منبع پایان نامه ارشد درمورد محصولات لبنی، بیوتکنولوژی

دانلود پایان نامه ارشد

PIERRE و همکارانش در سال 1987 باکتریوفاژ لیزوژنیک 0448 لاکتوباسیلوس بولگاریکوس LT4 را برای تبدیل شدن به فاژ لیتیک توسط میتومایسین C و پرتویuv القاء کردند. هدف از این مطالعه بر هم کنش باکتریوفاز معتدل لاکتوباسیلوس بولگاریکوس 0448 با سویه های میزبان است. (55)
لاکتوباسیلوس دلبوریکی زیر گونه بولگاریکوس و استرپتوکوکوس ترموفیلوس دو باکتری مهم در صنایع لبنی هستند که به عنوان استارتر در کارخانه های ماست و پنیر به کار می روند. باکتریوفاژ هایی که این باکتری ها به آن ها حساس هستند میزبان را آلوده کرده و باعث شکست در فرایند تخمیر می شود و در نتیجه از نظر اقتصادی مقرون به صرفه نیستند. C.TUKEI و همکارانش 24 باکتریوفاژ ویرولانت لاکتوباسیلوس دلبوریکوس و 23 باکتریوفاژ ویرولانت استرپتوکوکوس ترموفیلوس را در سال 2003 از پنیر و ماست و نمونه های شیر خام جدا کردند. همه ی باکتریوفاژ ها از کارخانه ی پنیر و ماست در انکارا جدا شده است.(15)
2-3- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل ها:
Gevers D و همکارانش در سال 2000 به جداسازی و شناسایی باکتری های اسید لاکتیک مقاوم به تتراسایکلین در محصولات گوشتی بسته بندی شده پرداختند. در سال های اخیر زنجیره غذایی یکی از مسیرهای اصلی انتقال مقاومت آنتی بیوتیک بین انسان وحیوان است. هدف، بررسی مقاومت به تتراسایکلین (tetR) باکتری های اسید لاکتیک در محصولات گوشتی که با گاز اتمسفر بسته بندی شده اند که شامل سوسیس خشک، مرغ پخته، خوراک گوشت و همبرگر پخته شده می باشد.
فقط سوسیس خشک شده حاوی سطح بالایی از tetR است و 3 گونه ی لاکتوباسیلوس پلانتاروم، لاکتوباسیلوس ساکی و پدیوکوکوس پنتوسوس به تتراسایکلین مقاوم است.(33)
لاکتوباسیل ها مقاومت ذاتی به تتراسایکلین، ونکومایسین واریترومایسن دارند گرچه مقاومت به استرپتومایسین، کلیندامایسین، جنتامایسین، اگزاسیلین و لینکوزامید ها گزارش شده است. Ashraf, R و همکارانش در سال 2011 مقاومت آنتی بیوتیکی ارگانیسم های پروبیوتیک و امنیت آن ها را در محصولات لبنی بررسی کردند. در این مطالعه از روش دیسک دیفیوژن استفاده شده است و مقاومت انتی بیوتیکی 187 باکتری که از 55 محصول پروبیوتیکی اروپایی جدا شده مورد آزمایش قرار گرفته است که 79 درصد آن ها به کانامایسین مقاوم است و 65 درصد آن ها به ونکومایسین، 26 درصد به تتراسایکلین، 23 درصد به پنی سیلسین G، 16 درصد به اریترومایسین و 11 درصد به کلرامفنیکل مقاوم هستند. در کل 4/68 در صد از آن ها مقاومت چند گانه به آنتی بیوتیک دارند که مقاومت ان ها ذاتی است. (9)
