منبع پایان نامه درمورد (P، روز)،

دانلود پایان نامه ارشد

ت 25 و 45 روز) کاهش معنی داری (P<0.05) در شاخص های اسپرماتوژنز (ضریب سلول سرتولی و ضریب میوزی)، پارامترهای استریولوژیک (قطر و ارتفاع اپی تلیوم، تعداد سلول های لیدیگ) به همراه تغییرات مورفولوژیک در بافت بیضه شامل آتروفی لوله های منی ساز، کاهش تعداد سلول های زایا، افزایش تعداد ماست سل هاو افزایش فضای بینابینی در بافت همبند بینابینی را نشان دادند. سلول های اسپرماتوژنیک در موشهای تحت درمان با سیکلوسپورین آ واکنش ضعیفی نسبت به رنگ آمیزی PAS، واکنش بالایی نسبت به رنگ آمیزی با سودان بلک و آلکالین فسفاتاز نشان دادند. علاوه بر این تجویز داروی سیکلوسپورین کاهش معنیدار درتعداد اسپرم ها (P<0.05) و افزایش معنیدار اسپرم های مرده و غیرطبیعی و اسپرم های با کروماتین آسیب دیده را موجب گردید. حال آنکه درمان همزمان با عصاره آبی گیاه زالزالک و هسته انگور بهبود قابل ملاحظه ای را در پارامترهای مذکور سبب گردید. یافته های بدست آمده از این مطالعه نشان می دهد که داروی سیکلوسپورین آ به واسطه اعمال استرس اکسیداتیو می تواند موجبات آسیب بافت بیضه را فراهم آورد، درحالی که عصاره ابی گیاه زالزالک و روغن هسته انگور به سبب دارا بودن قابلیت مهار رادیکال های آزاد و فرآیند های اکسیداتیو می توانند به گونه ای موثر در برابر واکنش های ناخواسته ناشی از این دارو نقش ایفا کند. آنها همچنین باعث بهبود روند رشد جنینی، کیفیت جنین ها و سبب افزایش درصد اووسیت های لقاح یافته، جنین های دو سلولی، بلاستوسیستها و کاهش توقف جنینی و افزایش میزان شکافتگی و بهبود مورفولوژی جنین های کشت داده شده گردید (P<0.05).
کلمات کلیدی: رت، سیستم تولید مثلی، سیکلوسپورین، عصاره زالزالک، عصاره هسته انگور

فصل اول
مقدمه وهدف
1-1) ناباروری
ناباروری مشکلی است که هماکنون بسیاری از زوجها را درگیر میکند و موجب از هم پاشیدگی بسیاری از خانوادهها میشود و به عنوان یک بحران روانی، استرس زیادی را بر زوجهای نابارور وارد نموده و به طرق گوناگون سلامت روانی آنها را تهدید میکند.Freeman et al., 1985)). در ۱۰ درصد موارد ناباروری مردان، عدم وجود اسپرم در مایع انزال علت اصلی ناباروری میباشد (Matzuk and Lamb, 2007) .
اولین گام جهت بررسی و ارزیابی باروری و یا میزان سلامت تولیدمثلی مردان، تخمین پارامترهای اسپرمی توسط آنالیز مایع منی میباشد. آنالیز اسپرم شامل محاسبه تراکم، درصد تحرک و بررسی مورفولوژی اسپرم میباشد. حداقل میزان این پارامترها در باروریهای طبیعی، از طریق بررسی پارامترهای اسپرمی در زوجهای بارور، توسط سازمان بهداشت جهانی به صورت دورهای اعلام میشود. با توجه به اینکه مقادیر طبیعی اعلام شده توسط سازمان بهداشت جهانی از طریق بررسی جمعیتهای بارور تعیین میشود، در مواردی که پارامترهای اسپرمی در دامنه مقادیر طبیعی قرار نگیرند، فرد نابارور محسوب میشود و متعاقب آن مشکلات اجتماعی و فشارهای روحی بسیاری برای زوجین بوجود میآید.
استفاده از برخی داروها در درمان بیماریها باعث اختلال تولید اسپرم و در نهایت منجر به عقیمی در مردان میشود (Dollery, 1999). پیدایش تکنیک جراحی پیوند اعضاء در پزشکی دریچه وسیعی برای نجات بعضی بیماران گشوده است که بدون شک افزایش طول عمر، بقا و سلامت این بیماران بعداز عمل پیوند متضمن استفاده از داروهای مهارکننده سیستم ایمنی1 می باشد. امروزه مشکل اساسی در پیوند اعضا پیچیدگی محافظت سیستم ایمنی گیرنده عضو در مقابل واکنشهای ایمنی – تخریبی عضو بیگانه در بدن میباشد. در حال حاضر عوامل و داروهای سرکوبگر مختلفی نظیرکورتیکواستروئیدها، سیکلوسپورین، میکوفنولات موفتیل و اسپراگولین و یا عوامل سیتوتوکسیک نظیر آزاتیوپرین، سیکلوفسفامید حتی آنتی بادی ایمونوساپرسیو به منظور سرکوب سیستم دفاعی بدن گیرنده عضو مورد استفاده قرار میگیرند. از میان داروهای ذکر شده سيكلوسپورين از داروهاي ايمونوساپرسور اصلي است كه در بيماران پيوند كليه استفاده ميشود.
سيكلوسپورين آ با افزایش سطح ترومبوكسانB2 ، فعاليت سيتوكرومP- 450 ، مالونيل دي آلدئيد، لاكتات دهيدروژناز، گليكوليك اكسيداز ، گزانتين اكسيداز و به دنبال آن توليد انواع راديكالهاي آزاد باعث ايجاد حالت نفروتوكسي و هپاتوتوكسي و غيره ميشود. اين اختلالات ممكن است به طور ثانوي منجر به تغييرات تخريبي و اختلال عمل كرد بيضه شوند (Adhirai and Selvam, 1998; Durak et al., 1998 ). عصارههای حاصل از قسمتهای مختلف گیاه زالزالک دارای اثرات آنتیاکسیدانی بوده و قادر به مهار آنیون سوپراکسید، رادیکال هیدروکسیل، پراکسیدهای هیدروژن و نیز پراکسیداسیون لیپیدی میباشند (Bahorun et al., 1996). فعالیتهای آنتی اکسیدانی و مهار رادیکال های آزاد نتیجه عملکرد ترکیبات فنلی و فلاونوئیدهای موجود در این گیاه میباشد (Zhang et al., 2001). عصاره هسته انگور دارای خاصیت آنتی اکسیدانتی و مهار فعالیت رادیکال های آزاد می باشد (Jayaprakasha et al., 2003). بسیاری از اثرات بهداشتی مفید عصاره هسته انگور به مهار خواص آنتی اکسیدانی و رادیکال های آزاد نسبت داده شده است (Faria et al., 2006). به دلیل اینکه عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور دارای خواص آنتیاکسیدانتی بوده و باعث مهار رادیکالهای آزاد و کم کردن تخریب سلولی میشوند در این تحقیق از آنها استفاده شده است.
هدف از این مطالعه بررسی اثر عصاره هسته انگور سیاه و عصاره زالزالک بر روی تغییرات هیستوشیمی بیضه وتوان باروری (IVF) رتهای نر (Rat) تیمار شده با داروی سیکلوسپورین است.

کلیات
2-1)دستگاه تولید مثل نر در پستانداران
دستگاه تولید مثلی در جنس نر از بیضهها، مجاری تناسلی، غدد ضمیمه و آلت تناسلی تشکیل شده است. این دستگاه ارتباط نزدیکی با سیستم ادراری داشته و اغلب تحت عنوان دستگاه اوروژنیتال معروف است.
بیضهها در مرحله جنینی در پشت پرده صفاق و مجاور دیواره خلفی حفره شکم تکامل مییابند (رجحان، 1367)، سپس به طرف اسکروتوم که در انتهای طنابهای اسپرماتیک قرار گرفته، مهاجرت کرده و درون آن آویزان میشوند. در هنگام مهاجرت به اسکروتوم، هر بیضه با خود کیسه ای سروزی به نام تونیکا واژنالیس را حمل می کند که از صفاق منشأ می گیرد. این پوشش دارای یک لایه جداری خارجی و یک لایه احشایی داخلی است که در قسمت های جلویی و طرفینی بیضه، سفیدپرده را پوشانده است(Junqueira, 2005). فضایی که بین لایه جداری و لایه احشایی تونیکا واژینالیس وجود دارد تحت عنوان فضای واژینال نامیده میشود (Eurell, 2006). سفید پرده در سطح خلفی بیضه ضخیم شده و مدیاستینوم بیضه یا تیغه میانی بیضه را تشکیل میدهد که از این قسمت دیوارهای فیبری به درون بیضه نفوذ کرده و آنرا به 250 بخش هرمی شکل موسوم به لبولهای بیضه تقسیم میکنند. این دیواره ها کامل نبوده و معمولا ارتباطاتی بین لبول ها وجود دارد. هر لبول بوسیله یک تا چهار لوله منی ساز اشغال شده است (.(Junqueira, 2005 فضای بین لوله ها توسط بافت همبندی غنی از عروق خونی و لنفی، سلولهای مختلف همبندی و سلولهای آندوکرینی اشغال شده است. بیضه به عنوان یک غده مختلط دارای دو بخش درون ریز وبرون ریز می باشد. بخش درون ریز هورمونهایی نظیر تستسترون، استروژن و اینهیبین ترشح میکند و بخش برون ریز لوله های منی ساز هستند که اسپرماتوزوئیدها را میسازند (Eurell, 2006).

3-1) آناتومی بیضه ها
بیضه غده زوجی است که به علت تولید سلولهای جنسی، غده سلولزا نامیده میشود(رجحان، 1376). شکل و اندازه آن در گونه های مختلف متفاوت میباشد. برای تولید نرمال اسپرم، این غده باید حدود 1تا4 درجه سانتیگراد پایینترنسبت به متوسط درجه حرارت بدن قرار گیرند.تنظیم این دما تا حدی بواسطه تبادل حرارتی از طریق عروق شریانی و وریدی انجام میگیرد که به دور بافت بیضه پیچیدهاند (بیگدلی، 1383). عوامل دیگر کنترل دما عبارتند از تبخیرعرق از اسکروتوم و انقباض عضلات کرماستر در طناب اسپرماتیک که سبب کشیده شدن بیضهها به کانال اینگوینال شده و دمای آنها را افزایش میدهد (Junqueira, 2005). وزن هر بیضه در انسان حدود 40 گرم میباشد، قطر قسمت طولی بیضه حدود 5/4 سانتیمتر میباشد. 80% بیضه یک فرد بالغ متشکل از لولههای مولد منی است و 20% باقی مانده مربوط به کپسول و داربست بیضوی است که در داخل آن سلول های لیدیگ پراکنده شدهاند (بیگدلی، 1383) .
4-1) اجزای اصلی تشکیل دهنده بیضه
بیضه از عناصری مجزا که از نظر عملی با هم برهم کنش دارند تشکیل شده است.
جزء اول، سلولهای لیدیگ که سلولهای ویژه تولید استروئیدی هستند. فراورده اصلی آنها تستسترون است که آثار موضعی مهم بر همانند سازی سلولهای زایا و همینطور سلولهای هدف دورتر دارد (بیگدلی، 1383).
جزء دوم، سلولهای میوئید دور لولهای، که در بیضه نابالغ تحت عنوان سلولهای پیرامون لوله ای (Peritubular Cell) معروفند و با بلوغ جنسی تحت تأثیر هورمونهای هیپوفیزی و آندروژنها خاصیت انقباضی پیدا میکنند (Eurell, 2006). دو نوع انقباض در این لولهها دیده میشود: نوع اول باعث به جلو راندن محتویات لوله میگردد. این نوع انقباض احتمالا در انتقال اسپرم رها شده به شبکه بیضه نقش دارد. نوع دوم: انقباض موضعی است وباعث دور کردن سلولهای زایای پیش میوزی از غشاء پایه میگردد و همچنین به رها سازی اسپرم در فرآیند اسپرم ریزی کمک میکند (Lamp, 1988).
جزءسوم ، لولههای منی ساز هستندکه اسپرماتوزوئیدها را تولید می کنند. هر بیضه از250 تا 1000 لوله منیساز تشکیل شده است. هر لوله منیساز با یک اپیتلیوم مطبق پیچیده مفروش شده است، قطرآن در انسان در حدود 250-150 میکرومتر و طول آن حدود 30تا70 سانتیمتر است (Junqueira, 2005). لولههای منیساز در هنگام تولد، توپر بوده و دو نوع سلول در آنها یافت میشود. یک عدد سلولهای درشت که همان P.G.C2 ها هستند و تقسیم شده، اسپرماتوگونیها را تشکیل میدهند. دسته دیگر سلولهای غیرمتمایز هستند که بعداً به سلولهای سرتولی تبدیل میشوند. تا هنگام بلوغ، تقسیمات سلولی تجدید شده و تکامل P.G.C ها آغاز میشود و لولههای منیساز که تاکنون توپر بوده دارای مجرا میشوند (بیگدلی،1383).
1-4-1) سلولهای سری اسپرماتوژنز
سلولهای متنوع و متفاوتی از بافت پوششی لولههای منیساز هستند که در 4 تا 8 لایه در کنار یکدیگر قرار گرفته و فضای بین لایه قاعدهای تا مجرای لوله را اشغال میکنند. این سلولها به ترتیب در برگیرنده چند نسل سلول های اسپرماتوگونی با عنوان گروه A وB روی غشای پایه و سپس یک نسل اسپرماتوسیت اولیه، یک نسل اسپرماتوسیت ثانویه، یک نسل اسپرماتید ویک نسل اسپرماتوزوئید است(Eurell, 2006).
2-4-1) سلولهای پشتیبان یا سرتولی
سلولهای هرمی شکل هستند که قاعده آنها به لایه بازال میچسبد، در حالی که انتهای رأسی آنها معمولاً تا مجرای لوله منیساز امتداد مییابد. این زوائد به عنوان مجراهایی هستند که سلولهای زایا در مراحل مختلف رشد و تکامل دربین آنها قرار داشته و به سمت مجرا حرکت میکنند. بعد از بلوغ اسپرماتوسیتها، اتصالات محکم جدیدی بین زوائد سلولهای سرتولی در پشت آنها پدید میآید و اتصالات قدیمی جلوی آنها باز میشود و به این ترتیب بدون در هم ریختن جامعیت سد خونی- بیضوی که توسط سیتوپلاسم سلولهای سرتولی ایجاد شده است، اسپرماتوسیتها از بخش قاعدهای به بخش مجرائی عبور میکند. سیتوپلاسم این سلولها به عنوان فیلتر عمل کرده و تنها به مواد خاصی اجازه عبور میدهند(بیگدلی، 1383). این سد در حفظ سلولهای زایای جنس مذکّر در مقابل مواد مضر موجود در خون دارای اهمیت است. در زیر این اتصالات، اسپرماتوگونیها در یک محوطه قاعدهای قرار میگیرند و در نتیجه به راحتی به مواد درون خون دسترسی مییابند. هنگام اسپرماتوژنز، سلولهای اسپرماتوسیت لپتوتن نهایی و زیگوتن، از این اتصالات گذشته و در محوطه جنب مجرایی قرار میگیرند. از اینجا به بعد، مراحل پیشرفتهتر اسپرماتوژنز به کمک سد خونی- بیضوی از دسترس مواد موجود در خون حفظ میشوند. سلولهای سرتولی بوسیله اتصالات شکافدار نیز به هم متصل شدهاند که خود سبب ایجاد ارتباط یونی و شیمیایی بین سلولها میشود. چنانچه در انسان و حیوانات دیگر شرایط نامطلوبی مانند عفونت، سوء تغذیه و تشعشع اشعه X به سلول های سرتولی آسیب برساند، باعث اختلال سریع در فرایند اسپرماتوژنز میشود و در صورتی که مرگ سلولهای سرتولی رخ دهد، عدم باروری حاصل میگردد که دائمی خواهدبود (Junqueira, 2005).
سلولهای سرتولی با همکاری سد خونی- بیضوی اعمال زیر را انجام میدهند :
پشتیبانی، حفاظت و تغذیه اسپرماتوزوئیدهای درحال تکامل، فاگوسیتوز در حین اسپرمیوژنز، سیتوپلاسم باقیمانده اسپرماتیدها به صورت اجسام باقیمانده از آنها جدا میگردد. این قطعات سیتوپلاسمی بوسیله سلولهای سرتولی فاگوسیته شده و توسط لیزوزوم آنها تجزیه میگردند علاوه براین چنانچه ذرات خارجی و باکتریها به اینجا رسیده باشند توسط سلولهای سرتولی بیگانه خواری میشوند (جلوگیری از واکنشهای خود ایمنی). سلولهای سرتولی به طور مداوم مایعی به درون لولههای منیساز ترشّح میکنند که در جهت مجاری تناسلی جریان یافته و برای حمل اسپرم به کار میرود. با کنترل هورمون FSH، یک پروتئین متصل شونده به آندروژن (ABP) ترشح میکند که مسئول تغلیظ تستوسترون در درون لولههای منیساز میباشد (رجحان، 1376). سلولهای سرتولی قادر به تبدیل تستسترون به استرادیول هستند. این سلولها پپتیدی به نام اینهیبین نیز ترشح میکنند که ساخت و آزاد شدن FSH در بخش قدامی غده هیپوفیز را مهار میکند. همچنین تولید هورمون آنتیمولرین، که یک گلیکوپروتئین است و در دوره جنینی، تحلیل مجاری مولر را در جنین مذکر تحریک میکند (Junqueira, 2005).

5-1) بافت بینابینی
فضاهای بین لولههای منیساز در بیضه، بوسیله تجمعات بافت همبند، اعصاب، خون و عروق لنفاوی اشغال شدهاند. بافت همبند از سلولهای مختلفی تشکیل شده است که عبارتند از: فیبروبلاستها، سلولهای همبندی تمایز نیافته، ماست سلها و ماکروفاژها (Junqueira, 2005). در موش صحرایی ماکروفاژها مهمترین سلولهای تشکیل دهنده بافت بینابینی در بیضه میباشند (Lamp, 1988). به هنگام بلوغ نوع دیگری از سلول بنام سلولهای بینابینی یا لیدیگ ظاهر میشود. این سلولها هورمون مردانه، یعنی تستوسترون را تولید میکنند(Junqueira, 2005).
6-1) مجاری تناسلی داخل بیضه
مجاری دستگاه تولید مثل نر، مسئول ذخیره اسپرماتوزوآ پس از ترک بیضه میباشند. این مجاری عبارتند از:
1-6-1) لولههای مستقیم
لولههای مستقیم لولههای کوتاه و بدون پیچ خوردگی بوده که لولههای منیساز را به شبکه بیضه ارتباط میدهند و توسط بافت پوششی مکعبی تا استوانهای ساده مفروش میشوند. در این لولهها تبدیل بافت پوششی از مکعبی مطبق لولههای منی ساز به نوع ساده در محل اتصال لولههای منیساز به لولههای مستقیم ناگهانی بوده و سلولهای سری اسپرماتوژنزبه تکرار نا پدید شده و تنها سلولهای سرتولی تغییر شکلیافته باقی میمانند (Junqueira, 2005)
2-6-1) شبکه بیضه یا شبکه هالر
در ناحیه مدیاستن بیضه واقع شده و دارای بافت پوششی از نوع سنگفرشی، مکعبی یا استوانهای ساده است (Junqueira, 2005). کانالهای این شبکه در دوران جنینی ایجاد میشوند اما اپیتلیوم آنها تا شروع اسپرماتوژنز ساختار ویژه خود را پیدا نمیکند. این شبکه مایعات لوله منیساز را از طریق لولههای مستقیم دریافت میکند(Lamp, 1988).

