به دلیل حضور یک عامل فعال کننده به نام PMS (N- متیل دی بنزوپیرازین متیل سولفات) که نوعی حامل الکترون واسطه است تقویت می‌شود. ترکیب PMS به احیای XTT و تشکیل مشتقات فورمازان کمک می‌کند. روش XTT به دلیل عدم استفاده از ایزوتوپ‌های رادیواکتیو ایمن‌تر از MTT می‌باشد. با توجه به اینکه جذب رنگ در این روش متناسب با تعداد سلول‌ها در هر چاهک است دقیق‌تر از MTT می‌باشد. این روش طی یک مرحله در دو ساعت جواب می‌دهد. در این روش به غیر از دو معرف XTT و PMS هیچ معرف اضافی دیگر و شستشوی سلولی مورد نیاز نیست.

شکل 3-1. احیای کلرومتریک XTT با آنزیم‌های سلولی

3-7. رنگ‌آمیزی تریپان بلو
این آزمایش برآوردی تقریبی از viability سلول‌ها بود که بر اساس عدم جذب رنگ تریپان بلو توسط سلول‌های زنده استوار می‌باشد. در حالی که سلول‌های مرده نسبت به این رنگ نفوذپذیر بودند. این رنگ تمایل زیادی به پروتئین‌های موجود در سرم دارد به همین دلیل قبل از رنگ‌آمیزی سلول‌ها به خوبی با PBS شسته داده شدند تا پروتئین‌های باقی مانده سرم کاملاً از محیط خارج شوند.
Mg400 پودر تریپان بلو را وزن کرده و در آب مقطر به حجم 100 ml رسانده شد. سپس محلول را از فیلتر عبور داده و برای ممانعت از رشد قارچ چند قطره سدیم آزاید به آن اضافه گردید.
3-8. شمارش سلولی
به منظور شمارش سلولی، پس از تریپسینه کردن و جدا نمودن سلول‌ها از کف فلاسک محیط حاوی سلول به لوله استریل منتقل شده و با دور 1000 rpm به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی دور ریخته شد و 1 ml از محیط DMEM به رسوب اضافه و با پیپت پاستور استریل کاملاً مخلوط گردید، سپس با استفاده از لام نئوبار تعداد سلول‌ها در خانه‌های مربوط به گلبول سفید شمارش شد و از فرمول زیر تعداد سلول‌ها در 1 ml محاسبه شد.
تعداد سلول در 104 = 1 ml × میانگین تعداد سلول‌های شمارش در 4 خانه
3-9. تعیین درصد زنده بودن سلول‌ها
جهت تعیین درصد سلول‌های زنده، 100 μlاز سوسپانسیون سلولی با 100 μl رنگ تریپان 4% مخلوط شده، پس از 2 تا 3 دقیقه یک قطره از این مخلوط را برداشته و یا استفاده از لام نئوبار و در خانه‌های مربوط به شمارش گلبول سفید تعداد سلول‌ها شمارش شد. به دلیل وجود پمپ‌های سدیم و پتاسیم رنگ تریپان بلو در سلول‌های زنده باقی نمی‌ماند در صورتی که در سلول‌های مرده رنگ نفوذ کرده و نمی‌تواند خارج شود لذا سلول‌های مرده رنگ آبی را به خود می‌گیرند. با شمارش سلول‌های زنده‌ی بی‌رنگ و سلول‌های مرده‌ی آبی رنگ و با استفاده از فرمول زیر درصد زنده بودن سلول‌ها تعیین شد.
درصد زنده بودن سلول‌ها = تعداد سلول‌های زنده/ تعداد کل سلول‌ها
3-10. تعیین میزان نیتریک اکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی
پس از تیمار سلول‌های فیبروبلاست با لیپو پلی ساکارید طبق روشی که قبلاً به آن اشاره شد، سلول‌ها تحت‌تأثیر بافر لیز کننده قرار گرفتند و پس از ورتکس، فریز شدند. سنجش نیتریک اکسید به کمک کیت رنگ سنجی (Nitric Oxide assay kit, Biovision, Ca, USA) انجام گرفت. با توجه به اینکه نیمه عمر نیتریک اکسید کم بوده و ناپایدار است سریعاً به نیتریت و نیترات، اکسید می‌شود. که این محصولات برای تعیین میزان نیتریک اکسید مد نظر قرار می‌گیرند. اساس این کیت در دو مرحله خلاصه می‌شود. در مرحله‌ی اول نیترات توسط نیترات ردوکتاز به نیتریت تبدیل می‌شود. در مرحله‌ی دوم با استفاده از معرف گریس99، نیتریت به ترکیبی با رنگ ارغوانی تبدیل می‌شود.
3-10-1. آماده‌سازی نمونه‌ها
85 ماکرولیتر از نمونه‌ها برای هر سنجش استفاده شد که دو مرتبه باید انجام می‌گرفت. در صورتیکه کمتر از این مقدار استفاده شود باید با بافر حجم آنها را به 85 ماکرولیتر رساند. برای هر نمونه یک بلانک در نظر گرفته شد.
