منبع مقاله درباره مایکوباکتریوم، كشت، میگرفت، میگردید.

دانلود پایان نامه ارشد

حالت موکوئیدی نمونههاست. گر چه این غلظت سود به عنوان عامل عفونت زدا، هم آلودگیهای جنبی و هم بعضی مایکوباکتریومها را تحت تأثیر قرار میدهد (CDC).
ان ـ استیل ـ ال ـ سیستئین نیز خاصیت هضم موکوئید را داراست. در یک بطری مایکوپرب.بی.بی.ال، این محلول و سود 2% توأماً وجود دارد. وقتی یک نمونه با مقدار مساوی این محلول مخلوط گردد، از آنجا که غلظت نهایی سود یک درصد میشود، خاصیت توکسیک سود برای مایکوباکتریوم به حداقل خود میرسد. سیترات سدیم موجود در محلول تأثیر فلزات سنگین را که احتمالاً در نمونه وجود دارند و میتوانند ان ـ استیل ـ ال ـ سیستئین را خنثی نمایند، از بین می‌برد. از آنجا که خاصیت ضد موکوئیدی ان ـ استیل ـ ال ـ سیستئین پایدار نیست، در کیت مایکوپرب این محلول در آمپول در بسته داخل بطری پلاستیکی سود و سیترات قرار گرفته و درست هنگام استفاده از کیت، آمپول در داخل بطری پلاستیکی شکسته شده و محتویات آن به آرامی مخلوط میگردد. در کیت مایکوپرب، پاکت حاوی پودر بافر فسفات با pH، 8/6 نیز قرار دارد. بافر فسفات، وضعیت قلیائی سود و ان ـ استیل ـ ال ـ سیستئین و همچنین وزن مخصوص محلول را کاهش میدهد. هر آمپول ان – استیل – ال – سیستئین که در داخل بطری پلاستیکی سود قرار دارد حاوی375/0 گرم ان ـ استیل ـ ال ـ سیستئین میباشد.
ترکیبات بافر فسفاته در هر 500 میلی متر آب مقطر به قرار زیر است:
37/2 گرم دی سدیم فسفات146
27/2 گرم منوپتاسیم فسفات147
و pH نهایی برابر 8/6 خواهد بود.
قابل ذکر است که مخلوط محلول سود و ان – استیل – ال – سیستئین دارای خاصیت شدید قلیایی است.
پروسه هضم و آلودگی زدایی از اساسیترین مراحل کشت میکروبی در مایکوباکتریولوژی محسوب میگردد و تاکنون روشهای مختلفی برای انجام آن پیشنهاد شده است که از جمله میتوان به روشهای استفاده از سود نرمال به صورت منفرد، مخلوط سود و ان ـ استیل ـ ال ـ سیستئن، روش اسید اگزالیک و روش تری سدیم فسفات اشاره نمود. نکته بسیار مهم در تمامی روشهای هضم و آلودگی زدایی، رعایت مدت زمان تأثیر ترکیب یا ترکیبات مصرفی بر نمونه مورد نظر می‌باشد. در مواردی که از سود به شکل منفرد استفاده میشود، تماس بیش از 60 – 45 دقیقه این ماده و نمونه، علاوه بر کشتن ارگانیزمهای ناخواسته (غیر مایکوباکتریال) موجود در نمونه، خود مایکوباکتریومها را نیز نابود خواهد ساخت و بدین ترتیب این امر میتواند منجر به اخذ نتیجه منفی کاذب در کشت میکروبی گردد و از طرف دیگر ناتوانی در حذف کلیه میکروارگانیزمهای مزاحم غیر مطلوب، سبب خواهد شد که این ارگانیزمها در فرصت مناسب به سرعت تکثیر و از رشد مایکوباکتریومهایی که احتمالاً در نمونه وجود دارند، جلوگیری نمایند.
در زمان استفاده از سود نرمال به میزان مساوی یا معادل دو سوم حجم تقریبی نمونه، سود نرمال استریل به محتویات هاون اضافه میشد و پس از مخلوط نمودن محتویات، به مدت 30-20 دقیقه در انکوباتور C°37 قرار داده میشد.