3-6-1) مجاری آوران
مجرای آوران از شبکه بیضه خارج شده، در سر اپیدیدیم به یکدیگر متصل میگردند و مجرای منفرد اپیدیدیم را ایجاد میکنند. در اپیدیدیم مجاری آوران دو نوع سلول دیده میشوند. یکی مژهدار و دیگری بدونمژه که تعداد سلولهای بدون مژه بیشتر است و این سلولهای دارای عملکرد ترشحی و جذبی میباشند. زنش مژه در سلولهای مژه دار به حرکت اسپرماتوزوئیدها به سمت اپیدیدیم کمک میکند (Hermo, 1985).
4-6-1) مجرای اپی دیدیم یا بربخ
اپیدیدیم در انسان و جوندگان آزمایشگاهی از سه بخش سر ،تنه و دم تشکیل شده است .سر اپی دیدیم توسط مجاری آوران به بیضه متصل است و دم توسط بافت پیوندی در تماس با بیضه میباشد. اپیدیدیم لولهای منفرد و بسیار پیچ خورده است که به شکل طبیعی طول آن چند سانتیمتر است .اما طول کلی لوله بیش از 6 متر در انسان و 2 متر در رت میباشد( Lamp, 1988). اپیتلیوم اپی دیدیم از نوع استوانهای شبه مطبق با مژههای ثابت (Stereocilia) میباشد که این مژههای ثابت باعث افزایش سطح جذب و ترشح بافت اپی دیدیم میشود (Eurell, 2006). اسپرماتوزوئیدها در حین عبور از اپیدیدیم قابلیت بارور ساختن مییابند و در مدتی که در اپیدیدیم حضور دارند، دستخوش تغییراتی در مورفولوژی، ترکیب و عملکرد میگردند و سرانجام متحرک و بارور میشودJunqueira, 2005)).
5-6-1) مجرای وابران
در امتداد اپیدیدیم قرار گرفته است، در انتها ناحیه وسیعی بنام، آمپول ایجاد میکند و سپس دو شعبه میشود. یک انشعاب به کیسه منی منتهی خواهد شد و انشعاب دیگر مجرای انزالی را تشکیل میدهد که از ضخامت پروستات گذشته و به مجرای ادراری میریزد (رجحان،. 1376).

6-6-1) مجرای انزالی
مجرای کوتاه و باریک میباشد که از غده پروستات گذشته به پیشابراه پروستاتی منتهی میشود و به هنگام انزال مایع منی توسط این مجرا به پیشابراه هدایت شده و سپس به خارج برده میشود لذا از این به بعد مجرای ادراری با مجرای انتقال منی یکی میشود (رجحان، 1376).
7-1) غدد ضمیمه دستگاه تناسلی
بیشترحجم مایع سمینال شامل مواد ترشحی غدد ضمیمه جنسی است.
غدد ضمیمه عبارتند از:
1-7-1) کیسه منی
کیسه منی یا وزیکول سمینال به صورت یک جفت غده در سطح پشتی مثانه قرار گرفته است، مجرای وابران هر طرف به کیسه منی باز می شود. ترشحات وزیکول سمینال ماده ای چسبنده است که در انسان ۵۰-۸۰ % حجم مایع منی را تشکیل میدهد.pH ماده ترشحی قلیایی است و نقش آن در خنثی کردن اسیدیته مایع واژینال میباشد. مایع سمینال غنی از فروکتوز، ویتامین c و پروستاگلاندین است (رجحان، 1376). اسید سیتریک نیز از مهمترین مواد ترشحی وزیکول سمینال در انسان و جوندگان است. ماده دیگری که توسط وزیکول سمینال ترشح میشود کوآگولینوژن میباشد که در تشکیل پلاک جفتگیری نقش دارد (Lamp, 1988. .(
2-7-1) پروستات( prostat)
پروستات در زیر مثانه اولین بخش پیشابراه را احاطه کرده است. پروستات تأمینکننده ۱۵-۳۰% حجم منی می باشد غدد پروستات به سه دسته تقسیم میشوند: غدد مخاطی، غدد زیرمخاطی و غدد اصلی. این سه دسته ترشحات خود را از اطراف به مجرای ادرار میریزند. پروستات رت غنی از فروکتوز و انواعی از پروتئینها میباشد Lamp, 1988)).

3-7-1) غدد پیازی پیشابراهی
غدد پیازی پیشابراه (غدد کوپر)، اندامهای کوچک جفت در دو طرف پیشابراه و در مجاورت بخش پیازی آن قرار گرفتهاند و توسط مجاری بلند به پیشابراهی که از اندام تناسلی عبور میکند متصل میگردند. ترشحات غده پیازی پیشابراهی متشکل از یک ماده شفاف، چسبنده و شبه موکوسی میباشند. در انسان، این ماده پیش از انزال آزاد شده وبه عنوان روان سازنده عمل میکند، در حالیکه در جوندگان دارای یک ماده منعقد کننده است که در تشکیل پلاک جفتگیری نقش دارد (Lamp, 1988).
8-1) اسپرماتوژنز
فرآیند تولید اسپرماتوزوئیدها را اسپرماتوژنز میگویند. اسپرماتوژنز در توبولهای سمینیفر به طور معمول از۱۳سالگی و در نتیجه تحریک هورمونهای گنادوتروپیک هیپوفیز قدامی شروع میشود و تا پایان زندگی ادامه مییابد (Guyton and Hall, 2006). تولید اسپرم بطور پیوسته در سرتاسر دوره زندگی تولیدمثلی مرد انجام میشود، تقریبأ ۲۰۰-۱۰۰ میلیون اسپرم روزانه تولید میشود. برای تولید این مقدار انبوه، نیاز است که اسپرماتوگونیها با تقسیمات سلولی طی چرخه اسپرماتوژنز خود را تجدید کنند (Junqueira, 2005). چرخه اسپرماتوژنز در همه جانوران الگوی یکسان دارد و از سه مرحله مجزا تشکیل میشود که عباتند از:
1-8-1) اسپرماتوسیتوژنز
این فرآیند از یک سلول زایای اولیه (اسپرماتوگونی) که مجاورلایه قاعدهای قرار گرفتهاست، آغاز میشود. به هنگام بلوغ جنسی، این سلول دستخوش یک سری تقسیم میتوز شده و سلولهایی که تازه تشکیل شدهاند، یکی از این دو راه را انتخاب میکنند: این سلولها ممکن است بعد از یک یا چند تقسیم میتوزی باز به تقسیم ادامه داده و به صورت سلولهای بنیادی تمایز نیافته به نام اسپرماتوگونی نوعA درآیند و یا در حین چرخههای پیش رونده میتوزی به اسپرماتوگونی نوع B تمایز حاصل کنند. اسپرماتوگونی نوع B نیز به نوبت به اسپرماتوسیتهای اولیه تبدیل میشود Junqueira, 2005)).

2-8-1) میوز
اسپرماتوسیتهای اولیه، کمی پس از تشکیل در اولین تقسیم میوزی وارد پروفاز میشوند. در این هنگام اسپرماتوسیت دارای ۴۶ کروموزوم وn۴،DNA میباشد. سلول در طی پروفاز یک، از چهار مرحله عبور میکند- لپتوتن، زیگوتن، پاکیتن و دیپلوتن و وارد مرحله دیاکینز میشود که در این مرحله کروموزومها از یکدیگرجدا میشوند. در طی این مراحل از تقسیم میوز، تقاطع ژنهای ۱۶ کروموزومی با یکدیگر صورت میگیرد. پس از آن سلول وارد مرحله متافاز میشود و کروموزومها در مرحله آنافاز به سمت قطبها حرکت میکنند. از آنجائیکه مرحله پروفاز در این تقسیم در حدود ۲۲ روز به طول میانجامد، بیشتر سلولهایی که در مقاطع بافت شناسی مشاهده میشوند، در این مرحله قرار دارند. اسپرماتوسیتهای اولیه بزرگترین سلولهای دودمان اسپرماتوژن هستند. از تقسیم اول میوز سلولهای کوچکتری به نام اسپرماتوسیتهای ثانویه که تنها دارای ۲۳ کروموزوم (X+۲۲،Y+۲۲) هستند، حاصل میشوند. این کاهش تعداد کروموزوم از ۴۶ به ۲۳ همراه با کاهش مقدار DNA از n۴ به n۲ در هر سلول میباشد. مشاهده اسپرماتوسیتهای ثانویه در برشهای بافتی مشکل است. چون این سلولها دارای عمر کوتاه بوده و مدت زمان بسیار کوتاهی در مرحله اینترفاز باقی مانده (۲ تا ۳ روز) سریعاً وارد دومین مرحله تقسیم میوزی میگردند. از تقسیم اسپرماتوسیتهای ثانویه، اسپرماتیدها به وجود میآیند که دارای ۲۳ کروموزوم هستند. چون مرحله s یعنی مرحله سنتز DNA بین تقسیمات اول و دوم میوزی اسپرماتوسیتها وجود ندارند، لذا مقدار DNA موجود در اسپرماتیدها به نصف مقدار DNA اسپرماتوسیتهای ثانویه تقلیل یافته و شامل n ۱ کروموزوم میشود. بنابراین،فرآیند میوز سبب تشکیل سلولهایی با تعداد کروموزومهای هاپلوئید (n۱) میشود. در هنگام لقاح سلولهای جنسی، این تعداد مجدداً به تعداد دیپلوئید طبیعی میرسد. در واقع فرآیند میوز وجود تعداد ثابتی از کروموزومها را در هرگونه از جانوران تضمین میکند(Junqueira, 2005).
3-8-1) اسپرمیوژنز
اسپرماتیدها سلولهایی هستند که در نتیجه تقسیم ثانویه اسپرماتوسیتها به وجود میآیند. این سلولها را میتوان به کمک اندازه کوچک آنها، هسته دارای کروماتین متراکم و قرارگیری در نزدیکی مجرای لولههای منی ساز تشخیص داد. اسپرماتیدها دستخوش یک فرآیند پیچیده تمایز، موسوم به اسپرمیوژنز میشوند که بطور خلاصه شامل مراحل زیر است: تشکیل آکروزوم، متراکم و طویل شدن هسته، تشکیل تاژک و دفع مقدار زیادی از سیتوپلاسم به صورت اجسام باقیمانده نتیجه نهایی این فرآیند تولید اسپرماتوزوئید بالغ است که به واسطه فرآیندی موسوم به اسپرمیاسیون به درون مجرای لولههای منی ساز آزاد میشود.
در تقسیم سلولهای اسپرماتوگونیا، عمل سیتوکینز غیرکامل است، یعنی سیتوپلاسم آنها از هم جدا نمیشود. حاصل تقسیم یک اسپرماتوگونیا، تعداد زیادی اسپرماتوسیت اولیه، ثانویه و اسپرماتید متصل بهم حاصل میباشد که سیتوپلاسم آنها بوسیله پلی بهم متصل بوده و بصورت سین سی تیوم هستند و بعد از تکامل اسپرماتوزونها، اجسام باقیمانده از آنها جدا شده و هر اسپرم منفردا از زنجیره سینسیتیوم جدا میشود (رجحان، 1376).
9-1) مورفولوژی اسپرم
اسپرم از لحاظ ساختمانی به دو بخش سر و دم تقسیم میشود. سر اسپرم در بیشتر گونهها از جمله پستانداران عمدتاً به شکل پهن و بیضی شکل است و در جوندگان سراسپرم داسی شکل میباشند (ضمیری، 1385).
1-9-1) سر اسپرم
سر اسپرم از دو جزء هسته و آکروزوم تشکیل شده است که شکل هسته و آکروزوم نمای سراسپرم را به وجود میآورند.
الف- هسته: هسته سر اسپرم حاوی کروموزوم هاپلوئیدی است که این کروموزومها باید در هنگام باروری وارد تخمک شوند تا با ادغام با هسته تخمک تشکیل مجدد حیات 2n کروموزومی را دهند.از ویژگیهای هسته اسپرم نسبت به هسته سایر سلولهای سوماتیک این است که علاوه بر اینکه n کروموزومی است، کروماتین در هسته بسیار متراکم و یکنواخت میباشد (Eddy et al., 2004). مهمترین عاملی که باعث این فشردگی شدید شده است، جایگزینی پروتئینهای پروتامین به جای پروتئینهای DNA که هیستونها هستند میباشد. این تراکم و فشردگی باعث محافظت DNA در برابر صدمات فیزیکی و شیمیایی میشود (Knobi and Neills).
ب- آکروزوم: قسمت قدامی هسته توسط آکروزوم پوشیده شده است که دو غشاء داخلی و خارجی دارد و در انتهای خلفی این دو غشاء به همدیگر متصل هستند. کلاهک آکروزومی مقادیر متنابهی از آنزیمهای هیدرولیتیک و پروتئولیتیک را دارد. زمانی که پدیده ظرفیتگیری اسپرماتوزوآ در لوله رحمی صورت میپذیرد، این آنزیمها آزاد میشوند و برای ایجاد نفوذپذیری در پرده شفاف اووسیتها وارد عمل میشوند. ناحیه خلفی آکروزوم جایی است که کلاهک نازک شده و مواد درون آن متراکمتر میشوند. این ناحیه بخش استوایی آکروزوم اطلاق میشود(Eurell A, 2006). ازجمله آنزیمهای هیدرولیتیک آکروزوم، آنزیم هیالورونیداز است که اسپرم توسط این آنزیم اتصالات بین سلولهای کومولوس را از بین میبرد و خود را به تخمک میرساند. آنزیم مهم دیگر آکروزین است که اسپرم توسط آن زوناپلوسیدا را تجزیه میکند (ضمیری، 1385).
2-9-1) دم اسپرم
دم یک ساختار تاژک مانند است که حرکت اسپرم را باعث میشود و نیروی لازم برای حرکت اسپرم را فراهم میکند (ضمیری، 1385) و از ۴ قسمت گردن، قطعه میانی- اصلی و انتهایی تشکیل شده است.

ساختمان طبیعی اسپرم انسان

10-1) ارزیابی مورفولوژی اسپرم
بین ظاهر طبیعی اسپرم و تحرک آن، همبستگی مثبت وجود دارد. در تمام انزالها، تعدادی اسپرم غیرطبیعی حضور دارد. ارزیابی مورفولوژی اسپرم پس از رنگ آمیزی با ائوزین- نگروزین انجام میگیرد. اسپرمهای غیرطبیعی به ۵ گروه زیر تقسیم میشوند:
الف- بدون دم ب- سر غیرطبیعی ج- ساختارهای غیرطبیعی دم د- ساختارهای غیرطبیعی دم، به همراه قطره سیتوپلاسمی پیشین ه- ساختارهای غیرطبیعی دم، به همراه قطره سیتوپلاسمی پسین (Hafez, 2000).
11-1( تنظیم هورمونی اسپرماتوژنز
مشخص شده است که محور GnRh – LH/ FSH – testis در روند اسپرماتوژنز ضروری است. مسأله بسیار مهم، آزاد شدن ضربانی GnRH و ورود ضربانی FSH و LH توسط هیپوفیز قدامی به سلولهای هدف میباشد. حداکثر ترشح هورمونهای FSH و LH تنها زمانی حاصل میشود که GnRH به صورت یک جریان پالسی (ضربانی) ترشح میشود. به نظر میرسد که در ابتدای اسپرماتوژنز یعنی تا مرحلهایی که اسپرماتوسیت اولیه تشکیل و به مرحله میوزI وارد میشوند هیچگونه کنترل هورمونی بر اسپرماتوژنز وجود ندارد. در آغاز بلوغ جنسی با افزایش ترشح FSH تحریک سلولهای سرتولی صورت میگیرد، که این تحریک برای شروع تقسیم میتوز سلولهای جنسی و همچنین در ابتدای تقسیم میوز، لازم است. LH سلولهای لیدیگ را تحریک میکند تا تستوسترون ترشح نمایند. تستوسترون به داخل سلولهای سرتولی نفوذ مینماید و در آنجا با تبدیل به استرادیول باعث میشود که استرادیول هم به عنوان یک هورمون تنظیم کننده در فرآیند اسپرماتوژنز مطرح شود.
هورمونهای دیگرغده هیپوفیز در فرآیند اسپرماتوژنز نقشهای جانبی ایفا میکنند. به عنوان مثال بر روی سلولهای لیدیگ، رسپتورهای پرولاکتین وجود دارد. این هورمون باعث افزایش رسپتورهای LH شده و به صورت همکاری با LHموجب تحریک تولید آندروژن میشود. کمبود هورمون رشد به طور واضح شروع عمل دستگاه تولیدمثل را به تأخیر میاندازد. احتمالأ نقش هورمون رشد تحریک سلولهای سرتولی برای تولید فاکتورهای رشد شبه انسولینی است (Guyton and Hall 2006).همچنین گیرندههای انسولین در سلولهای لیدیگ وجود دارند. انسولین عمل تحریکی هورمون LH در سنتز هورمون های استروئیدی را تنظیم مینماید. سایر هورمونهای موجود در گردش خون محیطی نظیر گلوکوکورتیکواستروئیدها و هورمون های تیروئیدی بر عملکرد بافت بیضه تأثیر دارند (Wang, 1999 ).
12-1) ظرفیت یافتن و واکنش آکروزومی اسپرماتوزوئیدها
هنگامی که اسپرماتوزوئیدها در منی به خارج ریخته میشوند، هنوز قادر نیستند اعمال خود را در بارور کردن تخمک انجام دهند. اما بعد از تماس حاصل کردن با مایعات مجرای تناسلی زنانه تغییرات متعددی بوجود میآید که اسپرماتوزوئیدها را برای روندهای نهایی بارور کردن فعال میکنند. این مجموعه تغییرات روی هم، ظرفیت پیدا کردن اسپرماتوزوئیدها نامیده میشوند. این امر به طور طبیعی از ۱۰-۱ ساعت زمان لازم دارد. هورمونهایی مانند کلسیتونین و آنژیوتانسین که در منی یافت میشوند، میتوانند ظرفیت یابی را تحریک کنند. در روند ظرفیتیابی کلسترول از غشاء اسپرم جدا میشود و پروتئینهای سطح غشاء دوباره آرایش مییابند. علاوه بر این، جریان رو به داخل کلسیم رخ میدهد و یک حرکت شلاقی شکل پرقدرت به آن میبخشد که بر خلاف حرکات مواج ضعیف قبلی آن است. این روند سرعت رو به جلوی اسپرم را افزایش میدهد و توانایی آن را برای نفوذ در تخمک تقویت میکند و مهمتر اینکه ظرفیتیابی امکان واکنش آکروزومی را مهیا میسازد. در این واکنش، غشاء آکروزومی با غشاء خارجی اسپرم میپیوندند و سوراخهایی ایجاد میشود که میتواند از میان آنها آنزیم هیدرولیتیک و پروتئولیتیک آکروزومی آزاد شوند. آنزیمهای مزبور سپس مسیری بوجود میآورند که از میان غشاهای محافظتی تخمک برای نفوذ اسپرم راه باز میکند (بیگدلی، 1383). هنگامی که تخمک از فولیکول تخمدانی به داخل حفره شکمی و لوله فالوپ دفع میشود لایههای متعددی از سلولهای گرانولوزا را با خود حمل میکند. قبل از اینکه یک اسپرماتوزوئید بتواند تخمک را بارور سازد، باید ابتدا از لایه سلولهای گرانولوزا عبور کند و آنگاه باید از پوشش ضخیم خود تخمک یعنی ناحیه شفاف عبور کند.پژوهشگران معتقدند که هیالورونیداز موجود در میان این آنزیمها اهمیت ویژهای در باز کردن مسیر در بین سلولهای گرانولوزا دارد. این آنزیمها در ظرف چند دقیقه یک مسیر نفوذی را برای عبور سر اسپرماتوزوئید از ناحیه شفاف میگشایند. سر، ابتدا وارد فضای دور تخمکی که در زیر ناحیه شفاف اما در خارج غشاء اووسیت قرار دارد، میشود. ظرف ۳۰ دقیقه، غشاء سر اسپرماتوزوئید و غشاء اووسیت با یکدیگر جوش خورده و ماده ژنتیکی اسپرماتوزوئید، وارد اووسیت میشود تا موجب باروری آن گردد (Guyton and Hall 2006). در این مرحله پروسه اسپرماتوژنزیز کامل میشود و فرآیند بارورسازی میتواند آغاز شود.
13-1) تستوسترون و سایر هورمون های جنسی نر
بیضه ها چند هورمون جنسی از جمله تستوسترون، دیهیدروتستوسترون و آندرستون دیون ترشح میکنند که به مجموع آنها آندروژن میگویند. تستوسترون به حدی بیشتر از هورمونهای دیگر است که میتوان آن را هورمون اصلی بیضه دانست. این هورمون به وسیله سلولهای لیدیگ ترشح میشود. در دوران کودکی تقریباً هیچ سلول لیدیگی در بیضه وجود ندارد اما تعداد زیادی از این سلولها در طی دوسه ماه نخست پس از تولد ایجاد میشوند. در صورت تخریب اپیتلیوم زایای بیضهها، سلولهای لیدیگ به علت اینکه کمتر آسیب می بینند به تولید تستوسترون ادامه میدهند. حدود 97 درصد از تستسترون پس از ترشح از بیضه ها یا به سستی به آلبومین پلاسما متصل میشود یا به طور محکمتر به نوعی گلوبولین موسوم به گلوبولین متصل شونده به هورمون جنسی اتصال مییابد و بدین شکل 30 دقیقه تا یک ساعت در خون گردش میکند. بخش زیادی از تستوسترونی که در بافت ها مستقر میشود، در سلولها به دی هیدروتستوسترون تبدیل میشود. تستسترونی که در بافتها مستقر نشده به سرعت و عمدتاً در کبد به آندروسترون و دیهیدرو اپیآندروسترون تبدیل میشود و همزمان در کبد با کونژوگاسیون بصورت گلوکورونیدها یا سولفات ها درمیآید که در نهایت از طریق صفرا یا ادرار دفع میشود. منشأ دقیق این استروژن ها مورد تردید است ولی مشخص است که غلظت استروژن در لولههای منیساز کاملاً بالا است و احتمالاً استروژنها نقش مهمی در اسپرمیوژنز دارند. پژوهشگران معتقدند که سلولهای سرتولی این استروژن را از تبدیل بخشی از تستوسترون به استرادیول میسازند(Guyton and Hall 2006).