GIOVANNA BLANDINO و همکارانش در سال 2008 به حساسیت آنتی بیوتیکی باکتری های جداشده از محصولات پروبیوتیکی در دسترس در ایتالیا پرداختند. هدف از این مطالعه تعیین حساسیت باکتری های جداشده از 10 محصول پروبیوتیکی در ایتالیا بود. حساسیت 15 سویه لاکتوباسیلوس،5 سویه استرپتوکوکوس سالیواریوس و ترموفیلوس،1 سویه انتروکوکوس فسیوم و 8 سویه بیفیدوباکتریوم در مقابل چندین گروه از عوامل آنتی باکتریال با روش E-Test مورد بررسی قرار گرفت. همه ی سویه های لاکتوباسیل به آمپی سیلین حساس است. مقاومت ذاتی به ونکومایسین در لاکتوباسیلوس سالیواریوس، لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوباسیلوس پاراکازئی اثبات شده است. مقاومت آتیپیک به اریترومایسین در سویه های لاکتوباسیلوس سالیواریوس گزارش شده است. مقاومت مشاهده شده در سویه های به کار برده در محصولات پروبیوتیک ایتالیا به نظر می رسد که ذاتی باشد به استثنای مقاومت به اریترومایسین در یک سویه لاکتوباسیلوس سالیواریوس.(35)
CHANG LIU و همکارانش در سال 2009 به شناسایی مقاومت آنتی بیوتیکی سویه های پروبیوتیک باکتری های اسید لاکتیک جداشده از سوپر مارکت و داروها پرداختند. حساسیت آنتی میکروبیال 41 سویه جداشده توسط روش دیسک دیفیوژن وETest بعد از شناسایی گونه ها مورد بررسی قرار گرفته است. پراکندگی مقاومت در گونه ها یافت شده است. همه سویه های جداشده به کلرامفیکل، تتراسایکلین، آمپی سیلین، آموکسی سیلین، باسیتراسین و اریترومایسین حساس هستند و میزان مقاومت در این آنتی بیوتیک ها نسبتا پایین است. در مقابل اغلب سویه ها به سیپروفلوکساسین، آمیکاسین، تری متوپریم/سولفومتوکسازول و جنتامایسین مقاوم هستند. مقاومت آنتی بیوتیک ها در گونه های مختلف سویه های پروبیوتیک وجود دارد. (16)
Sabine kaster و همکارانش در سال 2006 به بررسی الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی و شناسایی ژن های مقاوم استارتر کالچر ها و پروبیوتیک های به کار برده شده در غذا پرداختند. 200 سویه جداشده از 90 نمونه مختلف که توسط روش های مولکولی و متدها ی دیگر تیپ بندی شده است مورد بررسی قرار گرفته است. 74 سویه متعلق به جنس لاکتوباسیل، 33 نمونه استافیلوکوک، 6 نمونه بیفیدوباکتر و … می باشد. آنها مقاومت فنوتیپیک را برای 20 آنتی بیوتیک مختلف توسط روش دیسک دیفیوژن بررسی کردند. در 27 سویه جداشده مقاومت دیده شده است که ویژگی های جنس ها از قبیل مقاومت فوتیپی و شناسایی خصوصیات ژنتیکی توسط روش هیبریدیزیشن microarray تعیین شده است.
نتیجه این مطالعات شناسایی ژن مقاوم به تتراسایکلین (tet k) در 5 سویه استافیلوکوک جداشده از استارتر کالچر گوشت بوده است واین ژن در lactobacillus reuteri پلاسمیدی است و نیز ژن مقاومت لینکوزامید (lnu A) از لاکتوباسیلوس روتری جداشده است.(6)

