منبع مقاله درباره نمونه برداری، استان خراسان

دانلود پایان نامه ارشد

3_4_15_2_کیمیولومینسانس169
در اين تحقيق از روش اول با استفاده از NBT و BCIP صورت گرفت.
3_4_15_1_شناسائی به روش کلریمتری با NBT و BCIP
3_4_15_1_1_آماده سازی محلول های لازم برای شستشو و شناسایی
• محلول شستشوی 2 برابر:170
برای تهیه 2x SSC ابتدا مقدار 10میلی لیتر از 20x SSC به90 میلی لیتر آب مقطر و سپس 1 گرم پودر SDS به آن اضافه شد.
• محلول شستشوی 1/0برابر:171
برای تهیه 0.1x SSC ابتدا 5 میلی لیتر از 2x SSC به95 میلی لیتر آب مقطر و سپس 1 گرم پودر SDS به ان اضافه شد.
• بافر شستشو یک برابر:172
6/11 مالئیک اسید به همراه 78/8 گرم کلرید سدیم خالص در یک لیترآب مقطر به خوبی حل شد. سپس 3 میلی لیتر توئین بیست به آن اضافه و pH محلول روی 5/7 تنظیم گردید.
• Blocking solution
Cc10 از محلول Blocking از کیت را با cc9 اسید مالئیک و cc 81 آب مقطر مخلوط شد.
• بافر شناسائی (آشکار ساز)173:
76 /15 گرم تریس هیدروکلراید (Tris-HCl) را به همراه 85/5 گرم کلرید سدیم خالص در یک ارلن ریخته و یک لیتر آب مقطر به آن اضافه و سپس pH محلول روی 5/9 تنظیم شد.
پس از شستشوهاي لازم، مراحل زير انجام میگرفت.
1- غشاء در محلول بافر شستشو174 به مدت 1 دقيقه قرار میگرفت.
2- غشاء در محلول بلوکینگ یک برابر به مدت 60-30 دقيقه در دماي اتاق قرار داده میشد.
3- قطعه Fab آنتی دیگوکسیژنین آنتی بادی کنژوگه با آلکالاین فسفاتاز175 در محلول بلوکینگ به نسبت 1:5000 رقيق میشد. سپس محلول رقيق شده آنتي بادي روی غشاء ریخته و به مدت 30 دقيقه در دماي اتاق قرار داده میشد به ترتيبي كه محلول رقيق شده آنتي بادي تمام سطح غشاء را بپوشاند.
4- غشاء دو بار در بافر شستشو به مدت 15 دقيقه قرار میگرفت. اين شستشو باعث ميشد كه آنتيباديهاي باند نشده از سطح غشاء شسته شوند.
5- غشاء در بافر شناسائی176 به مدت 2 دقيقه در دماي اتاق قرار میگرفت.
45 ميكروليتر محلولNBT و 35 ميكروليتر محلول BCIP در 15 ميليليتر بافر شناسائی مخلوط میشد (این محلول همیشه به طور تازه مصرف میگردید). محلول حاصل که بنام محلول رنگ کننده سوبسترا177 خوانده میشود، روي غشاء ريخته و در تاريكي قرار داده میشد تا واكنش صورت پذیرد (چند دقيقه تا 16 ساعت). همچنین از هر گونه لرزش و تكان شدید در طي پيشرفت واكنش اجتناب میشد.
6- غشاء در بافر TE به مدت 15 دقیقه شستشو میشد و پس از خشک شدن، عکس تهیه می گردید و بین دو برگ طلق شفاف نگهداری می شد.
3_4_16_ دات بلاتینگ
هدف از انجام اين مرحله، تعيين حجم مناسب پروب انتخاب شده در مرحله قبل (A، B، C و یا D) براي عمل هیبریداسیون با DNA نمونههای تحت آزمایش است. برای اینکار مقدار 2 ميكروليتر DNA ژنومي مايكوباكتريوم بویس ب.ث.ژ داخل یک میکروتیوب ريخته و به مدت 10 دقيقه جوشانیده میشد تا دناتوره گردد. سپس بلافاصله روي يخ قرار میگرفت. در ادامه يك ميكروليتر آن برداشته و روي قطعه كوچك ممبرين قرار داده و براي عمل تثبيت به مدت 30 دقيقه در Cº 120 قرار داده میشد. پس از زمان فوق غشاء برای پریهیبریداسیون در محلول هیبریداسیون در دماي Cº 65 به مدت 4-2 ساعت قرار میگرفت. سپس مرحله هیبریداسیون (با رقتهای متفاوتی از پروب درون محلول هیبریداسیون) به مدت یک شب انجام میگرفت و پس از شستشوهاي لازم (مشابه روش ه-14-1) شناسائی صورت میگرفت (تصویر 3-13) و با توجه به رنگ حاصل، رقت مناسب براي عمل هیبریداسیون انتخاب میگرديد.