14-1) تنظیم ترشح تستوسترون
تستوسترون توسط سلول های میان بافتی لیدیگ در بیضهها ترشح میشوند، اما این اتفاق زمانی رخ میدهد که این سلولها توسط LH آزاد شده از هیپوفیز قدامی تحریک شوند. در نتیجه میزان ترشح تستوسترون با میزان LH موجود تقریباً به طور مستقیم افزایش مییابد. سلولهای لیدیگ بالغ به طور طبیعی تا چند هفته بعد از تولد در بیضه کودک یافت میشوند اما بعد از آن به مدت 10 سال ناپدید میشوند. اما تزریق LH خالص به کودک یا ترشح LH در هنگام بلوغ باعث میشود سلولهایی در نواحی میان بافتی بیضهها که شبیه فیبروبلاستها هستند بصورت سلولهای میان بافتی لیدیگ درآیند. تستوسترونی که در پاسخ به LH از بیضهها ترشح میشوند اثری متقابل در مهار ترشح LH از هیپوفیز قدامی دارد. تستوسترون این کار را به دو طریق انجام میدهد. احتمالاً قسمت اعظم این مهار حاصل اثر مستقیم تستوسترون در کاهش ترشح GnRH از هیپوتالاموس است. این امر باعث کاهشی متناظر در ترشح LH و FSH از هیپوفیز قدامی میشود و کاهش LH نیز ترشح تستوسترون از بیضهها را کم میکند. لذا هرگاه ترشح تستوسترون بیش از حد بالا رود، این اثر خودکار فیدبک منفی که از طریق هیپوتالاموس و هیپوفیز قدامی عمل میکند، تستوسترون را به حد کارکردی مورد نظر میگرداند. متقابلاً ترشح کمتر از معمول تستوسترون امکان ترشح مقادیر زیاد GnRH از هیپوتالاموس را فراهم میکند که در پی آن ترشح LH و FSH از هیپوفیز قدامی و ترشح تستوسترون از بیضه هم افزایش مییابد (Guyton and Hall (2006.
15-1) آثار مختلف آندروژنها
آثار خارج بیضهای تستوسترون و آندروژنهای وابسته را میتوان به دو دسته اصلی تقسیم کرد: آثاری که بطور اختصاصی به عملکرد تولیدمثل و صفات ثانویه جنسی مربوط هستند و آثاری که عمومأ به تحریک بافتهای غیر تولیدمثل برای رشد و بلوغ بیشتر مربوط هستند.
مهمترین آندروژنی که تاکنون در گردش خون شناسایی شده تستوسترون است. این هورمون را میتوان به عنوان پیش هورمون دیهیدروتستوسترون (DHT) و ۵- آندروستن دیون در نظر گرفت. هورمون دی هیدروتستوسترون بطور ویژه در جنین برای تمایز تکمه جنسی، چینهای تناسلی و سینوس ادراری – تناسلی به ترتیب به آلت تناسلی، اسکروتوم، مجرای ادراری آلت و پروستات مورد نیاز است. این هورمون در دوران بلوغ هم برای رشد اسکروتوم و پروستات و ترشحات پروستاتی مورد نیاز است.
تستوسترون بطور اختصاصی تمایز مجاری ولفی را به اپیدیدیم، وازدفران و وزیکول سمینال تحریک میکند و در عین حال از تشکیل اندامهای تناسلی زنانه جلوگیری میکند. حین بلوغ جنسی، تستوسترون، به همراه و یا بدون DHT باعث رشد آلت تناسلی و وزیکول سمینال میشود، همچنین باعث رشد حنجره و ضخیم شدن طنابهای صوتی گشته و باعث بم شدن صوت میشود. حضور این هورمون برای تحریک و حفظ اسپرماتوزوا ضروری است.
از اعمال دیگر آن بطور مختصر میتوان به موارد زیر اشاره کرد:
۱- تحریک ساختار اریتروپوئیتین و بلوغ پیش سازهای اریتروئید که به حفظ میزان طبیعی گلبولهای قرمز خون کمک میکند.
۲- تحریک بازجذب سدیم در کلیهها
۳- مهار رشد غدد پستانی
۴- برانگیختن میل جنسی (لیبیدو)
۵- تحریک رفتارهای تهاجمی (بیگدلی م. 1383).
16-1) تجزیه و دفع تستسترون
تستسترونی که در بافتها تثبیت نمیشود، به سرعت و به طور عمده توسط کبد به آندروسترون و دهیدرواپی آندروسترون تبدیل شده و در همان زمان به صورت گلوکورونیدها و سولفاتها (به ویژه گلوکورونیدها) مزدوج میگردد. این مواد یا از راه صفرا به داخل روده و یا از راه کلیهها به داخل ادرار دفع میشود (Guyton and Hall 2006).

17-1) فعالیتهای بیولوژیکی در تولید مثل
در رت ماده، بلوغ همزمان با دوره رشد و رسیدگی اووسیتها در تخمدان صورت میگیرد و باز شدن سوراخ واژن 28 تا 49 روز پس از تولد رخ میدهد و اولین دوره فحلی یا استروس، 1تا 2 روز پس از باز شدن سوراخ واژن اتفاق میافتد. در رت ماده بلوغ جنسی همراه با پایین آمدن بیضه به داخل اسکروتوم و ایجاد سیکل اسپرماتوژنز شروع میشود که این زمان در جنس نر حدود دو ماه پس از تولد میباشد. دوره کامل اسپرماتوژنز حدود 48 روز طول میکشد (Guyton and Hall 2006).
18-1) سیکل استروس
سیکل استروس شامل ۴ مرحه است که عبارتند از: استروس، پرواستروس، متاستروس و دیاستروس. کل سیکل ۶-۴ روز طول میکشد. مرحله استروس با پذیرش جنس نر در موش ماده که منجر به جفتگیری میگردد، مشخص میشود. در رت ماده استروس ۱۵-۹ ساعت طول میکشد و با رفتارهایی چون افزایش تحرک و ارتعاش گوش در حضور رت دیگر مشخص میشود. زمان تخمک گذاری ۱۱-۸ ساعت از شروع استروس میباشد. در حالت استروس اپیتلیوم واژن تغییراتی را متحمل میشود. بدین ترتیب که اپیتلیوم فلسی و شاخی میشود و لکوسیتها ناپدید میشود ۲۴ ساعت قبل از اوولاسیون، سلولهای اپیتلیوم فراوان شده، اندازه و درجه پیکنوزه آنها افزایش مییابد. اسمیر (smear) واژن بطور مشخصی مرحله استروس را مشخص میسازد (Suchow et al.,2006).
19-1) اوولاسیون
در رت، تولید مثل در شب صورت میگیرد. دوره فحلی در ۷۵ % حیوانات بین ساعات ۱۰-۴ بعدازظهر شروع میشود و ۱۴ ساعت هم طول میکشد. جنس ماده بیشترین پذیرش را در سه ساعت اول و معمولأ در زمان اوولاسیون که ۱۱-۸ ساعت بعد از شروع دوره فحلی اتفاق میافتد؛ دارا میباشد (Suchow et al.,2006).

20-1) حاملگی
هنگامی که واژن در طی دوره استروس بوسیله عوامل مکانیکی یا در طی جفتگیری تحریک شود LH از هیپوفیز قدامی آزاد شده و جسم زرد را قادر میسازد تا پروژسترون تولید کند. این ترشح حدود ۱۳ روز ادامه مییابد و اگر لقاح صورت بگیرد، جفت تکامل یافته و پروژسترون تولید میکند. اگر لقاح صورت نگیرد دورهای ایجاد میشود که حاملگی کاذب نامیده میشود که در این دوره فولیکولها نمیرسند واستروس صورت نمیگیرد (Suchow et al., 2006).
21-1) دوره حاملگی
طول دوره حاملگی در گونههای مختلف متفاوت است این دوره برای موش آزمایشگاهی ۲۱-۱۹ روز و برای رت ۲۱-۲۳ روز است. اگرچنانچه بچههای زایمان قبلی به شیرخوردن از مادر ادامه بدهند، دوره حاملگی ممکن است طولانی بشود (Suchow et al., 2006).
22-1) سیکلوسپورین
تاریخ پزشکی ما غنی از انجام پیوند به عنوان یک درمان برای بیماریهای مختلف است. اگر چه عملکرد بالینی پیوند مربوط به چند دهه اخیر است. امروزه، انتقال ارگان و پیوندهای مغز استخوان با موفقیت انجام میشود ، اما زمانی که عضو پیوند زده شده توسط سیستم ایمنی بدن به عنوان یک عضو خارجی شناخته شود و مورد حمله قرارگیرد ، واکنش رد پیوند اتفاق میافتد. بسیاری ازدارو های سرکوبکننده سیستم ایمنی برای جلوگیری از واکنشهای رد پیوند مورد استفاده قرار میگیرند. اگر چه در دوران مدرن سرکوب سیستم ایمنی فاراماکولوژیکی با معرفی داروی ، 6 مرکاپتوپورین آغاز شد و در سه دهه اخیر پیشرفت عمده ای در سرکوب سیستم ایمنی توسط توسعه در عوامل فارماکولوژیکی اتفاق افتاده که یکی از این عوامل سیکلوسپورین A میباشد (et al., 1976 Borel ).
23-1) تاریخچه و ساختمان شیمیایی سیکلوسپورین- آ
در سال 1972 برای اولین بار بورل از مرکز تحقیقاتی ساتدوز سویس ثابت نمود که حاصل متابولیسم نوعی قارچ به نام Tolypocladium inflatum gams دارای اثرات ایمنوساپرسیو میباشد. چند سال بعد با استفاده از روشهای شیمیایی و کریستالوگرافی با اشعه ایکس ساختمان مولکولی و فضایی این ماده تعیین و با توجه به حلقوی بودن ساختمان، ملکول به نام سیکلوسپورین نامیده شد. سنتز آزمایشگاهی انواع سیکلوسپورین از قبیل A,C,D,EوG تاسال 1980 کامل شد و از میان آنها نوع A به عنوان داروی اختصاصی و مؤثر ایمنوساپرسور درجراحی پیوند اعضا مورد استفاده قرار گرفت. اکثریت افرادی که بعلت پیوند اعضا و دلایل دیگر از سیکلوسپورین آ استفاده میکنند جوان و در دوران باروری میباشند و از آنجایی که مجبور به مصرف طولانی مدت این دارو میباشند باعث ایجاد اثرات ثانویه میشود که از اثرات آن کاهش وزن بدن، کاهش وزن ارگانهای جنسی، و در نهایت کاهش باروری میباشد (Seethalakshmi et al.,1987). اثرات جانبی طولانی مدت سیکلوسپورین روی ناباروری یک نگرانی مهم اجتماعی برای مردان جوان و در سن باروری است. اکثر مطالعات حیوانی و همچنین مطالعات اپیدمیولوژیکی انسانی نشان دادهاندکه هنگامی که افراد مذکر در معرض عوامل گوناگون قرار میگیرند، مشکلاتی مانند اختلال در تولیدمثل و باروری و نتایج آن در جامعه میتوانند ایجاد شود (Olshan and Mattison., 1994). بنابراین لازم است اثرات ژنوتوکسیک و سایکوتوکسیک عوامل روی سلولهای زایا مطالعه شود زیرا این تنها سیستمی است که از طریق آن آسیب ژنتیکی از یک نسل به نسل دیگر میتواند اتفاق بیفتد (Au W.W. and Hsu TC., 1980). سیکلوسپورین A از یک مولکول پپید حلقوی خنثی دارای یازده اسید آمینه با وزن مولکولی 1201دالتون با خاصیت هیدروفوبی تشکیل شده است. به استثنای اسیدآمینه شماره یک به نام بتاهیدروکسی آمینواسید که برای اولین بار در ساختمان مولکولی این دارو کشف گردیده، سایراسیدهای آمینه موجود درمولکول جزء اسیدهای آمینه فیزیولوژیک هستند. یکی از خواص استثنایی این سیکلوپپتید حضور ریشه متیلCH3)) برروی اتم ازت اسیدهای آمینه شماره 1،3،4،6،9،10و11 بوده و سایر ازت های آزاد اسیدهای آمینه شماره 2،5،7و8 قادر به تشکیل پل هیدروژنی مطابق تصویر زیر میباشند.

24-1) مکانیسم عمل سیکلوسپورین آ در بدن
تأثیر اصلی و اختصاصی CsA به عنوان یکی از مهم ترین داروهای ایمنوساپرسیو، ممانعت وکاهش فعل و انفعالات سلولهای لنفوسیت T برای پاسخ ایمنی جدید در بدن میباشد. مطالعات فارماکودینامیکی CsA نشان میدهد که اثر ایمنوساپرسیو دارو در سطح مولکولی برروی لنفوسیتهای T متمرکز بوده و باعث مهار ژن رونویس لنفوسیت T شده که در نهایت منجر به عدم ایجاد کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی میشود. ژن رونویس مسؤلیت ایجاد و آزادسازی سیتوکینها برای تحریک سیستم دفاعی سایر سلولهای ایمنی بدن درمقابل جسم بیگانه را بر عهده دارد. همچنین مانع سنتز اینترلوکینها به خصوص اینترلوکین2 به عنوان محرک فعالیت سلولهای لنفوسیت کمکی وسلولهای لنفوسیت سیتوتوکسیک بوده واز طرف دیگر مانع سنتز گاما انترفرون شده که موجب قطع ارتباط بین سلولی لنفوسیتهای T و ماکروفاژها میگردد .در نتیجه از این طریق مانع فعال شدن واکنشهای دفاعی درهرگروه سلولهای ایمنی میشود. بعلاوه کاهش فعالیت لنفوسیت Tناشی از تأثیردارو باعث عدم ایجاد مراحل افتراقی وفعال شدن سلولهایB برای ایجاد وآزاد نمودن آنتی بادیمیباشد. بدیهی است CsA برروی سلولهای فعال شده لنفوسیت T موجود در بدن و همچنین ازدیاد آن بدون تأثیر میباشد (Granelli-Piperno, 1990).