فصل سوم
مواد و روش کار

3-1- دستگاه های مورد نیاز:
تجهیزات و لوازم معمول آزمایشگاه میکروبیولوژی به ویژه موارد زیر مورد نیاز است :
جدول3-1: دستگاه های مورد استفاده در تحقیق به همراه مدل آن ها
دستگاه
مدل
اسپکتروفوتومتر
JENWAY 6315
pHمتر
pH/mV/TEMP Meter P25
اتوکلاو

انکوباتور℃ 30
MEMERT
انکوباتور℃ 37
MEMERT
هود میکروبیولوژیکی
JAL-TAJHIZ PRODUCTOIN
فریزر
GFL
میکروسکوپ نوری
ZEISS
فریز داریر
LYOVAC GT3
سانتریفوژ
SAHAND.T.A
حمام آب یا گرمخانه

ترازو
ACCULAB
اون (فور)
Shimifann LABOVEN
ورتکس
Vortex Mixer (VELP)
یخچال
PHILVER , TROPCAL

3-2- لوازم مورد نیاز:
– پلیت های استریل یکبار مصرف، پلیت شیشه ای
– جار بی هوازی
– ارلن
– فالکون
– پیپت مدرج استریل
– لوله آزمایش
– مزور
– سمپلر با حجم 1000-100، 100-10، 10-1 ماکرولیتر
– میکروتیوپ
– پنس فلزی
– خط کش
– لامپ uv
-کولیس

3-3- مواد مورد نیاز:
جدول3-2: مواد مورد نیاز در مطالعه به همراه نام کشور سازنده
ماده
شرکت
Mitomycin C
Sigma
MRS broth
Merck آلمان
Skim Milk
Merck آلمان
Agar
Merck آلمان
دیسک آنتی بیوتیک
پادتن طب
شیر کاله
بازارهای داخلی ایران
Peptone
Merck آلمان
Meat beef
Merck آلمان
Glucose
Merck آلمان
CaCl2
Merck آلمان
K2Hpo4, KH2po4
Merck آلمان
NaOH
Merck آلمان
Yeast Extract
Merck آلمان
Dipotasiom Hydrogen phosphate
Merck آلمان
Twen 80
Merck آلمان
di Amounium hydrogen Citrate
Merck آلمان
Sodium acetate
Merck آلمان
Magnesium sulfate
Merck آلمان
Mangenes
Merck آلمان
سر سمپلر آبی و زرد و سواپ استریل

3-4- سویه های میکروبی مورد مطالعه:
این تحقیق بر روی 65 گونه ی باکتری های لاکتوباسیل جداسازی شده از مناطق مختلف بومی ایران که در سازمان پژوهش های علمی صنعتی ایران گروه بیوتکنولوژی نگه داری شده، انجام شده است.
3-4-2- آماده سازي محيط هاي كشت
محيط هاي كشت مورد استفاده جهت كشت فاژ و حساسیت انتی بیوتیکی عبارتند از:
3-4-2-1- محيط كشت MRS آگار
برای تهیه یک لیتر از این محیط کشت 2/52 گرم محیط کشت MRS ، 15 گرم آگار را در یک لیتر آب جوشیده حل کرده و حرارت داده می شود تا کاملا حل و شفاف شود ( برای تست فاژ اضافه کردن CaCl2 برای چسبندگی فاژ به سویه ی باکتری لازم است ) سپس در دمای 121 درجه سانتی گراد وفشار 6/1 اتمسفر به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گردید.
برای اندازه گیری میزان حساسیت و مقاومت لاکتوباسیل ها نسبت به آنتی بیوتیک ها با استفاده از روش دیسک گذاری از محیط کشت MRS استفاده می شود. تهیه ی یک لیتر از این محیط کشت بدین صورت است:
Pepton= 10 gr
Meat beaf=8 gr
Yeast Extract= 4gr
Dipotasiomm Hydrogen Phosphate= 2gr
Glucose= 20gr
Tween 80=1ml
Diamonium Hydrogen Citrate= 2gr
Sodium acetate= 5gr
Magnesium sulfate= 0.2 gr
Manganes= 0.04 gr
3-4-2-2- محيط كشت نرم MRS اگار
برای تهیه یک لیتر از این محیط کشت 2/52 گرم از محیط کشتMRS با 6 گرم آگار را در يك ليتر آب مقطر جوشيده حل كرده و حرارت داده شود تا کاملا حل و شفاف گردد و سپس در دماي ۱۲۱ درجه سانتي گراد و فشار 6/1 اتمسفر به مدت ۱۵ دقيقه اتوكلاو گرديد.
3-4-2-3- محیط کشت MRS مایع
برای تهیه یک لیتر از این محیط کشت 2/52 گرم از محیط کشت MRS را دز یک لیتر آب مقطر حل کرده و بر روی هیتر گذاشته تا کاملا حل و شفاف گردد و سپس در دمای 121 درجه سانتی گراد و فشار 6/1 اتمسفر به مدت 15 دقیقه اتوکلاو گردد.
3-5- کشت و آزمایشات تعیین هویت باکتری ها
ایزوله های مورد بررسی در این مطالعه که قبلا تحت عنوان گونه های لاکتوباسیل جداسازی شده بودند، در دمای 80- درجه سانتی گراد نگه داری شده اند به منظور انجام این تحقیق از باکتری های مورد نظر با استفاده از محیط کشت MRS آگار کشت مجدد ( ساب کالچر) انجام داده تا کلنی تک بدست آید بعد از کلنی تک به صورت متوالی کشت انجام داده تا از خالص بودن باکتری اطمینان حاصل شود و سپس رنگ آمیزی شده و با میکروسکوپ نوری مشاهده شود.