3-10-2. روش کار
برای بلانک‌های هر نمونه (با حجم 85 ماکرولیتر) مقدار 115 ماکرولیتر از بافر اضافه شد. برای نمونه‌ها 5 ماکرولیتر از نیترات ردوکتاز به هر چاهک اضافه شد. سپس 5 ماکرولیتر کوفاکتور آنزیم به هر چاهک اضافه شد. پلیت مربوطه پوشانده شد و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه گردید تا نیترات به نیتریت تبدیل شود. سپس 5 ماکرولیتر از تقویت کننده100 به هر چاهک اضافه شده و به مدت 10 دقیقه انکوبه شد. در مرحله‌ی بعد 50 ماکرولیتر از معرف گریس R1 و 50 ماکرولیتر هم از معرف گریس R2 به هر چاهک اضافه شد. بعد از 10 دقیقه تغییر رنگ مشاهده می‌شود. این تغییر رنگ تا یک ساعت پایدار می‌باشد. میزان جذب توسط پلیت ریدر و در طول موج 540 نانومتر خوانده شد.
3-11. تعیین میزان هیدروژن پراکسید در نمونه‌ی لیز شده سلولی
سلول‌های فیبروبلاست در پلیت‌های 96 خانه به مدت 24 ساعت کشت داده شدند سپس مورد تیمار غلظت‌های مختلف از لیپو پلی ساکارید قرار گرفتند. این سلول‌ها در سه مدت زمان 24، 48 و 72 ساعت مورد بررسی قرار گرفتند. بطوری که به ازای هر μl 100 سلول و محیط کشت، 100 μl بافر لیز کننده به هر چاهک اضافه گردید و 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردیدند. محتویات چاهک‌ها به میکروتیوب‌های 2 ml انتقال داده شد و به مدت 1 دقیقه ورتکس شدند. این نمونه‌ها فریز شده و برای سنجش آماده شدند. سنجش پراکسید هیدروژن با کیت کلرومتریک (Hydrogen peroxide assay kit, Biovision, Ca, USA) انجام گرفت. اساس این کیت بر این قرار است که در حضور HRP101، OxiRedTM Probe با هیدروژن پراکسید وارد واکنش شده تا محصولی رنگی با بیشینه طول موج 570 نانومتر تولید شود.
3-11-1. آماده‌سازی نمونه‌ها:
سوپرناتانت کشت سلولی (حاوی 6-8/0 میکرومولار H2O2) به مدت 15 دقیقه با دور 1000g سانتریفیوژ شده و تکمه یا پلت سلولی حذف شد. نمونه‌های محیط کشت سلولی باید توسط فیلتر چرخشی102 kDa MW (Biovision, Cat 1997-25)10 فیلتر می‌شدند تا تمام پروتئین‌ها خارج شوند. سپس در دمای 80- درجه نگهداری شدند. 50-2 ماکرولیتر از نمونه‌ها به هر چاهک ریخته شد و حجم آنها با بافر به حجم 50 ماکرولیتر رسانده شد.
3-11-2. منحنی استاندارد H2O2:
10 ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید103 (0/88M) در 870 ماکرولیتر آب مقطر حل شد تا استاندارد هیدروژن پراکسید (0/1mM) ایجاد شود. سپس 10 ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید (10mM) را در 990 ماکرولیتر آب مقطر حل شد تا استاندارد هیدروژن پراکسید (0/1mM) ایجاد شود. مقادیر 0، 10، 20، 30، 40، 50 ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید (0/1mM) دو مرتبه در چاهک‌های پلیت 96 خانه ریخته شد تا مقادیرnmol 0، 1، 2، 3، 4، 5 در هر چاهک ایجاد شود.
3-11-3. مخلوط واکنش:
برای هر چاهک 50 ماکرولیتر از مخلوط واکنش104 آماده شد که شامل 46 ماکرولیتر بافر، 2 ماکرولیتر محلول OxiRedTM Probe و 2 ماکرولیتر محلول HRP بود. 50 ماکرولیتر از مخلوط واکنش به چاهک‌های حاوی نمونه و استاندارد هیدروژن اضافه شده، به خوبی مخلوط شده و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردیدند. سپس میزان جذب نوری (OD) آنها در طول موج 570 نانومتر توسط میکروپلیت ریدر اندازه‌گیری شد.
3-12. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 در نمونه لیز شده سلولی
به منظور بررسی اثرات تیمار LPS بر تغییرات سطح COX-2، سلولها با غلظتهای مختلف LPS شامل100، 6/31، 10، 16/3 ، 1 میکروگرم بر میلی‌لیتر و 316، 100، 6/31، 10، 16/3 نانوگرم بر میلی‌لیتر در مدت زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت مجاور شدند و اندازه‌گیری سطح COX-2 در نمونههای لیز شده سلولی انجام شد.
3-12-1. مواد
سلول‌های فیبروبلاست پاساژ 10
LPS
کیت سنجش COX-2 (Assay designs & Stressgen Inc. Michigan, USA),
3-12-2. آماده‌سازی محلولها:
بافر شستشو: 25 ml بافر تغلیظ شده موجود در کیت با 975 ml آب مقطر دیونیزه مخلوط گردید.