25-1)کاربردهای بالینی و عوارض
CSA در حال حاضر، با موفقیت در طب پیوند و درمان بیماریهای خودایمنی مانند آرتریت روماتوئید، پسوریازیس، یووئیت استفاده میشود. CSA بر روی بافتهای کلیه و قلبی اثرتخریبی داشته و همچنین موجب مسمومیت اسپرم و بیضه در حیوانات آزمایشگاهی میشود (2007;Seethalakshmi et al., 1990(a); Seethalakshmi et al., 1990(b); Misro et al., 1999 ). اسپرم از سلولهای اولیه (germ cells) است که دارای نقش محوری در لقاح میباشد. ناباروری یک مشکل بسیار بزرگ است و کاهش اسپرم یکی از عواملی است که سبب ناباروری میشود. گونههای اکسیژن فعال (ROS) مانند پراکسید هیدروژن (H2O2)، آنیون سوپر اکسید (O2-U)، مولکول و یا رادیکال هیدروکسیل (UOH) برهر دو گامت نر و ماده تاثیر میگذارند (Agarwal et al., 2008(b)) ROS تولید شده توسط اسپرم نقش مهمی در فرآیندهای فیزیولوژیک مانند ظرفیتیابی اسپرم، واکنش آکروزومی، همجوشی با تخمک و ثبات کپسول میتوکندری در اواسط قطعه بازی میکند (Agarwal et al., 2008a).
با این حال، تولید غیر قابل کنترل ROS ، بیش از ظرفیت آنتی اکسیدانتی پلاسمای سمینال منجر به استرس اکسیداتیو میشود، که برای اسپرم مضر است. سمیت ناشی از سیکلوسپورین در ارگانهای بسیاری از جمله کلیه، کبد، قلب و تخمدان به استرس اکسیداتیو نسبت داده شده است. CSA باعث خسارتهای مستقیم در محور هیپوگونادیک و عملکرد فاگوسیتوز سلول سرتولی میشود (Ergüder et al., 2005).
26-1) استرس اکسیداتیو و پیامدهای آن در دستگاه تولید مثلی نر:
تولید گونههای فعال اکسیژن (ROS) در دستگاه تولید مثلی نر به دلیل اثرات توکسیک شدید آنها بر روی کیفیت و عملکرد اسپرم، به موضوعی حائز اهمیت در آندرولوژی تبدیل شده است (Saleh and Agarwal., 2002) . گونههای فعال اکسیژن ، عوامل اکسید کننده بسیار فعالی از گروه رادیکالهای آزاد میباشند که مثالهایی از آنها عبارتند از: یون هیدروکسیل، سوپراکسید، پراکسید هیدروژن، رادیکال پروکسیل و یون هیپوکلریت (Aitken et al., 1990). رادیکالهای آزاد به هر اتم یا مولکولی که دارای یک عدد یا بیشتر الکترون جفت نشده باشد اطلاق میگردد ((Warren et al., 1987. مطالعات صورت گرفته نشان دادهاند که 45-25% مردان نا بارور دارای سطوح بالایی از ROS در نمونههای مایع منی خود بودها ند (Agarwal et al., 2004). واژه استرس اکسیداتیو زمانی به کار میرود که میزان اکسیدانتها از آنتی اکسیدانتها پیشی بگیرد (Sies , 1993). در واقع این رویداد بیانگر نوعی عدم تعادل بین توالی ROS و مکانیسمهای مهاری آن است (Sikka , 2001). اسپرمها حساسیت ویژهای نسبت به آسیبهای ناشی از استرس اکسیداتیو دارند چرا که غشای پلاسمای آنها دارای مقادیر بالایی اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه (3PUFAs) بوده و در سیتوپلاسم آنها میزان اندکی آنزیم مهاری وجود دارد (Sharma and Agarwal, 1996). علاوه بر این، آنزیمهای آنتیاکسیدانت داخل سلولی قادر به محافظت از غشای پلاسمایی احاطهکننده آکروزوم و دم اسپرم نیستند، از این روی اسپرمها جهت تقویت سیستم دفاع آنتیاکسیدانتی داخلی محدود خود از مکانیسمهای دفاعی پلاسمایی منی بهره می جویند (Zini et al., 1993). مطالعات متعدد نشان داده اند که از میان انواع سلولهای مختلف موجود در مایع منی، اسپرمهای غیرطبیعی و نابالغ و لکوسیتها منابع اصلی تولید ROS را تشکیل میدهند (Aitken and West, 1990;). بررسیها نشان داده است که بین کیفیت پایین اسپرم و افزایش تولید ROS ارتباط مستقیمی وجود دارد. در واقع بقایای سیتوپلاسمی اسپرم، حلقه گمشده ارتباطی بین این دو فرایند میباشند (Gomez et al., 1998). در مواردی که اسپرماتوژنز دچار اختلال میشود، مکانیسمهای بیرون راندن سیتوپلاسم دچار نقص شده و اسپرم به همراه بقایای سیتوپلاسمی از اپیتلیوم زایا جدا میشود (شکل 1-2). اسپرمی که تحت این شرایط آزاد میشود، نابالغ بوده و دارای نقص عملکردی میباشد (Huszar et al., 1997). باقیماندن این قطرات سیتوپلاسمی4 در اسپرم وابستگی مستقیمی با تولید ROS از طریق مکانیسم هایی دارد که به نظر میرسد به واسطه آنزیم سیتوزولی گلوکز-6-فسفات دهیدروژناز5 صورت میگیرد (Aitken, 1999). از سوی دیگر، اسپرمها به سبب نیاز مداوم به انرژی جهت حرکت، دارای میتوکندریهای فراوانی میباشند. از این روی، اختلال در عملکرد میتوکندریها میتواند به افزایش تولید ROS منجر گردد که این امر به نوبه خود مجدداً میتوکندریها را تحت تأثیر قرار میدهد، چرا که ROS موجب آسیب غشای میتوکندریها شده و این غشاهای آسیب دیده موجبات افزایش میزان ROS را فراهم میآورند (Evenson et al., 1982). از سوی دیگر، کاهش کیفیت اسپرم و نیز نقص عملکردی آنها با افزایش میزان لکوسیتها در مایع منی6 در ارتباط است.
لکوسیتهای پراکسیداز مثبت که یکی از منابع اصلی تولید ROS در مایع منی محسوب میگردند، لکوسیتها دارای هسته چند شکلی میباشند که 60-50% لکوسیتهای مایع منی را تشکیل میدهند (Thomas et al., 1997). غده پروستات و کیسههای منی منابع اصلی این لکوسیتهای پراکسیداز مثبت میباشند (Wolf, 1995). لکوسیتها در پاسخ به محرکهای مختلفی نظیر عفونت و آماس، فعال شده و این لکوسیتهای فعال قادر خواهند بود 100 برابر لکوسیتهای غیر فعال ROS تولید نمایند (Plante et al., 1994). این مکانیسم به واسطه افزایش تولید NADPH از مسیر هگزوز منو فسفات صورت میپذیرد که فعال سازی سیستم میلو پراکسیداز لکوسیتهای دارای هسته چندشکلی و ماکروفاژ را در پیداشته، نهایتاً به انفجار تنفسی7 و تولید مقادیر بالای ROS میانجامد. بنابراین، افزایش غیرطبیعی میزان لکوسیتهای مایع منی و یا جداسازی اسپرم از پلاسمای منی جهت انجام کارهای آزمایشگاهی، میتواند به آسیب دیدن اسپرمها توسط ROS تولیدی لکوسیتها منجر گردد (Shekarriz et al., 1995). تمامی ترکیبات سلولی نظیر لیپیدها، پروتئینها، اسیدهای نوکلئیک و قندها، اهداف بالقوه استرس اکسیداتیو میباشند. میزان آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو به ماهیت و میزان ROS ، مدت زمان قرار گرفتن در معرض ROS و فاکتورهای خارج سلولی مانند دما و اجزاء محیط (یونها، پروتئینها و آنتیاکسیدانتها) بستگی دارد (Makker et al., 2009). ROS به اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه (PUFAs) که در غشاء سلولی حضور دارند حمله کرده، مجموعهای از واکنشهای شیمیایی را که پراکسیداسیون لیپیدی نامیده میشود، موجب میگردد (Aitken, 1995; Kodama et al., 1996). این فرآیند با واکنش رادیکالهای آزاد با زنجیرههای اسیدچرب و آزادسازی رادیکالهای آزاد لیپیدی آغاز میگردد. این رادیکالهای آزاد لیپیدی متعاقباً با اکسیژن مولکولی وارد واکنش شده و رادیکالهای پروکسیل لیپیدی را شکل میدهند. رادیکالهای پروکسیل نیز میتوانند با اسیدهای چرب واکنش داده ، رادیکالهای آزاد لیپیدی تولید کنند که این امر موجب تداوم چرخه واکنشها میگردد (Alvares and Storey, 1995). یکی از محصولات جانبی پراکسیداسیون لیپیدی، مالون دی آلدئید میباشد. این محصول جانبی در ارزیابیهای بیوشیمیایی متعددی جهت برآورد میزان آسیب پراکسیداتیو کاربرد دارد (Aitken et al., 1989).
27-1) آنتی اکسیدانت ها و نقش حفاظتی آنها در برابر استرس اکسیداتیو
همانطور که پیشتر نیز گفته شد، به سبب کمبود آنزیمهای سیتوپلاسمی، اسپرمها قادر به ترمیم آسیبهای ناشی از استرس اکسیداتیو نمیباشند. مطالعات نشان دادهاند که آنتیاکسیدانتها دارای اثرات گستردهای در آندرولوژی میباشند و قادرند از اسپرمها در برابر ناهنجاریهای ناشی از ROS محافظت نمایند. این ترکیبات همچنین موجب مهار ROS تولید شده توسط لکوسیتها و بهبود کیفیت مایع منی شده و از قطعه قطعه شدن DNA و بلوغ نا بهنگام اسپرمها جلوگیری میکنند. سه سیستم آنتیاکسیدانتی متفاوت و وابسته به هم که نقش کلیدی در کاهش استرس اکسیداتیو در جنس نر ایفا میکنند عبارتند از: آنتیاکسیدانتهای رژیم غذایی، آنتیاکسیدانت های اندروژن و پروتئینهای شلاته کننده یونهای فلزی (Hughes et al., 1998). آنتیاکسیدانتهای موجود در پلاسمای منی و اسپرم در گروه آنتیاکسیدانتهای اندروژن قرار میگیرند. پلاسمای منی دارای سه آنتیاکسیدانت آنزیمی اصلی سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز و گلوتاتیون پراکسیداز/گلوتاتیون ردوکتاز (GPX/GRD) در کنار طیف وسیعی از آنتی اکسیدانتهای غیرآنزیمی مانند آسکوربات، اورات، ویتامینE، ویتامین A، پیروات، گلوتاتیون، آلبومین، یوبی کوئیتول8، تائورین9 و هایپوتائورین میباشد. اسپرمها علاوه بر SOD که عمدهترین آنتیاکسیدانت موجود در آنها را تشکیل میدهد، دارای آنتی اکسیدانتهای آنزیمی اولیه نیز میباشند. آنتیاکسیدانتهای رژیم غذایی غالباً به شکل ویتامین C، ویتامین E، بتاکاروتنها، کاروتنوئیدها و فلاونوئیدها میباشند. پروتئینهای شلاته کننده یونهای فلزی نظیر آلبومین، سرولوپلاسمین، متالوتیونئین10، ترانسفرین، فریتین و میوگلوبولین ، به واسطه غیرفعال کردن انتقال یونهای فلزی که تولید رادیکالهای آزاد را کاتالیز میکنند، عمل میکنند (Tarin et al., 1998) این ترکیبات همچنین پراکسیداسیون لیپیدی غشاء پلاسمایی اسپرم را کنترل میکنند و موجب حفظ یکپارچگی آن میگردند (Wroblewski et al., 2003).بررسیهای آزمایشگاهی صورت گرفته نیز نقش آنتیاکسیدانتها را در کاهش تولید ROS توسط اسپرم و بهبود توانایی تکاملی جنین مورد تأیید قرار داده است (Tatemoto et al., 2001; Esfandiari et al., 2005). در همین راستا ، گزارشات دیگری نیز بر نقش آنتیاکسیدانتها در کاهش آسیب DNA و آپوپتوز در اسپرمها و نیز افزایش میزان بارداری و لانه گزینی بالینی صحهگذاردهاند (Hughes et al., 1998). در تحقیق حاضر هم مشاهده گردید که درصد اسپرمهای نابالغ و اسپرم با DNA آسیب دیده در گروههای تیمار شده توسط سیکلوسپورین + عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک در مقایسه با گروه کنترل به طور معنی داری کاهش یافت و همچنین درصد اووسیتهای لقاح یافته، درصد جنینهای دوسلولی، درصد بلاستوسیستها و میزان باروری ، در گروه سیکلوسپورین در مقایسه با گروه کنترل کاهش یافته است. و استفاد از عصاره زالزالک و روغن هسته انگور سبب بهبود پارامترهای ذکرشده میشوند.از این روی با توجه به کاربرد روز افزون تکنیکهای آزمایشگاهی نظیر11IVF، ارزیابی سطوح ROS و وضعیت استرس اکسیداتیو در نمونههای اسپرم پیش از IVF و نیز استفاده از آنتیاکسیدانتهای مؤثر و کارا میتوانند ما را به نتایج بهینه رهنمون سازد (شکل2-2)، همچنان که تحقیقات صورت گرفته نشان داده است که این ترکیبات قادرند اثرات سمی پراکسیدهیدروژن بر روی جنین را به نحو مطلوبی کاهش دهند (Zhang et al., 2005).

28-1) آنزیم سوپراکسید دیسموتاز(SOD)
از آن جایی که سوپر اکسیدها آغازکنندههای قوی واکنشهای زنجیرهای هستند، این آنزیم به عنوان دفاع اولیه در برابر استرس اکسیداتیو معروف میباشد. آنزیم سوپراکسید دیسموتاز، آنیونهای سوپراکسید را به پراکسید هیدروژن و اکسیژن کاتالاز میکند. SOD شامل سه فرم ایزوآنزیمی میباشد که عبارتند از Cu/Zn_SOD که در داخل سیتوزول قرار دارد. Mn_SOD که در میتوکندری وجود دارد و Fe_SOD که تنها فرم موجود در پروکاریوتهاست. یک شکل ترشحی ازCu/Zn_SOD هم در ماتریکس خارج سلولی بافتها شناسایی شدهاست. این فرم از SOD در بیضه رت بیان میشود و به وسیله سلولهای سرتولی، سلولهای جنسی و نیز اپیدیدیم آزاد میشود. فعالیت آنزیم SOD بوسیله مواد شیمیایی یا شرایطی مانند افزایش اکسیژن که تولید سوپراکسید را زیاد میکند، افزایش مییابد(Mruk and Chen., 2000 ).
29-1)آنزیم کاتالاز
کاتالاز به طور عمده در پراکسیزوم و در مقادیر کمتر در سیتوزول و شکستگیهای میکرومازول سلولی گسترش مییابد (Smith et al., 2006). این آنزیم قادر است پراکسیدهیدروژن را کاهش دهد. پراکسید هیدروژن که به صورت یکپارچه تولید میشود برای جلوگیری از تشکیل رادیکال هیدروکسیل و ایجاد واکنشهای زنجیرهای با آب احیا میشود.
30-1) آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز
گلوتاتیون یکی از اصلیترین عوامل حفاظتی بدن در آسیب اکسیداتیو میباشد. در واکنشی که توسط گلوتاتیون پراکسیداز کاتالیز میگردد، گروه فعال سولفیدریل پراکسید هیدروژن را به آب کاهش میدهند و لیپید پراکسیداز آن را به الکل غیرسمی تبدیل میکند. این آنزیم در داخل سلول، بیشتر در سیتوزول و میتوکندری یافت شده و مهم ترین عامل در خارج کردن پراکسیدهیدروژن تولیدی در خارج از پراکسیزوم میباشد(Smith et al., 2006).
31-1) آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز
این آنزیم در چرخه ردوکس، گلوتاتیون اکسید شده (GSSG12) را به شکل سولفیدریل احیا میکند. این آنزیم حاوی FAD13 بوده و انتقال الکترون ها را از NADPH14به باند دیسولفید GSSGکاتالیز میکند، NADPH برای حفاظت علیه آسیبهای ناشی از رادیکالهای آزاد ضروری است (Smith et al., 1992).
32-1) مکانیسمهای پاسخ سلولی به استرس
سلولها مکانیسمهای مختلفی را جهت کاهش تغییرات زیان آور و مخرب وارده بر ماکرومولکولهای آنها فعال میکنند. مکانیسم های عمدهای در پاسخ به استرس درگیرند، که عبارتند از:

