شد. برای نمونه‌ها 5 ماکرولیتر از نیترات ردوکتاز به هر چاهک اضافه شد. سپس 5 ماکرولیتر کوفاکتور آنزیم به هر چاهک اضافه شد. پلیت مربوطه پوشانده شد و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه گردید تا نیترات به نیتریت تبدیل شود. سپس 5 ماکرولیتر از تقویت کننده106 به هر چاهک اضافه شده و به مدت 10 دقیقه انکوبه شد. در مرحله‌ی بعد 50 ماکرولیتر از معرف گریس R1 و 50 ماکرولیتر هم از معرف گریس R2 به هر چاهک اضافه شد. بعد از 10 دقیقه تغییر رنگ مشاهده می‌شود. این تغییر رنگ تا یک ساعت پایدار می‌باشد. میزان جذب توسط پلیت ریدر و در طول موج 540 نانومتر خوانده شد.
3-18. تعیین میزان هیدروژن پراکسید برای نمونه‌های بافتی لیز شده
سنجش پراکسید هیدروژن با کیت کلرومتریک(Hydrogen peroxide assay kit, Biovision, Ca, USA) انجام گرفت. اساس این کیت بر این قرار است که در حضور HRP107، OxiRedTM Probe با هیدروژن پراکسید وارد واکنش شده تا محصولی رنگی با بیشینه طول موج 570 نانومتر تولید شود.
3-18-1. آماده‌سازی نمونه‌ها:
سوپرناتانت جمع‌آوری شده از بافت هموژن شده (حاوی 6-8/0 میکرومولار H2O2) به مدت 15 دقیقه با دور 1000g سانتریفیوژ شده و تکمه یا پلت سلولی حذف می‌شود. نمونه‌های لیزات بافت باید توسط فیلتر چرخشی108 kDa MW (Biovision, Cat 1997-25)10 فیلتر می‌شدند تا تمام پروتئین‌ها خارج شوند. سپس در دمای 80- درجه نگهداری شدند. 50-2 ماکرولیتر از نمونه‌ها به هر چاهک ریخته شد و حجم آنها با بافر به حجم 50 ماکرولیتر رسانده شد.
3-18-2. منحنی استاندارد H2O2
10 ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید109 (0/88) در 870 ماکرولیتر آب مقطر حل شد تا استاندارد هیدروژن پراکسید (0/1mM) ایجاد شود. سپس 10 ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید (10mM) را در 990 ماکرولیتر آب مقطر حل شد تا استاندارد هیدروژن پراکسید (0/1mM) ایجاد شود. مقادیر 0، 10، 20، 30، 40، 50 ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید (0/1mM) دو مرتبه در چاهک‌های پلیت 96 خانه ریخته شد تا مقادیرnmol 0، 1، 2، 3، 4، 5 در هر چاهک ایجاد شود.
3-18-3. مخلوط واکنش:
برای هر چاهک 50 ماکرولیتر از مخلوط واکنش110 آماده شد که شامل 46 ماکرولیتر بافر، 2 ماکرولیتر محلول OxiRedTM Probe و 2 ماکرولیتر محلول HRP بود. 50 ماکرولیتر از مخلوط واکنش به چاهک‌های حاوی نمونه و استاندارد هیدروژن اضافه شده، به خوبی مخلوط شده و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردیدند. سپس میزان جذب نوری (OD) آنها در طول موج 570 نانومتر توسط میکروپلیت ریدر اندازه‌گیری شد.
3-19. اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 برای نمونه‌های بافتی لیز شده
به هر یک از چاهک‌های پلیت 96 چاهکی، µl 100 از استاندارد‌های تهیه شده و همچنین نمونه‌ها به صورت دو بار تکرار اضافه و در دو چاهک نیز به عنوان استاندارد 0، µl 100 بافر بدون استاندارد ریخته شد.به منظور مخلوط کردن محتویات چاهک‌ها، پلیت به مدت چند دقیقه به آرامی‌تکان داده شد و پس از آن سطح پلیت را پوشانده و نمونه‌ها در درمای به مدت 1 ساعت انکوبه گردیدند. پس از آن محتویات چاهک‌ها خالی شده و هر یک از چاهک‌ها شش مرتبه و هر مرتبه با µl 200 بافر شستشو شسته شد. سپس در مرحله آخر پلیت را به آرامی‌برگردانده تا باقیمانده محلول شستشو تخلیه گردد. پس از این مرحله، µl 100 آنتی‌بادی نشاندار به تمام چاهک‌ها بجز چاهک بلانک اضافه شده و پس از پوشاندن سطح پلیت، نمونه‌ها به مدت 30 دقیقه در انکوبه شدند. دراین فاصله 30 دقیقه‌ای محلول سوبسترا آماده شد. پس از این مرحله مجدداً تخلیه چاهک‌ها و شستشو انجام شد. چاهک‌ها 9 بار و هر بار با µl 200 محلول شستشو شسته شده و پس از آخرین مرحله، با برگرداندن پلیت به آهستکی از تخلیه تمام محلول شستشو در چاهک‌ها اطمینان حاصل شد. به هر چاهک µl 100 سوبسترای TMB اضافه گشته و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شد. پس از گذشت 30 دقیقه، با افزودن H2SO4 100µl به هر یک از چاهک‌ها، واکنش خاتمه یافته و پس از صفر کردن دستگاه با کنترل، جذب نوری نمونه‌هادر 450nm قرائت گردید. با به دست آوردن OD نمونه‌ها، میانگین OD خالص به شیوه زیر محاسبه و پس از رسم منحنی استاندارد، غلظت COX-2 در نمونه‌های مجهول محاسبه گردید.