در آلودگی زدائی و هموژنیزاسیون با استفاده از مایکوپرب، ابتدا آمپول داخلی آن که حاوی ان- استیل- ال- سیستئین و مقدار لازم سود بود، شکانیده و به خوبی دو محلول با یکدیگر مخلوط ميشد. محلول فوق طبق دستورالعمل در كمتر از 12 ساعت مصرف ميشد. به میزان هم حجم نمونه یا دو سوم حجم نمونه از محلول مایکوپرب داخل هاون ریخته و با دسته هاون نمونه را با محلول به خوبی مخلوط (به طور متوسط هر بطری برای سه نمونه كافي است) و به مدت 20 تا 30 دقیقه به همین حالت گذاشته ميشد تا سایر میکروبها کشته شوند. باسیل سل قادر است حداکثر یک ساعت در این محلول زنده بماند. بنابراین سعی شد مراحل بعدی تا رسیدن به مرحله خنثی سازی قبل از اتمام مهلت یک ساعته صورت پذیرد. هاونهاي حاوي نمونه هاي صلايه ، هموژنيزه و آلودگي زدائي شده در گرم خانه C°37 قرار داده ميشد.
3_4_2_3_ مرحله سانتریفوژ و خنثی سازی pH
توسط پیپت پاستور سترون از قسمت بالای محلول داخل هاون (به علت خصوصیت هیدروفوبی ناشی از لیپید فراوان در دیواره مایکوباکتریومها) برداشته و به داخل لولههای سانتریفیوژ ریخته میشد سپس به میزان هم حجم محلول برداشت شده به هر لوله سانتریفوژ، بافر فسفاته با pH، 8/6 اضافه ميگردید. به منظور حفظ تعادل سانتريفوژ، با كمك ترازو لوله هاي متقابل هموزن ميگرديد و لوله ها با 3000 دور در دقیقه به مدت زمان 20 – 15 دقیقه سانتريفوژ ميشدند.
پس از پایان مرحله سانتریفوژ، مایع رویی دور ریخته میشد و به رسوب باقیمانده ته لوله چند قطره بافر فسفاته pH، 8/6 اضافه و سوسپانسیون تهیه میگردید. با استفاده از معرف برموتیمولبلو و اسید کلریدریک نرمال و دسی نرمال استریل، خاصیت قلیائی لوله خنثي ميگرديد.
3_4_2_4_ کشت در لولههای لونشتاین- جانسون حاوي گلیسرین و پیروات
جدول 3_3 : مواد متشکله در محیط کشت لونشتاین- جانسون
مواد موردمصرف
مقدار
فسفات دي هيدروژن پتاسيم
4/2 گرم
سولفات منيزيم
24/0 گرم
سيترات منيزيم
6/0 گرم
آسپاراژين
6/3 گرم
آب مقطر
600 میلی لیتر
تخم مرغ
20 عدد
گليسيرين (لوناشتاین گلیسیرین دار)
12 میلی لیتر
پيروات سديم(لونشتين جانسون پيروات دار)
6/10 گرم
مالاشيت گرين 5%
8 میلی لیتر
نشاسته سيب زميني
30 گرم
طرز تهيه:
مواد فوق به خوبی با هم مخلوط شدند. سپس به مدت 20 دقيقه در دماي 121 درجه سانتيگراد اتوکلاو شده و بعد از آن در لوله هاي در پيچ دار حدود7 میلی لیتر از آن ریخته و به مدت50 الی90دقیقه در فور با دمای 85 درجه سانتیگراد به شکل مورب قرار داده شد تا مقداری از آب محیط تبخیر شود ومحیط حالت جامد به خود بگیرد.

روش کار:
قبل از انجام کشت یک ویال 15 میلی لیتری غنی کننده او.ای.دی.سی با یک ویال آنتی بیوتیک پنتا به خوبی مخلوط میگردید.