1-32-1)ترمیم و بازسازی DNA:
آسیب DNA می تواند تحت تأثیر تشعشعات و مواد شیمیایی محیطی، واسطهها و مواد درونزای سلولی و یا نتیجه تجویز ترکیبات ژنوتوکسیک و مشتقات آنها ایجاد شده باشد. نقص در فرآیند ترمیم و باز سازی آسیب DNA سبب ایجاد ناپایداری ژنتیکی، توقف در سیکل سلولی و مرگ سلولی و نهایتاً بروز موتاسیون، سرطان زایی و پیری میشود (Bohr, 2002).
انواع آسیبدیدگیهای DNA عبارتند از :
شکستگی در یک یا دو رشته DNA
اتصالات عرضی میانرشته ای یا درونرشتهای DNA
تغییر شکل بازها و یا نامتناسب بودن بازها
واکنش سلولها جهت ترمیم DNA عبارتند از:
برداشت نوکلئوتید(NER15)
برداشت باز(BER16)
ترمیم ناهمگونی و ناجوری بازها(MMR17)
ترمیم به وسیلهی جفتهای همسان و مشابه(HRR18)
33-1) مسیرهای ترمیم DNA
مکانیسم عمده ترمیم DNA برداشت نوکلئوتید (NER) میباشد. این واکنش بخش عمدهای از تغییرات بزرگ و حجیمی را که مارپیچ DNA را بد شکل و نا مطلوب کردهاست، ترمیم می کند. این تغییرات عبارتند از: اتصالات عرضی درون رشتهای DNA و پروتئین- DNAو آسیبهایی که جفت شدن بازها را تحت تأثیر قرار میدهند و نسخه برداری و رونویسی DNA را مختل میکنند (Coin et al., 1999). مسیر برداشت و قطع باز (BER)، بازهای نادرست و آسیبدیده از جمله آنهایی که در اثر اکسیداسیون DNA بوجود میآیند را حذف میکنند. دو نوع مسیر BER وجود دارد: مسیری که آسیبهای مربوط به یک نوکلئوتید را ترمیم میکند و Short-Patch Pathway نام دارد و مسیر دیگر که آسیبهای مربوط به 2تا 6 نوکلئوتید را ترمیم میکند و Long-Patch Pathway نام دارد. مسیر ترمیمی که برای ترمیم قطعات بازی ناهمگون و ناجور به کار میرود (MMR) نقش بسیار مهمی در تصحیح ناهمگونیهای ساده و تکی و نیزجهشهای کوچکی که به هنگام الحاق یا حذف بازها رخ میدهد ایفا میکند که اغلب در طول عمل رونویسی اتفاق میافتد و مسیر آخر عبارتست از ترمیم از طریق جفتگیری بازهای همسان و مشابه (HRR) که در ترمیم شکستگی های ایجاد شده در هر دو رشته DNAبکار میرود. برای وقوع چنین حالتی یک کروماتید خواهری و یا یک کروموزوم همسان لازم است که هم NER و هم HRR با هم کاری هم در طول نسخه برداری عمل ترمیم و باز سازی شکستگیهای موجود در هر دو رشته DNA را که از طریق اتصالات عرضی DNA بوجود آمده، انجام میدهند (Modrich and Lahue., 1996).
34-1) مکانیسمهای دفاع آنتیاکسیدانتی
مکانیسمهای دفاع آنتیاکسیدنتی شامل سه مرحله محافظتی است (Sies, 1993).
1-جلوگیری 2-جداسازی 3-ترمیم
جلوگیری: جلوگیری از تولید ROS اولین خط دفاعی در برابر آسیب استرس اکسیداتیو است. شلاته کردن فلزّات انتقالی، یک روش بسیار مهم در جلوگیری از پراکسیداسیون چربی در اسپرم و آسیب DNA است. یک مثال در این مورد میتواند یونهای انتقالی متصل شونده، آهن و مخصوصاً مس باشد که از آغاز یک واکنش زنجیری توسط آنها جلوگیری میشود.
جداسازی: رادیکالهای آزاد تمایل زیادی به ایجاد واکنشهای زنجیرهای دارند. بنابراین مسألهی اساسی شکستن این وکنش زنجیری توسط تشکیل ساختار غیر رادیکال در پایان تولید محصولات واکنش است.
ترمیم: در بعضی از شرایط، آسیبهای ایجاد شده توسط اکسیدانتها میتواند ترمیم شود.
35-1) زالزالک19
زالزالک، گیاهی است برگریز از خانواده رزاسه که بومی نواحی مدیترانه، شمال آفریقا، اروپا و آسیای مرکزی میباشد. این گیاه بالغ بر ۲۰۰ گونه گیاهی دارد که اغلب گونههای آن خارهایی برجسته، طویل، مستقیم و تیز با طولی بین یک تا پنج اینچ دارند (Rigelsky and Sweet, 2002). Crataegus monogyana و Crataegus laevigata دو گونه رایج این گیاه میباشند. نخستین بار ۶۵۹ سال پس از میلاد مسیح، در تانگ-بن- کائو که اولین چاپی رسمی جهان است، به زالزالک اشاره شده است (Hou, 1977).
1-35-1)خصوصیات فیتوشیمیایی
اغلب فعالیتهای دارویی زالزالک به فلاونوئیدها و پروآنتوسیانیدینهای اولیگومریک20 موجود در آن نسبت داده میشود (Yao et al., 2008). مطالعات نشان دادهاند که فلاونوئیدها دارای خواص بیولوژیکی متعددی از جمله ویژگیهای آنتیاکسیدانتی میباشند (Elliott Milddleton and Kandaswami, 2000). کوئرستین21، ایزوکوئرستین22، ویتکسین23، هایپروزید24، اپیکاتچین25 و اسید کلوروژنیک فلاونوئیدهای فعال اصلی موجود در عصارههای گیاه زالزالک را تشکیل میدهند (Yao et al., 2008).
2-35-1)ویژگیهای داروشناختی
1-2-35-1) اثرات حفاظتی بر روی سیستم قلبی و عروقی
این ویژگی دارویی گیاه زالزالک به پروآنتوسیانینهای اولیگومریک(OPCs) آن نسبت داده میشود (Miller, 1998). بررسیها نشان داده است که عصارههای این گیاه موجب افزایش توان انقباضی میوکارد (Schwinger et al., 2000)، افزایش جریان خون کرونری(Schussler et al., 1995)، به کارگیری بهتر اکسیژن توسط کاردیومیوسیتها (Muller et al., 1996)، کاهش بروز آریتمیهای قلبی که به واسطه از سرگیری جریان خون ایجاد میگردند (Garjani et al., 2000)، کاهش فشار خون و درمان نارسایی احتقانی قلب (Hosseinimehr et al., 2008) میگردند. مطالعات دیگری نیز در همین راستا از نقش حفاظتی عصارههای این گیاه در برابر آسیبهای میوکاردی که به واسطه ایسکمی عروق کرونر و از سرگیری جریان خون به وجود میآیند، در مدلهای حیوانی حکایت دارند (Veveris et al., 2004).
2-2-35-1) خاصیت کاهندگی چربی خون :
مطالعات پیشین نشان دادهاند که گونههای متعددی از زالزالک دارای خواص کاهندگی چربی خون در حیوانات آزمایشگاهی میباشند (Khalil et al., 2008). تحقیقات دیگری نیز بر اثرات سودمند زالزالک در کاهش کلسترول تام سرمی، لیپوپروتئین با چگالی کم26 و تری آسیل گلیسرول27 در افراد دارای چربی خون صحه گذاردهاند (Kwon et al., 2005). همچنین گزارش شده است که عصاره آبی زالزالک موجب کاهش محسوس کلسترول آئورتی، استرکلسترول و کلسترول کبدی در خرگوشهای تغذیهشده با جیره غذایی حاوی کلسترول بالا میگردد (Khalil et al., 2008).
3-2-35-1) اثرات آنتی اکسیدانتی
تحقیقات صورت گرفته نشان دادهاند که عصارههای حاصل از قسمتهای مختلف گیاه زالزالک دارای اثرات آنتیاکسیدانتی بوده و قادر به مهار آنیون سوپراکسید، رادیکال هیدروکسیل، پراکسیدهای هیدروژن و نیز پراکسیداسیون لیپیدی میباشند (Bahorun et al., 1996). به نظر میرسد فعالیتهای آنتی اکسیدانتی و مهار رادیکالهای آزاد نتیجه عملکرد ترکیبات فنلی و فلاونوئیدهای موجود در این گیاه باشد (Zhang et al., 2001). همچنین نقش محافظتی پروآنتوسیانیدینها در مهار استرس اکسیداتیو ناشی از دیابت مورد تأیید قرار گرفتهاست (Lee et al., 2007). علاوه بر این، بررسیهای به عمل آمده، میوه زالزالک را به عنوان یک منبع غنی از آنتی اکسیدانتها برشمردهاند (Ljubuncic et al., 2005).
علاوه بر ویژگیهای دارویی فوق، گزارشاتی نیز پیرامون اثرات ضدویروسی گیاه زالزالک (Shahat et al., 2002) و اثر محافظتی میوه آن بر روی کولیت تجربی (Fujisawa et al., 2005) به چشم میخورد.
36-1) عصاره هسته انگور
عصاره هسته انگور دارای طیف وسیعی از اثرات دارویی و درمانی از قبیل فعالیتهای آنتیاکسیدانتی، ضدالتهابی، ضدمیکروبی و همچنین داشتن اثرات محافظتی برعصب و قلب میباشد. در طب گیاهی دانههای انگور به عنوان یک مکملهای غذایی استفاده میشود (et al., 2003 Shi). عصاره هسته انگورعمدتا شامل فلاونوئیدها ست، که در بهبود استرس اکسیداتیو در شرایط آزمایشگاهی و در vivo in موثر میباشد (et al.,2002 Martinez-Florez). مطالعات مختلف نشان دادهاند که عصاره به دست آمده از دانه انگور سبب مهار سیستم آنزیمی که مسئول تولید رادیکالهای آزاد، مواد جهشزا و سرطانزاها میباشد، میشود (Li et al., 2001). عصاره هسته انگور غنی از ترکیبات آنتیاکسیدان بسیار قوي از جمله پروآنتیسیانیدین و پلیفنولها میباشد . اثر پروآنتیسیانیدین در بدن 20 برابر ویتامین Cو50 برابر ویتامین E است (Nassiri et al., 2009). این ترکیبات آنتیاکسیدان با خنثی نمودن رادیکالهاي آزاد، جلو ي تخریب سلو لی ناشی از اثر رادیکالهاي آزاد را میگیرند(Shi et al., 2003) .
از تركيبات عملكردي هسته انگور ميتوان به چندين فلاونوئيد با يك ساختار فنولي اشاره كرد. که شامل فلاونولهاي مونومري، فلاونولهاي ديمري، فلاونولهاي تريمري، پروسيانيدينهاي پليمري ، موادي مانند کاتچین، اپیکاتچین ميباشد (Bagchi et al., 1997). در مجموع 75 درصد از پلیفنولهای انگور در پوست و دانه انگور موجود میباشند. اما غلظت و ترکیب آنها به کشت جغرافیایی بستگی دارد. بنابراین، برای به دست آوردن عصاره با غلظت بالای پلیفنول از پوست و دانههای انگور استفاده میکنیم و میتوان آنها را به عنوان یک مکمل به غذا اضافه کرد. با این حال، برخی گزارشها نشان دادهاند که در غلظت بالا اثر فنول و ترکیبات آن در سلامت، منفی میباشد. زیرا با افزایش میزان محصولات آنتیاکسیدان ، سرطانزایی آنها نیز افزایش مییابد (Fan and Lou, 2004). استرس اکسیداتیو بیضه ، یکی از ویژگیهای مشترک در بسیاری از موارد ناباروری مردان میباشد، و نشان دادهاند که در موارد مربوط به hypospermatogenesis روشهای درمانی آنتی اکسیدانی بهترین مورد میباشد (Yousef and Salama, 2009). در تحقیق حاضر نیز مشاهده گردید پارامترهای مختلف اسپرمی در رتهایی که با عصاره هسته انگور تیمار شدهاند بهبود یافته، درصد اسپرمهای زنده افزایش یافته، درصد اسپرم با DNA آسیب دیده و درصد اسپرمهای نابالغ تا حدی کاهش یافتهاست. همچنین متعاقب بهبود این پارامترهای اسپرمی، پارامتر های مختلف لقاح مانند، درصد اووسیتهای لقاحیافته، درصد تشکیل بلاستوسیستها، درصد جنینهای دو سلولی افزایش مییابد. بسیاری از اثرات بهداشتی مفید GSE به مهار خواص آنتی اکسیدانتی و رادیکالهای آزاد نسبت داده شدهاست (Faria et al., 2006). اثر بهبود بخش GSE، ممکن است مربوط به منابع غنی از ترکیبات فنلی مونومر مانند کاتچین، اپیکاتچین، پروآنتوسیانیدینهای دیمر، تریمر و تترامر باشد) Escribano-Bailon et al.,1992). این مولکولها دارای یک ساختار متکی به خاصیت آنتیاکسیدانی هستند ، که برای اعمال طیف جدیدی از اثرات زیست شناختی، دارویی، درمانی و شیمی محافظ در مقابل رادیکالهای آزاد اکسیژن و استرس اکسیداتیو (Bagchi et al.,1997) نشان داده شدهاست. GSE باعث می شود روند استروئیدوژنز و از این رو تولید تستوسترون و تولید اسپرم بهبود یافته و از این رو باروری افزایش پیدا کند et al., 2007) Yousef). فلاونوئیدها ترکیباتی هستند که برای کاهش استرس اکسیداتیو وافزایش وضعیت آنتیاکسیدانی درونی و محافظت از سلولها در برابر آسیب توسط رادیکالهای آزاد و افزایش مقاومت در برابر استرس اکسیداتیو (Perez et al., 2002) نشان داده شده است. علاوه بر این، گونههای اکسیژن واکنشپذیر و آسیب اکسیداتیو دو ملکولی با کاهش عملکرد اسپرم باعث ناباروری جنس نرمیشوند ( Atessahin et al., 2005). درمان با GSE باعث اثر محافظتی در برابر سمیت تناسلی میشود و این ممکن است به فعالیت GSE به عنوان یک آنتیاکسیدان طبیعی نسبت داده شده است. در مطالعات اخیر دریافتهاند که عصاره هسته انگور باعث مهار رشد و مرگ آپوپتوتیک سلولهای 28DU145 سرطان پروستات انسان در محیط کشت آزمایشگاهی و انتقال عضو میشود. سرطان پروستات به بدخیمی آندروژن وابسته است. مطالعات تکمیل شده درمورد سرطان پروستات، نشان دادهاست که GSE باعث مهار رشد مستقل آندروژن پیشرفته انسان و مهار آپوپتوز سلولها DU145 میشود.
37-1) تولیدمثل در موشهای صحرایی
موشهای صحرایی به شکل گستردهای در زمینههای مختلف تحقیقات تولیدمثلی مانند باروری، جنبههای رفتاری تولیدمثل و بررسی اثرات ناقص الخلقه زایی29 ترکیبات مختلف مورد استفاده قرار میگیرند. آشنایی و شناخت ویژگیها و رفتار طبیعی تولیدمثلی موشهای صحرایی برای این بخش از پژوهشهای علمی، ضروری به نظر میرسد.
1-37-1) بلوغ :
زمان آغاز بلوغ بین گونههای مختلف موشهای صحرایی متغیر بوده و تحت تأثیر فاکتورهای متعدد دیگری نیز قرار میگیرد. به عنوان مثال، آنهایی که سطح تغذیهای بالاتری دارند، زودتر بالغ میگردند (Bennet and Vickerg, 1970). به نظر میرسد بلوغ در نتیجه افزایش توأم میزان لپتین30 و تستوسترون حاصل میشود (Nazian and Cameron, 1999). در موش صحرایی نر، بلوغ با پایین آمدن بیضهها به داخل اسکروتوم و آغاز اسپرماتوژنز همراه است. تولید اسپرم در بیضهها حدود ۴۵ روزگی شروع میگردد اما تولید بهینه31 آن تا حدود ۷۵ روزگی رخ نمیدهد (Russell, 1992). بلوغ در جنس ماده همزمان با بازشدن منفذ واژنی در ۴۲-۳۳ روزپس از تولد و نخستین پرواستروس روی میدهد. سیکل استروس حدود یک هفته پس از باز شدن منفذ واژنی آغاز میشود (Maeda et al., 2000).
2-37-1) رفتار تولیدمثلی :
سه رویداد تولیدمثلی معمول در موشها، در موشهای صحرایی وجود نداشته یا بسیار ضعیف بروز میکند. موشهای صحرایی، اثر بروس32 که با به تأخیر افتادن لانهگزینی جنینها در صورت حضور فرومونهای تولید شده توسط موش نر جدید همراه است را نشان نمیدهد. همچنین، اثر ویتن33 که به همزمان سازی سیکل استروس با ورود موش نر جدید در موش ماده اشاره دارد، در موشهای صحرایی وجود ندارد. اثر لی بوت34 که به واسطه آن موشهای مادهای که در کنار هم نگهداری میشوند، آنستروس میگردند، ممکن است در موشهای صحرایی وجود داشته باشد، اگرچه به اندازه موشهای سوری بارز نیست (Sharp and LaRegina, 1998). لوردوزیس35، رفتار جفتگیری شاخص موشهای صحرایی ماده میباشد. اگرچه هر دو هورمون استروژن و پروژسترون در ایجاد این رفتار نقش دارند، استروژن به تنهایی نیز قادر به القاء این حالت خواهد بود. تستوسترون جهت بروز رفتار جفتگیری در موشهای صحرایی نر ضروری است، چنانکه موشهای نر اخته شده، هیچ نوع رفتار جنسی از خود نشان نمیدهند. تحریکات شنوایی نقش مهمی در رفتار تولیدمثلی هر دو جنس بازی میکنند. صدایی 50 کیلوهرتزی توسط هر دو جنس نر درجریان جفت گیری ایجاد میشود(Meada et al., 2000). جفتگیری در موشهای صحرایی اغلب در آخرین بخشهای چرخه تاریکی روی میدهد (Mercier et al., 1987). جفتگیری به طور متناوب بالغ بر ۳ ساعت تداوم مییابد تا اینکه ۱۰-۳ انزال روی دهد. جفتگیری میتواند به وسیله حضور اسپرم در گسترش واژنی، مشاهده پلاک واژنی یا روئت مستقیم رفتار جفتگیری تایید گردد.90 نا 94% حیواناتی که گسترش واژنی آنها مثبت است، آبستن گزارش شدهاند (Baker, 1979).
3-37-1) دستگاه تولیدمثلی موشهای صحرایی نر
تعداد زیادی سلول زایگر اولیه در بدو تولد موشهای صحرایی نر وجود دارد که تقریبأ ۷۵% آنها در طول هفته اول زندگی دژنره میشوند. هر بیضه تقریبأ دارای ۳۰-۲۰ لوله منیساز به شدت به هم پیچیده است که به صورت واضح توسط بافت فیبروزی تفکیک نمیگردند (Russell, 1992). مدت زمان لازم برای تبدیل اسپرماتوگونی به اسپرماتوزوئید نسبتأ ثابت بوده و ۵۲-۴۸ روز به طول میانجامد (de Kretser, 1982). چرخههای اسپرماتوژنیک در موشهای صحرایی بسیار جوان آغاز میشود اما تا زمان بلوغ، ناکامل و نامنظم میباشد. تقریبأ ۸ روز طول میکشد تا اسپرماتوزوئیدها از سر اپیدیدیم عبور کرده و در دم آن تجمع یابند (Russell, 1992). ظاهراً ظرفیت تولیدمثلی موشهای صحرایی نر در مقایسه با جنس ماده طولانیتر است. آتروفی لولههای منیساز در ۲۰% موشهای صحرایی نژاد Sprague-Dawley در ۲۴ ماهگی و ۱۰% موشهای صحرایی نژاد F344 در ۱۸ ماهگی گزارش شدهاست (Takashi, 1992). مطالعات صورت گرفته بر روی موشهای صحرایی Long-Evas نشان داد که میزان هورمون LH و تستوسترون به طور پیوسته با افزایش سن کاهش مییابد ( Smith et al., 1992). باروری در موشهای صحرایی حدود ۶۲ روزگی حاصل میگردد (Clegg, 1960) و توانایی تولید استروژن توسط سلولهای لیدیگ با افزایش سن کاهش نمییابد (Kaler and Neaves, 1981). آتروفی لولههای منیساز در موشهای صحرایی میتواند موضعی یا منتشر باشد که با طیفی از دیگر تغییرات بافتشناسی شامل واکوئل دار شدن لایههای سلولهای زایا، حضور سلولهای غولپیکر چند هستهای، چروکیدگی لولهها، افزایش ضخامت غشاهای پایه و کاهش محسوس وزن بیضه همراه است.
اپیدیدیمها به واسطه مزانتری نازک به بیضهها متصل بوده و از سه قسمت سر، تنه و دم تشکیل میگردند . آتروفی بیضهها معمولأ به صورت کاهش چشمگیراسپرمهای بالغ در اپیدیدیمها بازتاب مییابد. کیسههای منی به شکل جفت بوده و از محل اتصال پیشابراه به صورت قدامی امتداد مییابند. آتروفی این اندامهای جنسی به طور عمده در ارتباط با کاهش آندروژنها بوده که به صورت چروکیدگی و کاهش اندازه کیسهها تظاهر مییابد که از نقطه نظر بافتشناسی با حضور اجزای ترشحی کوچک در حفره داخلی، تخریب اپیتلیوم و افزایش استرومای فیبری-عضلانی همراه است. غده پروستات دارای چهار لوب است: پروستات قدامی یا غده انعقادی36، لوبهای پشتی و جانبی که جداسازی آنها معمولأ دشوار است و لوب شکمی که غالبأ جهت بررسیهای بافتشناسی مورد استفاده قرار میگیرد. التهاب پروستات ممکن است ناشی از عفونت باکتریای باشد اما تنها به این علت محدود نشده و نشان داده شده است که استرس ناشی از کاهش درجه حرارت، فضای محدود و دسترسی محدود به آب و غذا میتواند به التهاب غیرباکتریایی پروستات منجر گردد.حیواناتی که اخته شده یا دچار آتروفی بیضه گشته اند، آتروفی منتشر پروستات را به خصوص در لوب شکمی نشان میدهند که ناشی از کاهش آندروژنها میباشد. این عارضه با کاهش ترشح، کاهش اندازه غده و افزایش استرومای فیبری-عضلانی همراه است. اجسام آمیلاسه37، در آسینیهای پروستات موشهای صحرایی پیر یافت شده و در لوبهای پشتی و جانبی میتواند موجب انسداد مجاری دفعی، التهاب و متاپلازی گردد. غده انعقادی در واقع لوب قدامی پروستات بوده و به دلیل مجاورت با غده وزیکول سمینال معمولأ در مقاطع بافتشناسی این اندام دیده میشود. آتروفی منتشر این غده گاهی در حیواناتی با آتروفی بیضه دیده میشود ولی هیچ نوع هایپرپلازی و نئوپلازی در این غده گزارشنشده است (Tucker, 2003).
38-1) تولید جنین در شرایط In vitro
اولین نوزاد متولد شده با استفاده از روش درمانی IVF در سال 1978 به وسیله Edwards و Steptoe گزارش شد. این روش درمانی امید تازهای برای زوجهای نابارور به وجود آورد. در آستانه قرن 21 انقلابی در زمینه استفاده از روش های بیوتکنولوژیک در مورد حیوانات اهلی صورت گرفت. این تحولات با تولید موشهای ترانس ژنیک توسط Brinster و همکاران آغاز گردید و پس از آن به سرعت با تولید گاو، گوسفند و خوک های ترانس ژنیک (Wall et al.,1992) تعیین جنسیت عملی گاوSeidel et al., 2002) ) و تولید اعجاب انگیز گوسفند دالی که توسط Campbell و همکاران از سلول های سوماتیک شبیه سازی شده بود، ادامه یافت (Campbell et al.,19996). فناوری تولید جنین در شرایط آزمایشگاه به ما اجازهی تولید مقادیر انبوه جنین در مراحل تکاملی گوناگون را میدهد و از این رو بسیار مورد استقبال دانشمندان علوم زیستی تولیدمثلی وبیوتکنولوژی قرار گرفته است.
39-1) ظرفیت پذیری اسپرم
مادامی که اسپرمها مسیر داخل لوله تناسلی ماده را طی نکردهاند ظرفیت کامل برای لقاح را ندارند. اسپرم باید تغییرات فیزیولوژیکی تکمیلی ( ظرفیت پذیری اسپرم) را الزاماً متحمل شود تا بتواند از لایهی شفاف عبور کرده و با تخمک ادغام شود. در واقع علت این امرکه بسیاری از آزمایشهای ابتدایی مربوط به لقاح آزمایشگاهی ناموفق بودند، عدم ظرفیت پذیری مناسب اسپرم بوده است. در طی ظرفیتپذیری، غشای پلاسمایی اسپرم متحمل واکنشهای بیوشیمیایی شده و ناپایدار میگردد. در نتیجه این واکنشها میزان نفوذپذیری غشا به مواد مختلف به ویژه کلسیم تغییر میکند. این تغییرات ظاهرا به عنوان عامل اصلی برای واکنش آکروزومی عمل مینمایند. واکنشهای آکروزومی موجب متراکم شدن، شکسته شدن و نهایتا متخلخل شدن غشاهای پلاسمایی و خارجی آکروزوم میشوند. آکروزوم حاوی آنزیمهایی است که پس از متخلخل شدن از آن خارج گشته و بافتهایی را که در اطراف تخمک در مسیر حرکت اسپرم قرار دارند هضم نموده و از بین میبرند و در نتیجه اسپرم قادر خواهد بود وارد تخمک شود و آن را بارور نماید. مطالعات نشان میدهد که شستشوی اسپرم قبل از انکوبه نمودن و قرار گرفتن در محیطهای سرشار از یون و محیطهای کلسیم دار میتواند واکنش آکروزومی را در محیط آزمایشگاهی هدایت کرده و عمل لقاح را سرعت ببخشد (2002 (Wani,.
40-1) لقاح آزمایشگاهی(IVF)
اسپرم دارای میزان زیادی پروتئین در سطح غشایی خود برای اتصال به پرده شفاف تخمک میباشد. فرآیند لقاح آزمایشگاهی از زمانی شروع میشود که اسپرم به گیرندههای پرده شفاف اووسیت ثانویه متصل میشود. این رسیتورها به طور اختصاصی عمل مینمایند به طوری که اسپرم موش قادر به بارور ساختن تخمک موش میباشد. در فرآیند لقاح اووسیت توسط اسپرم فعال میشود، به طوری که بدون هیچ گونه محرکی، اووسیت باید قادر به تشکیل پرونوکلئوسها و ایجاد زایگوت باشد. باز شدن سر اسپرم 2-1 ساعت بعد از نفوذ در تخمک و شکلگیری پرونوکلئوس نر 5-3 ساعت از نفوذ رخ میدهد (Hyttel et al., 1989). ازجمله تغییرات بیوشیمیایی که در اثر نفوذ اسپرم حاصل میشود، تغییر در الگوی یون کلسیم داخل سلول است که در طی پدیده لقاح موجب القای اگزوستیوز گرانولهای کورتیکال و بلاک نمودن پلیاسپرمی میشود. عمدهترین مشکل در روند لقاح وقوع پلی اسپرمی است. در شرایط طبیعی (Invivo) دستگاه تولید مثلی ماده باعث کاهش تعداد اسپرم رسیده به تخمک میشود (., 1993 Sun et al).
نگهداری اسپرم و تخمک در خلال برنامههای بلوغ تخمک، ظرفیت پذیری اسپرم و لقاح یافتن تخمکها در شرایط گرم خانه ای مخصوص (37 درجه سانتیگراد، 5%گاز co2 و حداکثر رطوبت) انجام میگیرد (Kim et al., 1998). برای مشاهده لقاح میتوان با مطالعه میکروسکوپی و یا با رنگ آمیزی و تثبیت نمودن تخمکها 24-18 ساعت پس از لقاح به وقوع کلیواژ پیبرد. درصد بالای لقاح در IVF به وجود تعداد مناسب اسپرمهای باروری که به شدت متحرک بوده و تخمکهای باروری که دارای اولین گویچه قطبی هستند، بستگی دارد.

