منبع مقاله درباره میکروتیوب، میگرفت.، موئینهای، SSC

دانلود پایان نامه ارشد

Denaturing
10گرم NaOH را با 87.75 گرم NaCl مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم 500cc رسانده شد.
در این تکنیک انتقال الکتروفورتیکی قطعات جدا شده DNA (با شارژ منفی به خاطر داشتن باندهای فسفات) به یک غشاء نایلونی با شارژ مثبت، برای استفاده در عملیات هیبریداسیون با استفاده از پروبهای لیبل شده با دیگوکسژنین صورت میپذیرد. متعاقب آن در مراحل بعدی آشکار سازی و شناسایی پروبهای هیبرید شده با استفاده از آنتیبادی دیگوکسیژنین کنژوگه با آنزیم آلکالاین فسفاتاز(AP)158 و سوبسترای NBT و BCIP انجام میگیرد.
ساترن بلاتینگ به دو روش “انتقال موئینهای159 ” و “انتقال توسط خلاء160 ” انجام پذیر است. روش انتقال توسط خلاء بسیار سریعتر از انتقال موئینهای است (حدود 2-1 ساعت) ولی روش موئینهای نیاز به تجهیزات کمتری داشته و راحت تر است و کیفیت انتقال نیز مناسبتر می باشد. در این تحقیق از روش موئینه ای استفاده شد
قبل از بلاتینگ برای انتقال مناسب یکنواخت DNA به غشاء، ژل تحت پرتو UV و عمل آوری با HCl قرار میگیرد. عملآوری با اسید اجازه میدهد تا دپیورینیشن161 نسبی ایجاد گردد. محلهای دپیورینه شده در طی عملآوری با قلیا برش خورده و اینکار موجب میگردد تا قطعات DNA از یکدیگر مجزا (واسرشت)162 گردند تا DNA تک رشتهای پس از انتقال به غشاء برای عمل هیبرید شدن با پروب آماده گردد.
در روش انتقال موئینهای، مولكولهاي DNAاي كه روي ژل اگارز قرار داشتند با خاصيت موئينگي جریان بافر حركت نموده و بر روي غشاء نایلونی جاذبي كه داراي بار الكتريكي مثبت بوده و روی سطح جامد تکیهگاه بلافاصله پس از ژل قرار گرفته، رسوب مینماید. ژل اگارز براي مطالعه نوارهاي DNA كه حاوي اطلاعات هستند بسيار ناپايدار است. در اين روش جریان مایع به وسیله فعالیت موئینهای غشاءهای جاذبي که روی سطح ژل و غشاء نایلونی روی آن قرار ميدهند، ایجاد شده و در ادامه محلولهايي كه زير سطح ژل قرار دارند در درون ژل و غشاء حركت كرده و به وسيله كاغذهاي جاذب حولهای خشک روي غشاء، جذب ميشوند. در پي حركت اين مايعات، قطعات DNA توسط جریان مایع حمل و از ژل خارج شده و عیناً به غشاء، دقيقاً در محلهائي كه DNA بر روی ژل قرار دارد، متصل ميگردند. هدف اين روش تشكيل تصوير رونوشتي از محتويات ژل اگارز روي سطح غشاء با روش مستقيم و مرتب است. سپس DNA انتقال يافته روي غشاء با روشهاي مختلفي كه DNA را به طور كووالاني به غشاء متصل مينماید، تثبيت ميشود. چنين DNAي تثبيت شدهاي در محل خود پايدار است و ميتواند با پروب و يا ساير مواد واكنش داشته باشد. نتیجه نهائی این است که DNA قابل واكنش روی غشاء، از نظر اطلاعات مكاني دقيقا مانند DNAي روي ژل اصلي است.
لازم به ذکر است که بار DNA به دلیل وجود فسفات منفی بوده و غشاء نایلونی مورد استفاده حتماً باید دارای شارژ مثبت باشد و این اختلاف بار نه تنها عمل انتقال را تسهیل نموده بلکه برای انتقال مناسب، بسیار ضروری است.