میانگین OD خالص= میانگین OD نمونه‌ها- میانگین OD بلانک
3-20. بررسی هیستوپاتولوژیکی بافت‌های زخم شده
به منظور آنالیز هیستوپاتولوژیکی، در هر کدام از روز‌های 1، 2، 3 و 7 تعداد 5 سر موش انتخاب شد. برای گرفتن بیوپسی از محل زخم، موشها با تزریق داخل صفاقی کتامین و زایلیزین در طول مدت جراحی بیهوش گردیدند. بیوپسی به طریقی گرفته شد که نمونه‌ها از قسمت اپیدرم، درم و بافت شل زیر جلدی بود. پس از جراحی موشها به صورت جداگانه در هر روز، نمونه‌های بافتی بدست آمده به طور جداگانه هر کدام در فرمالین 10% نگهداری شدند. نمونه‌ها به آزمایشگاه پاتولوژی منتقل شدند تا رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین ائوزین111 (H&E) برای آنها صورت گیرد. عمل آبگیری با سری‌های الکل انجام شد، عمل پاکسازی با گزیلن و قالب‌گیری در موم پارافین صورت گرفت. لایه‌های 6-4 میکرومتر تهیه شده و عمل رنگ‌آمیزی انجام شد.
3-21. آنالیز آماری
آنالیز آماری داده‌ها توسط نرم‌افزار SPSS ورژن 20 انجام شد. میزان نیتریک اکسید، سیکلواکسیژناز و هیدروژن پراکسید بین نمونه‌های شاهد و تیمار با آزمون ANOVA tTest آنالیز شدند. میزان Pvalue˂0.05 به عنوان تفاوت معنادار بین گروه‌ها شناخته شد. در بررسی اثر بخشی دوز LPS از آزمون آماری آنالیز واریانس یک طرفه112 استفاده شد. برای این منظور، تمامی‌مشاهدات تیمار بر اساس دوز استفاده شده در گروههای مختلف قرار گرفتند. در بررسی اثر LPS بر آنزیمها در زخم موشها از آزمون آماری t زوجی113 استفاده شد. داده‌ها بر اساس میانگین ±انحراف معیار نشان داده شده‌اند.
فصل چهارم
نتایج
4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 و 48 ساعت)
تعداد سلول‌های فیبروبلاست در محیط کشت اگر از یک میزانی بیشتر شود به سبب تولید متابولیت‌هایی مانع از رشد سلول‌های همجوار خود در محیط می‌شوند، بنابراین باید اپتیمم میزان سلولی رعایت شود. به منظور مشخص کردن تعداد سلول‌های بهینه‌ی مورد نیاز برای آزمایش، قبل از تیمار، سلول‌های فیبروبلاست در تعداد‌های مختلف از 104×8 تا 102×65/1 در پلیت‌های 96 خانه به مدت 24 و 48 ساعت کشت داده شدند. میزان پرولیفراسیون سلول‌ها با تست XTT اندازه‌گیری شد. نتایج نشان داد که برای پلیت مربوط به 24 ساعت، تعداد سلول بین 10 تا 20 هزار (میانگین 15 هزار) و برای پلیت مربوط به 48 ساعت، تعداد سلول بین 5 تا 10 هزار سلول (میانگین 7500) اپتیمم تعداد سلول برای انجام آزمایش است. البته برای جبران محیط کشت اضافه شده توسط LPS به هر چاهک تعداد سلول‌های مورد نیاز برای مرحله‌ی تیمار دو برابر محاسبه شد.
نمودار 4-1. بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از 24 ساعت)