بعضی از معیارهایی که به عنوان نشانه لقاح بکار میروند عبارتند از:
نفوذ اسپرم به داخل اووپلاسم
تورم سر اسپرم، تشکیل پیش هسته نر
تسهیم با ظاهر طبیعی، در جهت تشکیل بلاستومر
متلاشی شدن دانههای قشری
مشاهده دم یک اسپرم در اووپلاسم
هیج یک از موارد فوق به تنهایی نمیتواند بیانگر لقاح طبیعی باشد، چرا که برای نمونه رویانهای حاصل از بکرزایی هم، بعضی از معیارهای فوق را دارا هستند (, 1998.Kim et al).

41-1) مروری بر مطالعات انجام گرفته بر روی داروی سیکلوسپورین و عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور
Seethalakshmi وهمكاران در سال 1987 براي اولين بار اثرات مصرف CsA روی سیستم تولید مثلی بيماران پيوندي را بررسی کردند. و گزارش کردند سیکلوسپورین آ باعث تغييرات تخريبي و آتروفي لولههاي منيساز، كاهش تعداد و حركت اسپرم و بدشكليهاي اسپرم در مجاري اپيديديم شده و در نتيجه منجر به ناباروري مردان ميگردد.
Chen و همکارانش در سال 1988به این نتیجه رسیدند که اثرات تجویز روزانه CSA با دوز mg/kg10 بر پارامترهای ساختاری بیضه اثر چندانی ندارد.
Srinivas و همکاران در سال 1998 و Masuda و همکاران در سال 2003 نشان دادند سیکلوسپورین آ از طريق تضعيف روند تكاملي اسپرم، كاهش فعاليت فاگوسيتوزي سلول هاي سرتولي، كاهش وزن بيضه، كاهش تعداد اسپرمها ، كاهش سطح تستوسترون و افزايش سطح FSH و LHسرم باعث آسيب ساختار بافتي بيضه شده و در عمل كرد آن اختلال ايجاد ميكند.
Turk و همكاران 2010 اثرات CsA بر روی سیستم تولید مثلی موشهاي صحرايي نر را بررسی کردند آنها مشاهده کردند که سیکلوسپورین آ با دوز mg/kg 10در سال 1988 بر پارامترهاي ساختاري بيضه اثرات مخرب دارد.
Sirinivas در 1988 گزارش كرد كه در موشهاي صحرايي تحت درمان با سيكلوسپورين (دوز 20 ميلي گرم بر كيلوگرم وزن بدن ) تعداد اسپرمها, جمعيت سلولهاي هاپلوئيد مجاري منيساز و سطح تستوسترون سرم كاهش معني داري پيدا ميكنند.
Masudaدر 2003 نشان داد كه CsA باعث كاهش تعداد اسپرماتوزوآ، بدشكليهاي اسپرماتيدها، افزايش اجسام باقيمانده، تغييرات دژنراتيو شديد در مجاري مني ساز و افزايش اسپرماتيدهاي گرد دژنره شده و اسپرم هاي غيرطبيعي در مدت دو هفته پس از مصرف میگردد.
بهمنپور و نامآور ( ١٣٧٩ ) در مطالعههایي در خصوص تأثير سيكلوسپورين بر حاملگي و ميزان مرگ و مير جنين در موش سوري گزارش كردند كه سيكلوسپورين با دوز٥٠ ميليگرم به ازاء هر كيلوگرم وزن بدن روزانه، موجب افزايش ميزان مرگ و مير جنين و كاهش نوزادان ميگردد.
Li و همکاران در سال 2001، Maier و همکاران در سال 2009، نشان داده اند که عصاره به دست آمده از دانه انگور سبب مهار سیستم آنزیمی که مسئول تولید رادیکال های آزاد، مواد جهش زا و سرطان زاها میباشد، میشود .
Martinez-Florez و همکاران در سال 2002، عصاره هسته انگورعمدتا شامل فلاونوئیدهاست، که در بهبود استرس اکسیداتیو در شرایط آزمایشگاهی و در vivo in موثر می باشد.
Shi و همکاران در سال 2003، ترکیبات آنتیاکسیدان با خنثی نمودن رادیکال هاي آزاد، جلوي تخریب سلولی ناشی از اثر رادیکالهاي آزاد را میگیرند.
Faria و همکاران در سال 2006، بسیاری از اثرات بهداشتی مفید GSE به مهار خواص آنتیاکسیدانی و رادیکالهای آزاد نسبت دادند.
Yousef و همکاران در سال 2007، عصاره هسته انگور باعث میشود روند استروئیدوژنز و از این رو تولید تستوسترون و تولید اسپرم بهبود یافته و از این رو باروری افزایش پیدا کند.
Ljubuncic و همکاران در سال 2005 میوه زالزالک را به عنوان یک منبع غنی از آنتی اکسیدانتها برشمردهاند.
Yao و همکاران در سال 2008 گزارش کردند که اغلب فعالیتهای دارویی زالزالک به فلاونوئیدها و پروآنتوسیانیدینهای اولیگومریک موجود در آن نسبت داده میشود .
Khalil و همکاران در سال 2008 نشان دادهاند که گونههای متعددی از زالزالک دارای خواص کاهندگی چربی خون در حیوانات آزمایشگاهی میباشند.

*فصل دوم
مواد و روشها
۱-2) مواد:
-محیط کشت mR1ECM برای تهیهی رقت مناسب از اسپرم
– رنگ ائوزین-نگروزین جهت رنگآمیزی اسپرمهای زنده و مرده
– محلول فرمالین ۱۰% جهت فیکس نمودن بافت بیضه موشها
– داروی سیکلوسپورین بصورت کپسول
– رنگ ائوزین
– رنگ هماتوکسیلین
– الکل اتیلیک مطلق و ۹۶ درجه
– محلول گزیلل (زایلین)
– محلول آلبومین
– گلیسرول
– چسب انتالان
– کربنات لیتیم
– پارافین
– محلول اسید- الکل
– محلول کلروفریک
۲-2) وسایل و دستگاهها
-ترازوی حساس برای توزین رتها و داروها
– سرنگ انسولین ۱۰۰ واحدی جهت گاواژ دارو
– انکوباتور co2
– ست جراحی
– سمپلر برای برداشتن نمونه و انتقال آن به لولههای آزمایش
– دستگاه سانتریفوژ
– لام و لامل
– قلم الماس
– میکروتوم
– قالبهای پارافین و کرایوستات
– ظروف مخصوص رنگآمیزی
– عدسی مدرج و مشبک
3-2) آمادهسازی عصارههای آبی
1-3-2) تهیه عصاره هسته انگور
انگور قرمز از باغهای اطراف شهرستان ارومیه تهیه و پس از شستن و خشک کردن، هستهها از میوه جدا و آسیاب شدند. مقدار 25 گرم پودر هسته انگور به 250 میلیلیتر آب مقطر اضافه و به مدت 24 ساعت در دمای 40 درجه سانتی گراد در انکوباتور نگهداری شد. روزانه به مدت 3 ساعت بر روی دستگاه روتاتور با 200 دور در دقیقه چرخانده و بعد با کاغذ صافی واتمن شماره یک فیلتر و سپس حلال محلول فیلتر شده، با دستگاه تبخیر کننده چرخان تبخیر شد و عصاره خشک بدست آمد. این عمل 3 بار تکرار شد و کل نمونه ها جمع آوری و در یخچال تا زمان انجام آزمایش در دمای 20- نگهداری شد (Harborne, 1998).

2-3-2) طرز تهیه عصاره زالزالک
برای این منظور ، میوههای زالزالک پس از جمعآوری از مناطق رشد آن در اطراف شهرستان ارومیه و تایید توسط بخش گیاهشناسی دانشکده علوم دانشگاه ارومیه، به مدت 10 روز در دمای آزمایشگاه و دور از نور مستقیم آفتاب، خشک و آسیاب گردیدند. سپس 25 گرم از پودر به دست آمده در 250 میلی لیتر آب مقطر به مدت 15 دقیقه در دمای 100 درجه سانتیگراد جوشانده شده، جوشانده حاصل با استفاده از کاغذ صافیهای معمولی و متعاقبا کاغذ صافی واتمن (Whatman) شماره یک صاف میگردید. این جوشانده صاف شده نیز در دستگاه حذف حلال، تحت شرایط خلاء و در دمای 56 درجه سانتی گراد تغلیظ میگردید. پس از تغلیظ نهایی و خشک شدن، عصاره آبی نهایی به 4/12% وزن اولیه رسید. این عصاره آبی تهیه شده نیز تا زمان مصرف در دمای 18- سانتی گراد نگهداری میشد (Ljubuncic et al., 2005).
4-2) حیوانات
در این تحقیق از 32 رت نر بالغ نژاد Wistar در محدوده وزنی ۲۰±۲0۰ گرم جهت انجام آزمایشات استفاده گردید. حیوانات در خانه حیوانات گروه زیست شناسی دانشکده علوم دانشگاه ارومیه تحت شرایط استاندارد (۱۲ ساعت روشنایی و ۱۲ ساعت تاریکی ) و درجه حرارت ۲± ۲۲درجه سانتیگراد در قفسهای مخصوص پرورش و نگهداری میشدند. این حیوانات توسط پلیت تغذیه شده و جهت آبدهی از شیر آب شهری استفاده میشد.
5-2) تعیین حیوانات و دوز مؤثر دارو
موشهای نر حدود دو ماه پس از تولد بالغ میشوند و قادر به تولید حداکثراسپرم روزانه و بارورکردن موش های ماده میشوند. در رت ماده نیز 50-70 روز پس از تولد بلوغ جنسی اتفاق میافتد. بررسی مطالعات پیشین بر روی سیکلوسپورینآ نشان می دهد که تیمار سیکلوسپورین با دوز mg/kg/day40 باعث اختلال در باروری رتها میشود (Hiroshi et al., 2003). بنابراین میزان دوز تجویزی mg/kg/day40 انتخاب شد (بصورت محلول در نیم سیسی روغن کنجد) . میزان دوز تجویزی عصاره زالزالک ((Max et al., 2003 و عصاره هسته انگور(میرزایی ع و همکاران.، 1390) mg/kg/day150انتخاب شد.
6-2) گروه بندی حیوانات
32سر رت نر بالغ به طور تصادفی به ۴ گروه ۸ تایی تقسیم شدند و به صورت زیر تحت رژیم دارویی قرار گرفتند:
حیوانات گروه اول جهت حذف استرس تزریق به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شدند. این گروه بجز آب و غذا ترکیب دیگری دریافت نکردند.
حیوانات گروه دوم بمدت۴۵ روز ، روزی یک بار دارو ی سیکلوسپورین را به صورت گاواژ دریافت کردند.
حیوانات گروه سوم به مدت ۴۵ روز ، روزی یک بار داروی سیکلوسپورین را به همراه عصاره هسته انگور به صورت گاواژ دریافت می کردند.
حیوانات گروه چهارم به مدت ۴۵ روز، روزی یک بار داروی سیکلوسپورین را به همراه عصاره زالزالک به صورت گاواژ دریافت میکردند.
7-2) بررسیهای بافتشناسی
قبل از شروع آزمایش و گاواژ دارو، رتهای نر بالغ به مدت ۱۴ روز در مرکز پرورش و نگهداری حیوانات آزمایشگاهی درکنار هم و به صورت گروهبندی شده قرار داده شدند تا با شرایط محیط سازش پیدا کنند و استرسهای محیطی بر نتیجه آزمایشها هیچگونه تأثیری نداشته باشد. در پایان دوره تیمار (۱۸ روز پس از آخرین تزریق)، رت ها به روش جابجایی مهرههای گردن آسان کشی شد. بیضه سمت چپ را پس از پاساژ بافتی با H&E و PAS رنگ آمیزی نموده و بیضه سمت سمت راست را جهت مطالعات هیستوشیمیایی و هیستومورفومتری به کرایواستات انتقال داده شد و پس از تهیه مقاطع کرایواستات با سودان بلاک رنگآمیزی شدند و از آنها تصاویری با دوربین دیجیتالی تهیه و مورد مطالعه قرارگرفتند.

8-2) روش تهیه محلول ثبوتی فرمالین ١٠درصدی نمکی
کلرید سدیم ٩گرم
آلدئید فرمیک ١٠٠میلی لیتر
آب مقطر ٩٠٠ میلی لیتر
9-2) پاساژ بافتی
بافتهای تثبیت شده در فرمالین دارای مقدار زیادی آب هستند که این آب میتواند در تهیه مقاطع بافتی اختلال ایجاد کند، لذا آبگیری از بافتها جهت بوجود آمدن قوام و سفتی ضروری به نظر میرسد. این اعمال طی پاساژ یا گردش بافت صورت میگیرد. مراحل پاساژ بافت عبارتند از:
١-9-2) آبگیری (dehydration)
برای آبگیری از الکل اتانول با غلظتهای صعودی به شرح زیر استفاده شد:
١- الکل ٧٠ درجه ١ ساعت
٢- الکل ٨٠ درجه ١ ساعت
٣- الکل ٩٠ درجه ۵/١ ساعت
۴- الکل مطلق I ١ ساعت
۵- الکل مطلق II ١ ساعت
٢-9-2) شفافسازی (clearing)
این مرحله به منظور زدودن کدورت و افزایش شفافیت بافت میباشد. گزیلول (زایلین) به عنوان ماده شفاف کننده استفاده میشود. زیرا این ماده هم در الکل و هم در پارافین قابل اختلاط است و به برداشتن یا تمیز کردن الکل کمک میکند و چون مادهای فرار است با قرار گرفتن در حمام پارافین به آسانی تبخیر شده و پارافین مایع جای آن را میگیرد.
مراحل شفافسازی به صورت ذیل انجام گرفت:
١- محلول گزیلول + روغن سدر ١ شب
٢- محلول گزیلول ١ ساعت
٣-9-2- نفوذ و آغشتگی
در این مرحله برای نفوذ و آغشتگی، بافتها به یک حمام پارافین در یک کوره با دمای Cº60-56 (دمای ذوب پارافین) منتقل شدند. در حین این عمل گزیلل از بافتها با پدیده انتشار خارج شده و تبخیر میگردد و متعاقب آن پارافین برای جانشین شدن گزیلل به داخل بافت انتشار مییابد.
مراحل آغشتگی به صورت ذیل انجام گرفت:
١- پارافین مذاب ١ساعت
٢- پارافین مذاب II ١ساعت
٣- پارافین مذاب III ٢ ساعت
۴-9-2) قالبگیری
بعد از اینکه بافتها مراحل ثبوت و پاساژ بافتی را گذراندند. برای تهیه مقاطع میکروسکوپی لازم است که این قطعات در بلوکهای پارافینی قالبگیری شوند و برای برش توسط میکروتوم آماده شوند. برای قالبگیری ابتدا لازم است که پارافین را ذوب نموده و در داخل قالبهای مخصوص ریخته و سپس بافت را بوسیله یک پنس گرم برداشته و در پارافین مذاب قرار دهیم به طوری که سطح برش به طرف کف ظرف قرار گیرد. به منظور شناسایی نمونهها، بر روی هر یک از بلوکهای پارافینی تهیه شده، شماره یا نام مربوط به هر نمونه را با مداد نوشته و نصب میشود. پس از سرد شدن پارافین و منجمد شدن آن قالبها را جدا کرده و بلوکهای پارافینی جهت نگهداری به یخچال منتقل گردیدند.