3_4_12_2_ عمل آوری ژل قبل از بلاتینگ
1- ژل به مدت 5 دقیقه در معرض پرتو UV روی دستگاه ترانس لومیناتور و یا ژل داک قرار داده میشد. خاصیت فلورسنت DNA تقریباً در این قسمت ناپدید میشد.
2- سینی محتوی ژل به مدت 10-5 دقیقه در 500 میلی لیتر اسید کلریدریک 25/0 مولار قرار میگرفت تا عمل دپیورینه شدن صورت پذیرد.
3- دو بار ژل به مدت کوتاه (هر بار حدود 10 ثانیه) با آب مقطر شستشو داده میشد.
4- برای واسرشت (دناتوره شدن) DNA دو بار سینی محتوی ژل هر بار به مدت 20-15 دقیقه در 500 میلی لیتر سود 4/0 مولار قرار میگرفت و سپس مانند مرحله قبل دو بار شستشو صورت میپذیرفت.
5- دو بار ژل به مدت 15 دقیقه در محلول خنثی کننده قرار داده میشد.
6- یک دقیقه ژل در بافر 2x SSC قرار میگرفت.
از این قسمت به بعد را می توان از روش خلاء یا روش موئینهای استفاده نمود، که در این تحقیق
تنها از روش موئینهای استفاده شد.
3_4_12_3_ بلاتینگ به وسیله روش موئینهای
روش زیر ساخت بلات را نشان میدهد (تصویر 3-12)
1- یک نگهدارنده ژل (در این تحقیق از سینی تانک الکتروفورز که ژل روی آن تهیه شده بود، به صورت وارونه استفاده میگردید) که در یک سینی پلاستیکی به طور وارونه قرار میگرفت.
2- سینی پلاستیکی تا زیر صفحه نگاهدارنده ژل از بافر 20x SSC پر میگردید.
3- نگهدارنده ژل با یک قطعه کاغذ واتمن که قبلا به دقت با 20x SSC خیسانده شده بود، به اندازه عرض سینی (عرض ژل) و مقداری بلندتر از طول سینی به نحوی که دو انتهای آن درون بافر قرار بگیرد، پوشانیده میشد. دقت میگردید تا تمام حبابها به وسیله غلتاندن پی پت بر روی کاغذ، خارج گردد.
4- ژل به طور وارونه روی کاغذ واتمن بنحوی قرار میگرفت که دقیقاً روی نگهدارنده ژل تنظیم گردد.
5- در یک سمت گوشه ژل با بریدن قطعه بسیار کوچک از آن علامت زده میشد تا بتوان نقطه شروع ژل و اولین و آخرین خط را شناسائی نمود.
6- یک غشاء163 نیتروسلولز به اندازه ژل بریده و یک کد بالای غشاء نوشته میشد.
7- غشاء به مدت 2-1 دقیقه در آب مقطر دیونیزه و سپس در 20x SSC قرار میگرفت.
8- غشاء به دقت بر روی ژل گذاشته و وضعیت آن دقیقاً روی ژل تنظیم میگردید. دقت میگردید تا تمام حبابها به وسیله غلتاندن پیپت بر روی کاغذ خارج گردد.
9- تمام چهار طرف فیلتر (یا بین ژل و فیلتر) با پارافیلم پوشانیده میشد.
اینکار باعث ایجاد حالت عایق بین ژل و غشاء میگردید و موجب میشد تا از حرکت بافر از لبههای ژل به طرف بالا جلوگیری شود و حتما بافر از درون ژل عبور کند.
10- سپس 6 قطعه کاغذ واتمن نازک و بدنبال آن 6 قطعه کاغذ واتمن کلفت روی فیلتر قرار میگرفت.
11- نهایتاً یک دسته دستمال کاغذی به ارتفاع 15 سانتیمتر (کاغذ کار یا کاغذ با جذب بالا) و یک وزنه یک کیلوگرمی روی یک صفحه شیشهای در بالای برج بلات164 قرار میگرفت.
در طول مراحل مختلف ساترن بلاتینگ، همیشه از تشکیل حباب هوا اجتناب میشد و همچنین
فیلتر Hybond N-plus و تمام کاغذهای واتمن و ژل هم اندازه بریده میشد.