تصویر 3-13: دات بلات PGRS (راست) و DR (چپ)
3_4_17_ پری هیبریداسیون و هیبریداسیون با پروب نشاندار با دیگوکسیژنین
3_4_17_1_مرحله پريهيبريدیزاسيون
طرز تهیه محلول پری هیبریداسیون (Prehybridization): 1/0 گرم ان لوریل سارکوزین و 02/0 گرم پودر SDS در 50 میلیلیتر آب مقطر به خوبی حل میگردید و سپس یک گرم پودر بلوکینگ در محلول فوق ریخته و روی مگنت هات پلیت در دمای Cº33 به مدت 20 دقیقه قرار میگرفت و طی این مدت به تدریج آب مقطر تا حجم نهائی 100 میلیلیتر به آن اضافه میگردید تا مخلوط شیری رنگ یکنواخت به دست آید.
مرحله پری هیبریداسیون، غشاء را با پوشاندن قسمتهاي غير اختصاصي متصل شونده با اسيد نوكلئيك، براي مرحله هيبريداسيون آماده ميسازد و بدين ترتيب رنگ تیره زمينه178 به كمترين ميزان خود ميرسد. روش كار به این صورت است که غشاء بدون تا خوردگی لوله گردیده و داخل لوله مخصوص آون هیبریداسیون179 قرار میگرفت و محلول پریهيبريدیزاسيون180 داخل لوله ریخته میشد (حجم محلول معادل ml20 به ازاء هر 100 سانتی متر مربع از سطح غشاء ميباشد). سپس لوله داخل دستگاه آون هیبریداسیون گذاشته و به مدت 4 ساعت در دمای 65 درجه سانتی گراد نگهداری می گردید.
3_4_17_2_ مرحله هيبريداسيون181
طرز تهیه محلول هیبریداسیون (Hybridization): مقدار 50 میکرولیتر از نشانگر لیبل شده با دیگوکسیژنین(Dig-lable marker) در 30 میلیلیتر محلول پریهیبریداسیون ریخته و به خوبی مخلوط میگردید.
پس از مرحله پریهیبریداسیون، محلول پریهيبريداسيون از لوله آون هیبریداسیون خارج و مراحل زیر به ترتیب اجرا میگردید.
1- محلول هيبريداسيون که حاوی پروب PGRS لیبل شده با دیگوکسیژنین بود، به همان مقداری که در مرحله قبل، محلول پریهیبریداسیون به کار رفته بود، به درون لوله ريخته میشد. پروب ليبل شده با غلظت مناسب و مقدار مناسب و با توجه به حجم يا به عبارتي مساحت ممبرين با سمپلر برداشته و به محلول هيبريداسيون اضافه میشد (در این تحقیق برای 50 میلیلیتر بافر هیبریداسیون 10 میکرولیتر پروب استفاده میشد).
2- دماي بهينه هيبريداسيون اختصاصي براي پروب تنظيم میشد كه بستگي به طول پروب و اندازه ترادفي كه با ترادف هدف همتائي (همولوژي) دارد، تعيين ميگردد. در این تحقیق مرحله هيبريداسيون به مدت یک شب در دماي ºC65 انجام میگرفت. سپس غشاء به صورت زیر شسته میشد تا پروبهای باند نشده خارج گردند، در غير اين صورت سیاهی زمينه بسيار بالا خواهد بود.
3- دو بار شستشو با محلول شستشوی دو برابر و هر بار به مدت 5 دقيقه در دماي اتاق انجام میشد.
4- دوبار شستشو با محلول شستشوی 1/0 برابر و هر بار به مدت 15 دقيقه در دماي ºC55 (داخل همان لولهها و دستگاه آون هیبریداسیون) انجام میپذیرفت.
5- یکبار شستشو با بافر شستشوی یک برابر به مدت يك دقيقه در حرارت اتاق انجام شد و غشاء شناسائی میگردید.