5-9-2) برش بافت و ثابت کردن مقاطع بافتی بر روی لام
در این مرحله قالبهای پارافینی را از یخچال خارج کرده و با استفاده از دستگاه میکروتوم دوار برشهایی با ضخامت ۵ تا ٧ میکرون از بافت مورد نظر تهیه میشود. برشهای حاصل را به حمام آب گرم با دمای Cº45 منتقل کرده و با این کار چین خوردگیهایی که حین برش بوجود آمده بود از بین میروند. برای چسباندن نمونهها به لام از چسب آلبومین استفاده میکنیم. سپس لامها به مدت ٢۴ ساعت در هوای آزمایشگاه باقی ماندند تا کاملأ خشک شوند.
۶-9-2) طرز تهیه چسب آلبومین
سفیده تخممرغ و گلیسرول را به نسبت مساوی با هم مخلوط کرده و یک قطعه تیمول به عنوان محافظ برای جلوگیری از رشد باکتریها و قارچها به آن اضافه میشود. بعد از آماده نمودن محلول آلبومین، لامهای تمیز و خشک را برداشته یک قطره از محلول را روی هر یک از آنها قرار داده، بعد با نوک انگشت آن را در سطح لام پخش میشود. بعد از آماده شدن لامها، مقاطع بافتی را که در حمام آب گرم شناور هستند به روی لامها منتقل نمودند. اکنون لامها برای رنگآمیزی آماده هستند.
10-2) رنگ آمیزی مقاطع بافتی
برای بررسی خصوصیات فیزیکی اجزاء سلولی و ارتباطات بافتها، برشهای مورد نظر باید مورد رنگآمیزی قرار گیرند. اما قبل از انجام رنگآمیزی باید پارافین از مقطع روی اسلاید برداشته شود. برای این منظور و آبدهی به بافتها، اسلایدها را به ترتیب از محلولهای ذیل عبور میدهیم.
١- محلول گزیلل I ٣ دقیقه
٢- محلول گزیلل II ٣ دقیقه
٣- محلول گزیلول III ٣ دقیقه
۴- الکل 96 درجه 3 دقیقه
۵- الکل ٩٠ درجه ٣ دقیقه
۶- الکل ٨٠ درجه ٣ دقیقه
٧- الکل ٧٠ درجه ٣ دقیقه
بدین ترتیب مقاطع برای رنگآمیزی آماده میگردند.
11-2) رنگآمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E)
جهت انجام این رنگآمیزی، لامهای آماده شده در مراحل قبل را به ترتیب از محلولهای ذیل عبور میدهیم.
١- محلول هماتوکسیلین هاریس ١٣-١٠ دقیقه
٢- شستشو در آب جاری
٣- محلول اسید – الکل ٣ ثانیه
۴- شستشو در آب جاری
۵- محلول کربنات لیتیوم اشباع ۵-٣ دقیقه
۶- شستشو در آب جاری
٧- محلول ائوزین ٧ دقیقه
٨- شستشو در آب جاری
٩- الکل ٧٠ درجه ٠٣-١۵ ثانیه
١٠- الکل ٨٠ درجه ۴۵-٣٠ ثانیه
١١- الکل ٩٠ درجه ٣ دقیقه
١٢- الکل 96 درجه ٣ دقیقه
١٣- محلول گزیلل I ٣ دقیقه
١۴- محلول گزیلل II ٣ دقیقه
١۵- محلول گزیلل III ٣ دقیقه
١-11-2) طرز تهیه اسید الکل
برای تهیه اسید الکل ١٠٠ میلیلیتر الکل اتیلیک ٧٠ درجه با ١٠ میلیلیتر اسید کلریدریک غلیظ مخلوط شد.
٢-11-2) طرز تهیه رنگ ائوزین
برای تهیه محلول رنگ ائوزین، یک گرم ائوزین در ١٠٠ میلیلیتر آب مقطر حل شده و یک قطعه تیمول به عنوان محافظ به آن افزوده شد.
نتیجه رنگآمیزی : هسته سلول به رنگ آبی تیره تا سیاه و سیتوپلاسم به رنگ صورتی در میآید.
بعد از اتمام رنگ آمیزی، یک قطره از چسب انتالان را روی لامل میگذاریم و سپس به آرامی لامل حاوی چسب را بر روی لام حاوی بافت قرار میدهیم و لامل را روی آن میچسبانیم. اکنون لام برای مطالعه با میکروسکوپ نوری آماده است. با استفاده از این رنگ آمیزی قطر لولههای منیساز، ضخامت اپیتلیوم لولههای منیساز، ضخامت بافت پیوندی ما بین لولهها، درصد تمایز لولهای و درصد اسپرمیوژنز محاسبه گردید.
3-11-2) طرز تهیه رنگ هماتوکسیلین هاریس
هماتوکسیلین 1گرم
الکل اتیلیک مطلق 10-20 میلی لیتر
آلوم آلومینیوم 20 گرم
آب مقطر 200 میلی لیتر
اکسید مرکوریک 5/0 گرم
هماتوکسیلین در الکل و آلوم آلومینیوم در آب مقطر در مجاورت کمی حرارت حل گردیده، دو محلول فوق با هم مخلوط شده و به سرعت جوش آورده شدند. در همان موقع اکسید مرکوریک به آن اضافه شده و با قرار دادن در آب سرد سریعاً خنک گردید.
12-2) ارزیابی هیستو مورفومتریک بیضه
پس از تهیه مقاطع بافتی و رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین، جهت انجام ارزیابی های هیستومورفومتریک بیضه نظیر بررسی قطر لولههای منیساز، ارتفاع اپیتلیوم لولههای منیساز، ضخامت بافت بینابینی، قطرکپسول بیضه و قطرهسته سلولهای لیدیگ و سرتولی در گروههای مختلف آزمایشی، عدسی چشمی مدرج مورد استفاده قرار گرفت (Elias and Hyde, 1980).
شمارش تعداد مقاطع لولههای منیساز، ماستسل ها، سلولهای لیدیگ و سلولهای ایمنی تک هستهای در واحد سطح بیضه نیز با استفاده از عدسی چشمی مشبک انجام پذیرفت (Gunderson, 1977). لازم به ذکر است که به منظور مطالعه و شمارش ماست سلها، روش رنگ آمیزی تولوئیدین بلو جهت رنگآمیزی مقاطع بافتی مورد استفاده قرارگرفت (Gaytan et al., 1992). مقایسه تعداد سلول های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتید و سلول های سرتولی لوله منیساز در گروههای مختلف آزمایشی نیز به واسطه شمارش این سلول ها در 100 لوله منیساز صورت گرفت(Humason, 1979) .
13-2) آمادهسازی موش برای IVF
جهت انجام این مطالعه به 12 رت ماده بالغ 5/7 واحد هورمون PMSG38 (ساخت شرکت Folligon هلند) به حجم 1/. میلی لیتر و 48-46 ساعت بعد از تزریق 5/7 واحد هورمون HCG39(ساخت شرکت Folligon هلند) به حجم1/. میلی لیتر به روش داخل صفاقی (40IP) صورت گرفت. عمل تخمکگذاری معمولاً 12-10 ساعت پس از تزریق HCG صورت میگیرد.
1-13-2) آمادهسازی محیط کشت برای IVF
روز پیش از لقاح محیط کشتهای لازم برای انجام عمل لقاح تهیه شده و به مدت 12 ساعت در انکوباتور با ترکیب گازی %5 CO2 در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار میگرفت. دیشهای لقاح با محیط کشت mR1ECM قطره گذاری می شوند. یک قطره 500 میکرولیتری در هر دیش برای لقاح و چندین قطره 100میلیلیتری برای شستشو در دیشهای IVF گذاشته میشوند و سطح روی آنها با روغن معدنی (mineral oil- sigma) پوشانیده میشد.
2-13-2) طرز تهیه محیط کشت mR1ECM
استوک A :کلرید سدیم 42/6 گرم، کلرید پتاسیم 239/0 گرم ، گلوکز 352/1 گرم ، پنیسیلین جی 075/0 ، استرپتومایسین 050/0 گرم لاکتات سدیم 9/1 میلی لیتر را در 100 میلی لیتر آب سه بار تقطیر حل کرده و سپس با استفاده از فیلتر 20/0 فیلتر نموده و تحت عنوان استوک A در داخل یخچال 4 درجه سانتی گراد قرار داده شد.
استوک B :برای تهیه آن کلرید کلسیم به میزان 294/0 گرم و کلرید منیزیم 102/0 گرم را در 100 میلی لیتر آب دو بار تقطیر حل نموده و بعد از فیلتر کردن در یخچال4 درجه سانتی گراد نگهداری گردید.
در داخل یک فلاکس محیط کشت 10 میلی لیتر از استوکA و 10 میلی لیتر از استوکB را ریخته و به آن 210/0 گرم بی کربنات سدیم ، 0055/0 گرم پیرووات سدیم ، 0146/0 گرم گلوتامین ال ، 2 میلی لیتر اسیدهای آمینه ضروری و 1 میلی لیتر اسیدهای آمینه غیر ضروری اضافه نموده سپس حجم آن را با استفاده از آب سه بار تقطیر به 100 میلی لیتر رسانده و محیط را فیلتر و مورد استفاده قرار دادیم (, 2006 Mark).

3-13-2) تهیه اسپرم :
برای تهیه اسپرم از رتهای تحت تیمار استفاده شد. رتها به روش جابجایی مهرههای گردن آسانکشی شد. سپس پوست ناحیه شکمی با اتانول %70 استریل شده و با ایجاد برش در ناحیه شکم و بعد از جداکردن بافتهای همبندی اطراف، دم اپی دیدیم همراه با مقداری از کانال دفران از بیضه جدا و در داخل پتریدیش 2 سانتی متری محیط کشت mR1ECM ، که قبلاً جهت تعادل در داخل انکوباتور قرار داده شده بود قرارگرفت و پس از ایجاد چند برش در دماپی دیدیم و فشار در کانال دفران، برای خروج اسپرمها در داخل انکوباتور Co2 گذاشته شد. بعد از 30 دقیقه اسپرمها خارج شده و در محیط پخش میشدند، سپس اسپرمها را شستشو داده و با استفاده از روش شناورسازی اسپرمهای متحرک را جدا نموده و جهت ظرفیتیابی اسپرم به مدت 6-5 ساعت در انکوباتور co2 با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند.
4-13-2) روش گرفتن تخمک بالغ و لقاح داخل آزمایشگاهی(IVF):
بین 10 تا12 ساعت پس از تزریق HCG (صبح روز بعد)، بعد از آسان کشی حیوان به روش جابجا کردن مهرههای گردن، لوله های رحمی به همراه قسمت کوچکی از رحم جدا شده و در داخل محیط کشت 37 درجه سانتی گراد از قبل به تعادل رسیده، قرار داده شد. با استفاده از تکنیک Dissecting تخمکها را خارج نموده و بعد از شستشو با mR1ECM ، تخمکها را به قطرات محیط کشت mR1ECM منتقل کرده و سپس اسپرمهای متحرک به توانایی رسیده به تعداد یک میلیون به ازای هرمیلی لیتر محیط کشت به آن اضافه شد. عمل لقاح 8-6 ساعت بعد از اضافه کردن اسپرم با مشاهده دو پیش هسته مشخص میشود و بدین ترتیب زیگوت بدست آمده و تخمک های بارور شده (زیگوت) بعد از دنود (لخت) و شستشو به محیط کشت تازه از قبل به تعادل رسیده در گروه های مختلف مورد مطالعه منتقل شده و به مدت 5 روز کشت داده شدند.

نمایی از ظرف کشت و لقاح
14-2) ارزیابی رشد جنینها:
برای ارزیابی مراحل رشد زیگوت مواد مذکور در زیر میکروسکوپ معکوس مورد ارزیابی قرار گرفت، بررسی میزان کلیواژ 24 ساعت بعد از کشت صورت گرفته و در زیگوتهای موجود در هر گروه، جنینها از نظر فراگمانتاسیون و میزان، طی مراحل رشد جنینی یا تعداد جنینهای متوقف شده و تیپبندی جنینهای متوقف شده با توجه به فاکتورهای مختلفی نظیر لیزشدن جنینها و نکروتیک بودن آنها و فراگمانتاسیون مقایسه گردیدند.
تیپ بندی زیگوتهای متوقف شده به شرح ذیل میباشد:
تیپ1 : جنینهای بالیز، فراگمانته شدن و نکروتیک بودن کامل
تیپ2 : جنین های بالیز و فراگمانته شدن در تعدادی از بلاستومرها
تیپ3 : جنین های با تعداد کمی بلاستومرهای لیز و فراگمانته
کیفیت جنینها و تعداد جنینهای رشد کرده در طی 120 ساعت و درصد شکافتگی ومیزان جنینهای متوقف شده و درصد بلاستوسیستهای ایجاد شده در هر گروه مورد ارزیابی قرار گرفت.

15-2) ارزیابی اسپرماتوژنز در بافت بیضه
برای این منظور تعداد 100 لوله منی ساز در هر بیضه جهت ارزیابی شاخصهای زیر قرار گرفتند.
ضریب تمایز لولهای :(TDI) جهت مشخص نمودن این شاخص، درصد لولههای منیسازی که دارای سه و یا بیشتر از سه رده سلولهای اسپرماتوژنز تمایز یافته از سلولهای اسپرماتوگونی A بودند محاسبه گردید ( Rezvanfar et al., 2008).
ضریب بازسازی(RI): درصد لولههای منی سازی که در آنها سلولهای زایا به رده اسپرماتوگونی بینابینی یا ردههای پس از آن رسیده بودند جهت ارزیابی این شاخص محاسبه گردید (یا نسبت اسپرماتوگونیهای B به اسپرماتوگونیهای A)
( Meistrich and van Beek, 1993).
ضریب سلول سرتولی (SCI) و ضریب میوزی (MI): به منظور محاسبه ضریب سلول سرتولی و ضریب میوزی به ترتیب نسبت تعداد سلولهای زایا به تعداد سلولهای سرتولی (Russell et al., 1990) و نسبت تعداد اسپرماتیدهای گرد به اسپرماتوسیت های اولیه مشخص گردید (Kheradmand et al,. 2011)
16-2) ارزیابی خصوصیات اسپرمها
1-16-2) نحوه استحصال اسپرم از اپیدیدم
به منظور ارزیابی خصوصیات اسپرم ابتدا اپیدیدیم موشها زیر لوپ با بزرگنمایی 20 برابر از بافت بیضه جدا شده وبافتهای اطراف آن تمیز گردید. بلافاصله دماپیدیدیم درون پتری دیشهای حاوی یک میلی لیتر محیط کشت mR1ECM در هر میلیلیتر که امروزه به عنوان محیط کشت مناسب برای اسپرمها در نظر گرفته شده است، قرار گرفت . برای جلوگیری از ایجاد شوک حرارتی و آسیب به اسپرمها، تمام وسایل مورد استفاده و محیط کشت قبل از مصرف در انکوباتور 37 درجه قرار داده شدند. سپس دم اپی دیدیم در داخل محیط کشت به قطعات کوچک خرد شده و به مدت30 دقیقه در درون محیط کشت در انکوباتور باقیماند تا امکان خروج اسپرمها از اپیدیدیم فراهم آید.

2-16-2) بررسی تحرک در اسپرماتوزوئیدها
بعد از خارج کردن اپیدیدیمها، دم آنها را در داخل ml ۷ محیط کشت mR1ECM ،C ۳۷° قرار داده شد و سپس با ایجاد دو برش عرضی و طولی، به مدت ۳۰ دقیقه درون انکوباتور CO2 قرار داده شد. سپس از انکوباتور خارج و قطعات اپیدیدیم از محلول بیرون آورده و با ml ۳ محیط کشت شستشو داده شد. سپس یک قطره از سوسپانسیون تهیه شده را بعد از رقیق کردن در محیط کشت مذکور بر روی لام قرار داده و شمارش درصد اسپرمهای متحرک با پیشرونده، سریع، متوسط ، کند و غیرمتحرک در چند میدان دید و در سه مرحله با استفاده از میکروسکوپ صورت گرفت و درصد اسپرمهای متحرک بدست آمد (Selvakumar et al., 2006) .
3-16-2) شمارش اسپرمها :
به منظور شمارش تعداد اسپرمها از لامهای معمولی استفاده شد. ۱۰ میکرولیتر از محلول رقیق شده اسپرم بر روی لام معمولی قرار گرفته و تعداد اسپرمها در هر میلیلیتر با استفاده از فرمولd ×۵۰۰۰۰ n ×و توسط میکروسکوپ نوری با درشت نمایی ۴۰۰ برابر محاسبه گردید که n تعداد اسپرمهای شمارش شده و d عکس رقت سوسپانسیون حاوی اسپرم میباشد (Zambrano et al., 2005).
17-2) ارزیابی قابلیت زنده ماندن و مورفولوژی اسپرمها
برای ارزیابی درصد اسپرمهای مرده ونیز اسپرمهای غیرطبیعی از لحاظ مورفولوژیکی رنگآمیزی ائوزین نگروزین مورد استفاده قرار گرفت. مبنای تشخیص اسپرمهای مرده در این روش رنگآمیزی بر این اصل استوار است که در اثر آسیب به غشاء پلاسمایی، اسپرمها در برابر رنگ مذکور نفوذپذیر میگردند. لذا آن دسته از اسپرمهایی که هر یک از قطعات سر، گردن و یا دم آنها رنگ گرفته بود به عنوان اسپرمهای مرده در نظر گرفته شدند. در همین راستا اسپرمهایی که دارای بقایای سیتوپلاسمی و نیز سایر اختلالات مورفولوژیک بودند، به عنوان اسپرمهای غیرطبیعی در نظر گرفته میشدند. تعداد ۲۰۰ اسپرم برای هر نمونه با درشتنمایی ۴۰۰ برابر مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاصل در قالب درصد بیان شدند (Wyrobek et al., 1983).

۱8-2) بررسی وضعیت بلوغ هسته اسپرم: رنگ آمیزی آنیلین بلو (AB)
پروتئین هیستون دارای تعداد زیادی اسیدآمینه لیزین میباشد که با رنگهای اسیدی مانند آنیلین بلو واکنش میدهد و آبی رنگ میشود. بنابراین اسپرمهایی که پس از تراکم در کروماتین خود، دارای هیستونهای اضافی باشند با این رنگ آمیزی مشخص میشوند. پس از تهیه اسمیر از هر نمونه حیوانی و خشک شدن در هوا، مرحله فیکس شدن نمونهها توسط فیکساتیو گلوتارآلدئید ۳% در بافر به مدت ۳۰ دقیقه انجام شد. در مرحله بعد نمونهها توسط محلول ۵% آنیلین بلو در اسید استیک ۴% (۵/۳=PH) به مدت ۵ دقیقه رنگ آمیزی شدند. پس از شستشو با آب مقطر، لامها با میکروسکوپ نوری و عدسی 100× مورد بررسی قرار داده و با شمارش ۱۰۰ اسپرم، درصد اسپرم بیرنگ (نابالغ) تعیین گردید. (Hamadeh et al., 2001)
19-2) بررسی DNA شکسته و یا تک رشتهای: رنگ آمیزی آکریدین اورانژ (AO)
این رنگ فلورسنت، جهت تمایز DNA دورشتهای سالم از DNA تک رشتهای ناسالم و دناتوره بکار میرود. AO با DNA دو رشتهای سالم زیر میکروسکوپ فلورسنت سبزرنگ و با DNA تک رشتهای دناتوره زرد تا قرمز رنگ میشود. پس از تهیه اسمیر از هرنمونه و خشک کردن در هوا، فیکس شدن نمونهها توسط محلول کارنوی به مدت حداقل 2ساعت صورت گرفت و سپس رنگ AO تازه با غلظت 19/0 میلی گرم در بافر سیترات فسفات به مدت 10 دقیقه برای رنگآمیزی لامها بکار رفت. پس از شستشو توسط آب جاری، لامها توسط میکروسکوپ فلورسنت و در یک محیط تاریک با فیلتر nm460 بررسی شدند (Erenpreiss et al., 2001).
20-2) مطالعات هیستوشیمیایی بیضه
1-20-2) رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف (PAS)
جهت مشخص نمودن کربوهیدراتها در بافت بیضه، مقاطع بافتی تهیه شده از قالبهای پارافینی با استفاده از این روشرنگ آمیزی شدند. روش رنگآمیزی PAS به طور معمول جهت مطالعه پلیساکاریدها، ترکیبات موکوسی خنثی و غشاهای پایه مورد استفاده قرار میگیرد. این ترکیبات متعاقب رنگ آمیزی به واسطه واکنش شیف رنگ قرمز ارغوانی به خود میگیرند (Lee and Luna, 1968).
2-20-2)رنگ آمیزی سودان بلک
به منظور مطالعه چربیها در بافت بیضه، برش انجمادی تهیه شده توسط دستگاه کرایواستات با استفاده از این روش رنگ آمیزی شدند. روشهای رنگ آمیزی سودان- ب جهت مشخص نمودن ذخایر اگزوژن و اندروژن بسیاری از چربیها نظیر فسفولیپیدها، چربیهای خنثی و استرولها مورد استفاده قرار گرفته و به ترتیب چربیها را با رنگهای سیاه و قرمز مشخص مینمایند(Sheehan and Storey, 1947) .
3-20-2) بررسی هیستوشیمیایی فعالیت آنزیم الکالین فسفاتاز
الکالین فسفاتاز یک آنزیم هیدرولاز است که مسئول حذف گروههای فسفات از انواع متعددی از مولکولها نظیر نوکلئوتیدها، پروتئینها و الکالوئیدها میباشد. این روش در ارزیابی میزان واکنشهای التهابی در بافتهای مختلف مورد استفاده قرار میگیرد و اساس آن بر پایه تولید رنگ قهوهای تیره توسط فسفات کلسیم آزاد شده به واسطه واکنش آنزیمی در حضور نیترات کبالت و سولفید آمونیوم میباشد. از آنجا که فرایند ثبوت و پاساژ بافتی موجب آسیب به این آنزیم میگردد مطالعه فعالیت آنزیم الکالین فسفاتاز بر روی برشهای انجمادی تهیه شده از نمونههای بافتی تازه صورت پذیرفت (Bakst et al., 2007) .