12- در صورت نیاز، به بافر 20x SSC سینی افزوده میشد تا بافر به پائین صفحه نگهدارنده ژل برسد و ساترن بلاتینگ به مدت 4 تا 6 ساعت (در این تحقیق یک شب) انجام میگرفت. پس از طی زمان فوق، ژل کاملا نازک شده بود.

تصویر 3-12: راهنمای ترتیب قرار گرفتن کاغذها، ژل، غشاء نیتروسلولزی و وزنه در روش موئینهای (ژل/فیلتر)
3_4_12_3_عمل آوری غشاء بعد از بلاتینگ
1- بلات برای دو دقیقه روی یک فیلتر واتمن که با سود 4/0 نرمال اشباع شده بود، قرار میگرفت.
2- غشاء به مدت دو دقیقه با 5x SSC شسته میشد.
در این مرحله بلات را میتوان مستقیماً برای عملیات هیبریداسیون استفاده نمود و یا در پلاستیک سر بسته در شرایط مرطوب نگهداری کرد.
3- برای حصول اطمینان از انتقال کامل DNA به فیلتر، پس از بلاتینگ به مدت 1 یا 2 ساعت ژل در بافر الکتروفورز با 5/0 میکروگرم در میلیلیتر اتیدیوم بروماید قرار داده و حضور DNA بر روی ژل ردیابی میگردید. در صورت انتقال کامل هیچ اثری از DNA بر روی ژل باقی نمیماند و یا تنها اثر بسیار ناچیزی از آن مشهود بود اگر انتقال به طور کامل انجام شده باشد نباید هیچ و یا تنها میزان کمی DNA روی ژل باقی بماند.
• نکاتی که در ساترن بلاتینگ مورد توجه قرار میگرفت
• در طی انکوباسیون با اسید کلریدریک یا سود، ژل باید به طور کامل با محلول پوشیده میشد.
• هنگام حمل غشاء ها همیشه از دستکش استفاده میشد. چربیها و آنزیم DNase موجود در پوست، میتواند موجب انتقال آرتیفکت (اثر مصنوعی) گردد.
• از ایجاد حبابهای هوا بین ژل و فیلترها جلوگیری میشد.
• اگر ژل با آگارز به خوبی آب بندی نشود، بافر به سرعت از بین آنها نشت کرده و بلاتینگ در این حالت به خوبی انجام نمیشود.
• انتقال در ژلهای نازکتر میتواند بسیار سریعتر از ژلهای ضخیم باشد. به طور مشابه انتقال قطعات کوچکتر DNA بسیار سریعتر از قطعات بزرگتر میباشد( در این تحقیق از ژل ضخیم استفاده شد).
3_4_13_ تثبيت DNA بر روی غشاء165
به سه روش میتوان DNA را بر روي غشاء ثابت نمود:
1-با تاباندن پرتو اولترا ویوله بر روی غشاء
2- قرار دادن غشاء در Cº 120 به مدت 30 دقيقه
3-قرار دادن غشاء در Cº 80 به مدت 2 ساعت
در این تحقیق از روش دوم یعنی قرار دادن غشاء در فور120 درجه به مدت 30 دقيقه استفاده میشد. غشاء آماده شده براي مرحله قبل از هیبریداسیون (پری هیبریداسیون)166 را ميتوان در يك پلاستيك خشك در دماي Cº 4 تا موقع مصرف نگهداري نمود.
3_4_14_تهیه پروبهاي هيبريداسيون، مک هیبریداسیون
كاوشگرها (پروبها) قطعهای از ملكولهاي تك رشتهاي DNA يا RNA هستند كه به روشهای مختلف نشاندار (لیبل) میشوند و همین قطعات نشان دار شده برای بررسی هیبریداسیون به عنوان پروب به کار میروند تا با توالی نوكلئوتيدي مكمل خود از DNAي هدف تحت شرائط ويژه آزمايشگاهی هيبريد شوند. سپس نواحي هيبريد شده به طرق مختلف رديابي شده تا تفاوت سويهها به لحاظ جايگزيني پروب در نواحي خاص كروموزوم نمايان گردد. به طور كلی پروبها به 3 دسته بزرگ تقسيم ميگردند که عبارتند از: اوليگوپروبها (مانند PGRS و DR)، PCR پروبها (مانند IS6110 و IS1081) و RNA پروبها. در اين مطالعه از 2 اولیگوپروب PGRS و DR استفاده شد .