فصل چهارم
نتایج و بحث

4- نتایج و بحث
4-1- نمونه برداری
با اجرای طرح(تحقیق) جداسازی و تعیین هویت باکتریهای عضو کمپلکس مایکوباکتریومتوبرکلوزیس از گاوهای توبرکولین مثبت دامداریهای آلوده در موسسه رازی علاوه بر اینکه کارآیی روش آزمایش توبرکولیناسیون مورد استفاده در برنامه مبارزه با سل گاوی مورد ارزیابی بلکه مشخص می شود چه سویه ها و گونه های مایکوباکتریومی در جمیعت گاو کشور در گردش است. پس از آزمایش توبرکولین گاوهای راکتور مثبت جداشده و پس از اعزام به کشتارگاه عقده لنفاوی مورد نظر جداسازی و به آزمایشگاه موسسه ارسال شد. در این بررسی از 65 نمونه عقدههای لنفاوی واصله در سالهای1388 الی 1390 تعداد 12 مورد مایکوباکتریوم مثبت جدا گردید. تست های تعیین هویت بر روی این تعداد انجام پذیرفت. تست نیاسین تمام نمونهها منفی بود و تمام مایکوباکتریوم ها در محیط لوانشتین جانسون پیرواتدار، بهتر از گلیسریندار رشد مینمودند. همگی بدون رنگدانه، نیترات ردوکتاز، کاتالاز و کورد فاکتور منفی بودند و از همه مهمتر هیچکدام از نمونه ها در محیط 2-تیوفن کربوکسیلیک هیدرازید اسید رشد نکردند. با توجه به یافتههای فوق تمامی مایکوباکتریومهای جدا شده، مایکوباکتریوم بویس تشخیص داده شدند. با توجه به نتایج مثبت واکنش PCR، تعلق داشتن همه جدایه ها به گروه کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس تائید گردید.
از تعداد 65 نمونه جدا شده، تعداد 8نمونه برای RFLP مناسب تشخیص داده شد، که از این 8 نمونه و یک سویه استاندارد مایکوباکتریوم بویسAN5) به عنوان شاهد استاندارد برای مقایسه)، جهت انگشت نگاری ژنومی مایکوباکتریوم بویس استان خراسان مورد بررسی قرار گرفت. در انگشت نگاری DNA نمونهها مطابق دستورالعمل WHO از آنزیم(Pvu II) و دو پروب PGRS و DR استفاده گردید. آنالیز داده های RFLP با استفاده از نرم افزار Gel Campair صورت گرفت و پس از مقایسه با اطلاعات موجود در سالهای قبل آنالیز شده، در الگوی ژنتیکی حاصل از هیبرید سازی با PGRS از 8 سویه مورد مطالعه تعداد 2 الگوی مختلف و پس از هیبرید سازی با DR تعداد 3 الگوی مختلف به دست آمد.
4-2- بررسي كشت لوله هاي لونشتاين– جانسون (LJ)
حداقل1-2 ماه پس از کشت و انکوباسیون نمونه ها، سطح تمام محیط ها از لحاظ وجود کلنی های مایکوباکتریوم مورد بررسی قرار گرفت. که کلنی هایی با ظاهر گل کلمی و رنگ کرم بر روی محیط ها دیده شد. که در مرحله بعد از این کلنی ها گسترش تهیه و رنگ آمیزی گردید. باسیل های اسید فست در رنگ آمیزی فلئوروکروم مشاهده و با ذیل نلسون تایید گردید. که در مجموع 12 جدایه اسیدفست بدست آمد.