21-2) آنالیز و تحلیل دادهها
محاسبه آماری با استفاده از نرم افزار آماری SPSS نسخه 16 انجام شد و برای مقایسه میانگین بین گروهها از آنالیز واریانس یک طرفه و تست تعقیبی Tukey استفاده شد (p<0.05) به عنوان معیار معنی دار بودن اختلاف ها در نظر گرفته شد.
*فصل سوم
نتایج و یافتهها
علائم اختصاری بکار برده شده در نمودارهای مربوط به گروه های تحت تیمار
Con: گروه کنترل، Cyc25: گروه سیکلوسپورین روز 25، Cyc45 : گروه سیکلوسپورین روز 45 ، Cyc+GSE25 : گروه سیکلوسپورین + عصاره هسته انگور روز 25، GSE45+Cyc : گروه سیکلوسپورین + عصاره هسته انگور روز 45،Cyc+ HE25: گروه سیکلوسپورین+ عصاره زالزالک روز 25،: Cyc+ HE45 گروه سیکلوسپورین + عصاره زالزالک روز 45
1-3) نتایج حاصل از پارامترهای مختلف اسپرم
1-1-3) نتایج حاصل از شمارش اسپرم در اپیدیدیم
طبق نمودار( 1-3 ) تعداد اسپرمهای اپیدیدیمی در گروههای تحت تیمار با سیکلوسپورینآ در روزهای 25 و 45 به طور معنی داری در سطح p<0.05 نسبت به گروه کنترل کاهش یافت. در گروههایی که عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور را بمدت 25 روز دریافت کردند تعداد اسپرمهای ایجاد شده تا حدی بهبود حاصل کرد به طوری که دارای تفاوت معنیدار با گروهی که بمدت 45 روز سیکلوسپورینآ را دریافت کردند بود ولی با گروه سیکلوسپورین 25 اختلاف آماری معنیداری نداشتند. در گروههای عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور روز 45 روند بهبود تا حدی پیشرفت کرد که در پایان روز 45 تفاوت معنیداری در سطح p<0.05 بین این دو گروه با گروه کنترل نبود. نمودار1-3: مقایسه میانگین تعداد اسپرم در گروه های تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح p<0.05 است.
2-1-3) نتایج حاصل از مطالعه میزان اسپرم زنده
طبق نمودار(2-3) درصد اسپرمهای زنده در گروه تیمار شده با سیکلوسپورینآ نسبت به گروه کنترل کاهش یافته اما این کاهش در سطح p<0.05 معنیدار نبوده و با مصرف عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور همراه با سیکلوسپورینآ ، همین مقدار کاهش نیز بهبود یافته است و در روز 45 هیچ گونه اختلاف معنیداری بین گروه دریافت کننده عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور با گروه کنترل در سطح p<0.05 مشاهده نشد(P>0.05).

نمودار2-3: مقایسه میانگین درصد اسپرمهای زنده در گروههای تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح p<0.05 است.
3-1-3) نتایج حاصل از شمارش اسپرمهای نابالغ
طبق نمودار(3-3) درصد اسپرمهای نابالغ در گروهی که بمدت 45 روز سیکلوسپورینآ دریافت کرده، نسبت به سایر گروهها دارای اختلاف معنیداری در سطح p<0.05 با گروه کنترل میباشد. با مصرف عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور به عنوان آنتی اکسیدان درصد تولید اسپرمهای نابالغ کاهش یافت ، به طوری که گروههای دریافت کننده عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور در روز 25و 45 اختلاف معنیداری در سطح p<0.05 با گروه کنترل ندارند (P>0.05).

نمودار3-3: مقایسه میانگین درصد اسپرمهای نابالغ در گروههای تحت تیمار
* نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح p<0.05 است.
4-1-3) نتایج حاصل از مطالعه کروماتین اسپرم
طبق نمودار (4-3) درصد اسپرمهای با کروماتین آسیبدیده در گروهی که سیکلوسپورین آ را بمدت 25 روز دریافت کرده است افزایش یافته اما میزان افزایش نسبت به گروه کنترل در سطح p<0.05 معنیدار نمیباشد اما در گروه سیکلوسپورینآ روز 45 درصد اسپرمهای با کروماتین آسیبدیده به طور معنیداری در سطح p<0.05نسبت به گروه کنترل افزایش یافته است. با مصرف همزمان عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور با داروی سیکلوسپورینآ این درصد کاهش یافته و در نهایت با گروه کنترل دارای اختلاف معنیداری در سطح p<0.05 نمیباشد(P>0.05).

نمودار4-3: مقایسه میانگین درصد اسپرمهای با کروماتین آسیب دیده در گروههای تحت تیمار
* نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح p<0.05 است.
تصویر 1-3) اسپرمهای رت رنگ آمیزی شده با روش ائوزین نگروزین جهت ارزیابی قابلیت زنده ماندن اسپرم، اسپرمهای زنده (بی رنگ) و اسپرمهای مرده (رنگ گرفته)

تصویر2-3) اسپرمهای با مورفولوژی طبیعی رت رنگآمیزی شده با روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین برای ارزیابی مورفولوژی اسپرم

2-3) نتایج حاصل از مطالعه پارامترهای مختلف لقاح (IVF)
1-2-3) نتایج حاصل از تعداد اووسیتهای لقاح یافته در گروههای مختلف آزمایش
طبق نمودار (9-3) به دنبال تجویز سیکلوسپورینآ تعداد اووسیتهای لقاح یافته در گروههای تحت تیمار که سیکلوسپورین آ را به مدت 25 و 45 روز دریافت کردند کاهش معنیداری را در سطح p<0.05 نسبت به گروه کنترل نشان میدهند. در گروههایی که علاوه بر سیکلوسپورین، عصاره هسته انگور را دریافت کردند، در تعداد اووسیتهای لقاح یافته بهبود حاصل شد به طوری که در روزهای 25و45 اختلاف معنیداری بین این دو گروه و گروه کنترل در سطح p<0.05 وجود نداشت. اما گروهی که علاوه بر سیکلوسپورین، عصاره زالزالک را دریافت کرد بهبودی به میزان کمتری حاصل شد به طوری که در روزهای 25و 45 اختلاف معنی داری بین این گروه و گروه کنترل در سطح p<0.05 مشاهده شد. نمودار9-3: مقایسه میانگین درصد اووسیتهای لقاح یافته در گروههای تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح p<0.05 است.
2-2-3) نتایج حاصل از تعداد جنینهای دوسلولی
طبق نمودار(10-3) تعداد جنین 2 سلولی در گروه کنترل دارای تفاوت معنیدار با گروههای تیمار شده با سیکلوسپورینآ در سطح p<0.05 میباشد. به طوری که در گروههای تحت تیمار تا حد زیادی درصد جنینهای دو سلولی کاهش پیدا کرده است. در گروههایی که علاوه بر سیکلوسپورین عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک را دریافت کردند روند بهبود بخشی حاصل شد، به طوری که در پایان روز 45 این گروها اختلاف معنیداری با گروه سیکلوسپورین روز 45 در سطح p<0.05 داشته و با گروه کنترل و سیکلوسپورین روز 25 هیچ گونه اختلاف آماری معنیداری در سطح p<0.05 نداشتهاند(P>0.05).
.

نمودار 10-3: مقایسه میانگین درصد جنینهای دوسلولی در گروههای تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح p<0.05 است
3-2-3) نتایج حاصل از تعداد بلاستوسیست
طبق نمودار (11-3 ) تعداد بلاستوسیستها در گروههای تحت تیمار با سیکلوسپورین در روزهای 25 و 45 دارای اختلاف معنیداری با گروه کنترل در سطح p<0.05 است به طوری که در این گروهها درصد بلاستوسیستها تا حد زیادی کاهش یافته است. در گروههای تحت تیمار که همراه با سیکلوسپورینآ عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور را دریافت کردند ، این پارامتر بهبود یافت به طوری که این گروهها دارای اختلاف معنیداری با گروه سیکلوسپورین میباشند ، درحالی که هیچ گونه اختلاف آماری معنی داری با گروه کنترل در سطح p<0.05 ندارند(P>0.05).

نمودار 11-3: مقایسه میانگین درصد بلاستوسیستها در گروههای تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح p<0.05 است.
4-2-3) نتایج حاصل از تعداد جنینهای ارست شده
طبق نمودار( 12-3 ) درصد جنین ارست شده در گروهی که به مدت 25 روز داروی سیکلوسپورین را دریافت کرده است دارای تفاوت معنیداری با گروه کنترل در سطح p<0.05 نمیباشد. اما با ادامه تیمار، درصد جنینهای ارست شده در گروه سیکلوسپورین روز 45 اختلاف معنیداری در سطح p<0.05با گروه کنترل نشان میدهند. همچنین درگروههای سیکلوسپورین + عصاره هسته انگور ، در روزهای 25 و 45 اختلاف معنیداری در درصد جنینهای ارست شده با گروه کنترل مشاهده نشد. و در گروه سیکلوسپورین + عصاره زالزالک در روز 25 تعداد جنینهای ارست شده نسبت به گروه کنترل افزایش قابل ملاحظه ای را نشان داد اما با ادامه تیمار در روز 45 درصد جنین های ارست شده کاهش یافت طوری که اختلاف معنیداری در سطح p<0.05 بین این گروه وگروه کنترل مشاهده نشد (P>0.05).
.

نمودار12-3: مقایسه میانگین درصد جنینهای ارست شده در گروههای تحت تیمار
* نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح p<0.05 است.
5-2-3) نتایج حاصل از تعداد جنینهای تیپ 1
طبق نمودار( 13-3 ) درصد جنین تیپ 1 (جنینهایی با کیفیت بد) در گروهی که به مدت 25 روز داروی سیکلوسپورین را دریافت کردهاست دارای تفاوت معنیداری با گروه کنترل نمیباشد. اما با ادامه تیمار در گروههایی که سیکلوسپورین را به مدت 45 روز دریافت کردهاند به طور قابل ملاحظهای افزایش یافت و دارای تفاوت معنیدار با گروه کنترل در سطح p<0.05 میباشند . در گروههایی که علاوه بر سیکلوسپورین عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور را دریافت کرده اند در روز 25 به مقدار کمی بهبودی حاصل شد، طوری که بین گروههای روز 25 و کنترل اختلاف معنیدار در سطح p<0.05 مشاهده شد. اما با ادامه تیمار با عصاره هسته انگور و زالزالک در روز 45 بهبودی زیاد حاصل شد و بین گروههای روز 45 و کنترل اختلاف معنیداری در سطح p<0.05 وجود نداشت(P>0.05).

نمودار13-3: مقایسه میانگین درصد جنینهای تیپ 1 در گروههای تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح p<0.05 است.
6-2-3) نتایج حاصل از جنینهای تیپ 2
طبق نمودار (14-3) درصد جنینهای تیپ2 (جنین هایی با کیفیت متوسط) در گروهی که سیکلوسپورین آ را دریافت کرده است (روزهای 25 و 45) افزایش یافته است ، به طوری که دارای تفاوت معنیدار با گروه کنترل در سطح p<0.05 می باشند. با مصرف عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور تعداد جنینها کاهش مییابد و در روز 25 و 45 دارای اختلاف آماری معنیدار در سطح p<0.05 با گروه کنترل نمیباشند(P>0.05).

نمودار14-3 : مقایسه میانگین درصد جنینهای تیپ 2 در گروههای تحت تیمار
* نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح p<0.05 است.
6-2-3) تنایج حاصل از تعداد جنینهای تیپ 3
طبق نمودار (15-3) گروههایی که سیکلوسپورینآ را به مدت 25 و 45 روز دریافت کردند کاهش معنیداری در درصد جنینهای تیپ 3 (جنینهای با کیفیت خوب) را نشان دادهاند و با گروه کنترل دارای اختلاف آماری معنیداری در سطح p<0.05 میباشند. استفاده از عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک باعث بروز روند بهبود بخش در این نوع جنینها شده به طوری که در روز 45 هیچ گونه اختلاف آماری معنیداری در سطح p<0.05 بین گروه های سیکلوسپورین + زالزالک و سیکلوسپورین + عصاره هسته انگور روز 45 با گروه کنترل وجود نداشت(P>0.05).

نمودار15-3: مقایسه جنینهای تیپ 3 در گروههای تحت تیمار
حروف غیریکسان نشان دهنده اختلاف آماری معنیدار در سطح p0.05 است.

تصویر 3-3) اووسیت به همراه توده کومولوسی در پیرامون آن (Coc41) جهت انجام پروسه IVF

تصویر4-3) جنین 2 سلولی(200×)

تصویر 5-3) جنین در مراحل مختلف تقسیم(400×).a : جنین در مرحله چهار سلولی، b : جنین در مرحله مورولا
c : جنین در مرحله بلاستوسیست، d : گامت های لقاح نیافته

تصویر 6-3) جنینهایی با کیفیت عالی(400×)

4-3) نتایج بخش هیستوشیمیایی
در تحقیق حاضر در گروه كنترل ساختار بافتي بيضه، مجاري منيساز و اپيتليوم زاياي آن كاملاً منظم و طبيعي بود و تغييرات آتروفيك و دژنراتيو چنداني مشاهده نگرديد. در گروه سیکلوسپورینآ ساختار بافتی و سلولي بيضه دچار بي نظمي و تغييرات دژنراتيو گسترده شده بود و تغييراتي شامل آتروفي و بهم ريختگي مجاري منيساز، بينظمي در غشاء پايه مجاري همراه با جدا شدگي سلولهاي اسپرماتوگوني از آن قابل مشاهده بود . هم چنين در اپيتليوم منيساز با وجود ظاهر مطبق، طبقات سلولي داراي آرايشي نامنظم بوده و در بعضي از مجاري تودههاي هياليني حاوي هستههاي متعدد و كوچك در لومن قابل مشاهده بود. سلول هاي سرتولي نيز در اپيتليوم زايا به تعداد كم تر و اكثراً با موقعيت قاعدهاي و نزديك غشاء پايه قابل تشخيص بودند. گاهي مجاري منيساز در حيوانات تحت درمان با سيكلوسپورينآ فاقد لومن مركزي بودند كه احتمالاً به دليل غير فعال شدن سلولهاي سرتولي مي باشد. بافت هم بند بينابيني بيضه در گروه تحت درمان با سیکلوسپورینآ تقريباً همانند گروههاي ديگر حاوي تمام اجزاء و سلولها بود ولي از تراكم و يك نواختي آنها كاسته شده و حالت فيبروز و ادم قابل مشاهده بود. كپسول بيضه (تونيكا آلبوژينه آ) در اين گروه ظاهري شبيه گروههاي كنترل داشته ولي افزايشي در تراكم رشت هاي كلاژن نسبت به سلولها قابل مشاهده بود. بافت بيضه حيوانات گروههاي دریافتکننده عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک از لحاظ ساختار هيستومورفولوژيكي تا حدود زيادي شبيه گروههاي كنترل بود. بررسيهاي بافتشناسي بيضه حيوانات در گروه تحت درمان با سیکلوسپورین + عصاره هسته انگور و سیکلوسپورین + عصاره زالزالک نشان داد كه اكثر تغييرات تخريبي و بينظميهاي ايجاد شده توسط داروي سیکلوسپورینآ با تجويز عصاره هسته انگور و عصاره زالزالک برگشت و تعديل يافته بود. به طوري كه مجاري منيساز نمايي طبيعي داشته و اپي تليوم زايا نيز تا حدود زيادي سازمان يافتگي و حالت مطبق خود را بازيافته بود و بهم ريختگي كاهش يافته بود. غشاء پايه نيز تقريباً به وضعيت طبيعي خود نزديك شده بود. بافت هم بند بينابيني بيضه نيز درگروه تحت درمان با سیکلوسپورین + عصاره هسته انگور و سیکلوسپورین + عصاره زالزالک از لحاظ ساختار شبيه گروههاي كنترل بوده و سلولها، رشتهها و عروق خوني از يك تراكم و نظم نسبتاً طبيعي برخوردار بودند.
1-4-3) نتایج مربوط به رنگ آمیزی PAS:
این رنگ آمیزی جهت مشخص نمودن ذخایر کربوهیدراتها در رده سلولهای اسپرماتوژنز صورت گرفته است، نتایج حاصله مشخص کرد که میزان ذخایر کربوهیدراتها در گروههای دریافت کننده سیکلوسپورین روزهای 25 و 45 در ردیفهای اولیه سلولهای اسپرم ساز کاهش یافته و این کاهش در روز 45 بخصوص در لوله های اسپرمساز آسیب دیده و نزدیک به کپسول بیضه بسیار مشهود میباشد. اما در گروه سیکلوسپورین + هسته انگور یک افزایش در ذخایر کربوهیدرات در ردههای اولیه سلولهای اسپرماتوژنز (3 الی 4 ردیف اول رده اسپرماتوژنز) دیده میشود. همچنین در گروه دریافتکننده عصاره زالزالک نیز ذخایر کربوهیدراتی افزایش در ردیف های اول رده اسپرماتوژنز را نشان میدهند اما مطالعات ما مشخص نمود که این افزایش در ذخایر کربوهیدراتی در گروه دریافت کننده عصاره هسته انگور بخصوص در روز 45 افزایش چشمگیری را نشان میدهد. اما در این مطالعه مشخص گردید که در لولههای اسپرماتوژنز در 3 الی 4 ردیف به بعد ذخایر کربوهیدراتی در گروه رتهای دریافت کننده سیکلوسپورین افزایش یافته و این ذخایر در گروه سیکلوسپورین+ عصاره زالزالک و عصاره هسته انگور کاهش یافته

پایان نامه
Previous Entries منبع پایان نامه درمورد عصاره آبی، آنتی اکسیدانت، مورفومتری Next Entries دانلود پایان نامه با موضوع شبکه عصبی، الگوریتم ژنتیک، شبیه‌سازی