3_4_14_1_پروب (Polymorphic GC – rich Repetitive Sequence) PGRS
اوليگو نوكلئوئيد PGRS لیبل شده با دیگوکسیژنین که در این تحقیق استفاده شد، با سکانس زیر به شرکت طوبی نگین سفارش داده شد و از کمپانی DNA Technology A/S دانمارک تهیه گردید. میکروتیوب حاوی پروب که ليوفيليزه شده بود با توجه به غلظت آن با 500 ميكروليتر آب مقطر استريل به صورت محلول در آمد تا غلظت نهائی آن به Pmol/µl 158/0 رسید. سپس پروب حاضر شده در چندين میکروتیوب تقسيم و براي استفاده در مراحل بعدي در فریزر Cº 20- نگهداري شد. توالي اين پروب به صورت زير است (بیگی167، 1995).
5’ CGG CCG TTG CCG CCG TTG CCG CCG TTG CCG CCG3’
براي نشان دار نمودن اوليگونوكلئوتيد با digoxigenin سه روش وجود دارد:
• 3’end labeling
• 3’ tailing
• 5’ end labeling
در اين پايان نامه از PGRS و DR نشان دار شده با دیگوکسیژنین به روش اول (3’end labeling) ساخت شركت DNA Technology A/S دانمارک استفاده گرديد.
3_4_14_2_ به دست آوردن رقت مناسب براي پروبPGRS به روش مک هیبریداسیون
پروب قبل از استفاده شدن در مرحله Mock hybridization رقيق میشد. اين مرحله بدین جهت صورت ميگيرد كه نتايج هیبریداسیون واضحتر به دست آید زیرا استفاده از غلظت بالاي پروب زمینه ايجاد نموده و غلظت پايين آن باعث به وجود آمدن سيگنال ضعيف میگردید. بدين ترتيب با روش Mock hybridization غلظت مناسب پروب براي هیبریداسیون مشخص میگردید. در اين روش قطعات كوچك غشاء با رقتهاي متفاوت پروب ليبل شده و به صورت زیر عمل میگرديد:
1- مقدار 3 ميكروليتر پروب نشان دار درون يك میکروتیوب محتوي27 ميكروليتر آب مقطر استريل ريخته میشد تا به اين ترتيب میکروتیوب B با غلظت 1/0 برابر تهیه گردد.
2- مقدار 3 ميكروليتراز میکروتیوب B درون میکروتیوب C محتوي 27 ميكروليتر آب مقطر استريل ريخته میشد تا غلظت 01/0 برابر به دست آيد.
3- مقدار 3 ميكرو ليتر ازمیکروتیوب C درون میکروتیوب D حاوی 27 میکرولیتر آب مقطر استريل ريخته میشد تا غلظت 001/0 برابر ایجاد شود.
4- مقدار 3 ميكروليتر از محتوي میکروتیوب D داخل میکروتیوب E دارای 27 میکرولیتر آب مقطر استريل ريخته میشد تا غلظت 0001/0 برابر به دست آيد.
يك ميكروليتر از پروبهای نشاندار شده هر میکروتیوب A، B، C و D برداشته و روي كاغذ غشاء قرار داده میشد. سپس مرحله شناسائی (ردیابی)168 به شرح زير انجام میشد.
3_4_15_ شناسائی
شناسائی به معني مشاهده نوارها یا قطعات مربوط به پروب نشاندار (لیبل شده) متصل شده بهDNA مورد بررسي است كه به روشهای زیر صورت میپذیرد.
3_4_15_1_ کلریمتری با NBT و BCIP

پایان نامه
Previous Entries منبع مقاله درباره ارزیابی کیفی Next Entries منابع پایان نامه درباره علمای شیعه، منابع تاریخی، منابع اسلامی، تاریخ زندگانی