3-6- سنجش فاژ
3-6-1- روش دولایه ای پلاک
در این روش فاژها توسط میتومایسین C القا می گردد ( فاز لیزوژنیک به فاز لیتیک فاژ تبدیل می شود). ابتدا 10 میلی لیتر محیط کشت MRS آگار (میزان آگار 5/1 درصد می باشد) درون پلیت ها ریخته و پلیت ها به صورت آماده می باشد همانطور که قبلا ذکر شد. لوله هایی که حاوی 5/4 میلی لیتر محیط کشت نرم MRS آگار ( میزان آگار 6/0 درصد می باشد) می باشند را به دمای 40 درجه سانتی گراد رسانده سپس 100میکرولیتر (0.1 ml) CaCl2 10Mm و 5/0 میلی لیتر میتومایسین C (0/2 mgr/ml ) و 1/0 میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری به آن تلقیح کرده لازم به ذکر است که همه ی این موارد باید به دمای 40 درجه سانتی گراد رسیده باشند. لوله هایی که شامل تمام این محتویات می باشد را در سطح پلیت های MRS آگار پخش کرده به طوریکه تمام سطح را بپوشاند. سپس این پلیت ها را درون جار بی هوازی و داخل انکوباتور قرار داده و پس از 24 ساعت پلاک ها مشاهده می شوند.
3-6-2- مشاهده پلاک توسط القاء با پرتوUV
5/0-1/0میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری را در پلیت ریخته ( براساس میزان کدورت باکتری) و پلیت ها را در معرض تابش لامپ uv( 280 nm) قرار می دهیم. سپس1/0 میلی لیتر CaCl2 (( 10Mm و 5/9 میلی لیتر محیط کشت نرم MRS را در پلیت پخش کرده و پلیت ها را به صورت دورانی یا زیگزاک حرکت می دهیم تا به طور یکنواخت پخش شوند. پلیت ها را دورن جار بی هوازی و دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت قرار می دهیم. سپس حضور یا فقدان پلاک را گزارش می کنیم.

شکل3-1 – پلاک
3-6-3- آزمون Heap and Lawrence
تست فعالیت استارتر کالچر 66 توسط هیپ و لورنس شرح داده شده است. لوله های حاوی 5 میلی لیتر شیر پاستوریزه ( شیر کم چرب کاله) به مدت یک ساعت در80 درجه سانتی گراد بخار داده شوند و سپس دمای آن را به 30 درجه سانتی گراد می رسانیم. 1/0 میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری را به لوله های حاوی شیر تلقیح کرده و سپس آن ها را گرماگذاری می کنیم. پروفایل انکوباسیون بدین صورت می باشد: 100 دقیقه دمای ℃30 ، 190 دقیقه دمای ℃ 40 و 100 دقیقه دمای ℃ 30. بعد از گرماگذاری PH نهایی بررسی می شود. اگر بعد از گرماگذاری PH به زیر 6 تغییر نیابد و اسید تولید نشود به معنی حضور فاژ است. (70،37،36)

3-7- سنجش

پایان نامه
Previous Entries منبع پایان نامه ارشد درمورد مورفولوژی، اتحادیه اروپا، محصولات لبنی Next Entries منبع پایان نامه ارشد درمورد سه مرحله ای، بیوتکنولوژی