تصویر4-1- لوله هاي لونشتاين– جانسون: کلنی های کرم رنگ با ظاهر گل کلمی
4-3- آزمون وجود IS6110
اين آزمون به عنوان يك تست مكمل آزمون RV0577 شناخته ميشود. موجوديت ماركر ژنتيكي IS6110در ژنوم تمام اعضاي كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس پيش از اين نشان داده شده است اگرچه جدايههاي فاقد اين ماركر نيز در برخي موارد گزارش ميگردند. در آزمون حاضر توليد يك قطعه كوچك به طول bp245 كه معرف قسمتي از اين ماركر ميباشد به عنوان نشانهاي از وجود ماركر مذكور (IS6110) و در نتيجه تعلق جدايه تحت آزمون به كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس ميباشد.
4-3-1- نتايج واكنش PCR
تعداد12 سویه به دليل داشتنDNA مناسب كه كيفيت و كميت آنها با دستگاه نانودراپ و ژل آگارز مورد تائيد قرارگرفته بود جهت PCR-IS611 با استفاده از پرايمرهایINS-1، INS-2 و هضم آنزيمي RFLP مورد استفاده قرار گرفت. 12 سویه در اين آزمون پس از الكتروفورز نمودن محصول PCR برروي ژل آگارز و حضور باند bp245 در تمام نمونه ها تائيد شد و در كنار این سویه ها از مايكوباكتريوم بويسAN5 به عنوان كنترل مثبت استفاده گرديد در ضمن از ماركرbp100براي مشخص شدن باندها استفاده گرديد(شكل4-2) كه بدين ترتيب هويت آنها به عنوان اعضاي كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس مورد تایید قرار گرفت.
INS-1 (631-650) 5’(CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC )3’
INS-2 (856-875) 5’(GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA) 3’

تصویر4-2- الكتروفورزمحصول PCR برای سکانس 245 جفت بازی IS6110-ستونM: سایز مارکر شرکت رش آلمان
4-4-بررسی کمیت DNA استخراج شده برای هضم آنزیمی (RFLP)
غلظت DNA به دست آمده ی تمام نمونه ها پس از استخراج، بوسیله دستگاه نانودراپ برحسب نانو گرم بر میکرو لیتر محاسبه شد. هم چنین میزان خلوص DNAاستخراج شده بر اساس نسبت طول موج دریافتی در 260نانومتر به 280 نانومتر و260 نانومتر به 230 نانو متر اندازه گیری شد. نسبت اول، نسبت جذب نوری DNA به پروتئین و نسبت دوم، نسبت جذب نوری DNA به ناخالصی هایی شیمیایی است. این نسبت ها بصورت اعدادی توسط دستگاه نشان داده می شوند. همچنین دستگاه بر این اساس نموداری نیز ترسیم می کند. در این تحقیق پس از بررسی تمامی نمونه ها، نمونه هایی انتخاب شدند که غلظت DNA آنها بین 1500-700 نانو گرم بر میکرو لیتر و نمودار طول موج آنها دارای یک قله در قسمت 260 نانومتر بود. غلظت های بالاتر از این محدوده بوسیله رقیق کردن آنها به این حد رسید.

تصویر(4_3): نمودار طول موج DNA نمونه و محاسبات ضروری برای آزمایش های مولکولی
4-5- بررسیDNAاستخراج شده
در این تحقیق، پس از استخراج ژنوم نمونه ها، مقدار 4 میکرو لیتر از DNA

پایان نامه
Previous Entries منابع پایان نامه درباره علمای شیعه، منابع تاریخی، منابع اسلامی، تاریخ زندگانی Next Entries منبع مقاله درباره سازمان بهداشت جهانی، تشخیص بیماری، استان خراسان