استاندارد COX-2: ابتدا µl 500 آب دیونیزه به ویال حاوی استاندارد COX-2 موجود در کیت اضافه شده و محلولی با غلظت ng/ml 550 تهیه گردید. برای تهیه استانداردهای بعدی، ابتدا هفت میکروتیوب را شماره‌گذاری کرده و سپس 750µlبافر سنجش در میکروتیوب شماره 1 و µl 500 بافر در هر یک از تیوبهای 2 تا 7 ریخته شد. در مرحله بعد µl 250 از استاندارد ng/ml 550‌ تازه تهیه شده به تیوب شماره 1 اضافه شده و به خوبی مخلوط گردید. سپس از محتویات ظرف شماره 1، µl 500‌ برداشته و به تیوب شماره 2 اضافه گردید و همین روند تا تیوب هفتم تکرار شد. به این ترتیب استانداردهایی با غلظتهای 70، 35، 5/17، 75/8، 38/4، 19/2، 09/1 ng/ml در میکروتیوبهای 1 تا 7 تهیه گردید.
کنژوگه آنتی بادی نشاندار شده: تمام حجم محلول موجود در یکی از ظرفهای محتوی محلول رقیق کننده آنتی‌بادی را به ویال حاوی کنژوگه آنتی‌بادی اضافه کرده و به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق به آرامی ‌ورتکس گردید.
3-12-3. آماده‌سازی نمونه
برای تهیه لیزات سلولی، پس از برداشت سلولها به وسیله rubber policemen، سلولها را با دور 1000g به مدت 10 دقیقه در 4 درجه سانتی‌گراد سانترفیوژ شدند. سپس مایع رویی را دور ریخته و تکمه سلولی حاصل را با 1-2ml بافر سرد (5mM پتاسیم فسفات pH 7.4، محتوی 9/0% سدیم کلراید و 1/0% گلوکز) هموژنیزه می‌کنیم. سپس سلولها را با دور 10000 g به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتی‌گراد سانترفیوژ کرده و مایع رویی را دور می‌ریزیم.
3-12-4. روش کار
به هر یک از چاهکهای پلیت 96 چاهکی، µl 100 از استانداردهای تهیه شده و همچنین نمونهها به صورت دو بار تکرار اضافه و در دو چاهک نیز به عنوان استاندارد 0، µl 100‌ بافر بدون استاندارد ریخته شد. به منظور مخلوط کردن محتویات چاهکها پلیت به مدت چند دقیقه به آرامی‌ تکان داده شد و پس از آن سطح پلیت را پوشانده و نمونه‌ها در درمای به مدت 1 ساعت انکوبه گردیدند. پس از آن محتویات چاهکها خالی شده و پس از آن هر یک از چاهکها شش مرتبه و هر مرتبه با µl 200 بافر شتشو شسته شد. سپس در مرحله آخر پلیت را به آرامی ‌برگردانده تا باقیمانده محلول شستشو تخلیه گردید. پس از این مرحله، µl 100 آنتی‌بادی نشاندار به تمام چاهکها بجز چاهک بلانک اضافه شده و پس از پوشاندن سطح پلیت، نمونهها به مدت 30 دقیقه در انکوبه شدند. دراین فاصله 30 دقیقه‌ای محلول سوبسترا به نحوی که در مرحله آماده‌سازی نمونه گفته شد، آماده شد. پس از این مرحله مجدداً تخلیه چاهکها و شستشو انجام شد. چاهکها 9 بار و هر بار با µl 200 محلول شستشو شسته شده و پس از آخرین مرحله، با برگرداندن پلیت به آهستکی از تخلیه تمام محلول شستشو در چاهکها اطمینان حاصل شد. µl 100‌ سوبسترای TMB به هر چاهک اضافه گشته و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شد. پس از گذشت 30 دقیقه، با افزودن H2SO4100µl به هر یک از چاهکها، واکنش خاتمه یافته و پس از صفر کردن دستگاه با کنترل، جذب نوری نمونهها در 450nm قرائت گردید. با به دست آوردن OD نمونهها، میانگین OD خالص به شیوه زیر محاسبه و پس از رسم منحنی استاندارد، غلظت COX-2 در نمونههای مجهول محاسبه گردید.
میانگین OD خالص= میانگین OD نمونهها- میانگین OD بلانک
3-13. حیوانات آزمایشگاهی انتخاب شده برای تحقیق
موش‌های نر سویه‌ی Balb/c (8-12 هفته) از آزمایشگاه حیوانات انیستیتو پاستور ایران خریداری شده و به آزمایشگاه مربوطه منتقل شدند. به منظور سازگاری حیوان‌ها با محیط جدید آزمایشگاهی، به مدت یک هفته تحت شرایط استاندارد در دمای 19-21 درجه سانتیگراد با رطوبت نسبی 40-60% و چرخه ی 12 ساعت شب/ 12 ساعت روز در قرنطینه نگهداری شدند. موش‌ها با دسترسی آسان به پلت‌های مخصوص حیوانات و آب تغذیه گردیدند. طی این تحقیق نگهداری موش‌ها بدون هیچگونه