توسط پیپت پاستوراستريل به هر محیط کشت جامد لونشتاین– جانسون گلیسرین دار و پیرووات دار (دو لوله کشت، از هر محیط یک لوله) به میزان تقریبی 1/0 میلی لیتر از سوسپانسیونی که در مرحله بالا حاضر شده بود، تلقیح میگردید. سپس درب محیطهای کشت بسته و کلیه محیطهای کشت به گرمخانه 37 درجه سانتیگراد منتقل میگردید. هر هفته تا 12 هفته نتایج رشد و تکثیر باکتریها مورد بررسی قرار میگرفت دیکنسون148 (1999). در محیطهای کشت جامد در صورتی که نتیجه کشت مثبت بود، پرگنه باسیل به طور واضح قابل مشاهده بود که برای تائید مجدداً گسترش تهیه و به يكي از روشهاي اسيد فست رنگ آميزي و وجود باسيل اسيد فست بررسي ميشد.
3_4_3_ بررسي كشت لوله هاي لونشتاين – جانسون (LJ)
حداقل 8 هفته پس از کشت و انکوباسیون، از سطح تمام لولههای کشت لونشتاین- جانسون تلقیح شده نیز گسترش تهیه و به روش فلئوروکروم رنگآمیزی و با میکروسکوپ فلورسنت مورد مشاهده قرار میگرفت و در صورت مثبت بودن پاسخ، وجود باسیلهای اسیدفست به روش ذیل نلسون و میکروسکوپ نوری نیز مورد تائید قرار میگرفت (کولینز، 1997).
3_4_4_ رنگ آمیزی به روش فلئوروکروم
روش رنگآمیزی فلوئوروکروم براساس همان اصل پایه ای کلاسیک روش اسیدفست است که به جای 5 دقیقه رنگ فوشین از محلول اورامین- o149 به مدت 15 دقیقه و به جای رنگ زمینه متیلن بلو150، از پرمنگنات استفاده میشود. بقیه مراحل همانند روش ذیل نلسون است. در این روش باسیل به صورت زرد درخشان در زمینه سیاه مشاهده میگردد. مراحل رنگ آمیزی به شرح زیر است:
1- ثابت نمودن گسترش توسط شعله
2- ریختن متانول روی گسترش به مدت پنج دقیقه
3- شستشوی سطح لام با آب مقطر
4- پوشانیدن سطح لام با اورامین- o به مدت پانزده دقیقه در دمای اتاق
5- شستشوی لام سه مرتبه با آب مقطر
6- رنگ زدایی با اسید الکل به مدت سه دقیقه
7- شستشوی سطح لام سه مرتبه با آب مقطر
8- ریختن رنگ زمینه پرمنگنات به مدت دو دقیقه
سپس لام توسط میکروسکوپ فلورسنت با عدسی نمره 100، برای مشاهده باسیل اسیدفست مورد بررسی قرار میگیرد (تصویر 3-4 ).

تصویر 3-4: باسیل اسیدفست در رنگآمیزی فلوئوروکروم
3_4_5_ انجام تستهای بیوشیمیایی تعیین هویت
معمولاً مایکوباکتریوم بویس در محیط لونشتاین جانسون پیرووات دار و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در محیط لونشتاین جانسون گلیسرین دار بهتر رشد مي‌كند. براي تعيين هويت از تستهاي تكميلي نياسين، كاتالاز C° 22 و C°68 ، نيترات رداكتاز و كشت در محيط TCH استفاده مي‌گردید. با انجام اين تست‌ها و با توجه به خصوصیات رشد، جدايهها در دو گونه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، مایکوباکتریوم بویس و يا در گروهي ديگر تحت عنوان ديگر مایکوباکتریها151(OM) جاي داده شدند. نتايج تست‌هاي افتراقي مربوط به تمايز گونه هاي مايكوباكتريومها درجدول 3-4 خلاصه شده است(کولینز، 1997)
جدول 3-4: تستهای تعیین هویت مایکوباکتریومها
گونه
تست نیاسین
تست کاتالاز C°22
تست کاتالاز C°68
تست نیترات رداکتاز
کشت در TCH
رشد درLJ پیروات دار
رشد در LJ گلیسرین دار
سرعت رشد
تولید رنگدانه
کورد فاکتور
مایکوباکتریوم توبرکلوزیس
+
+

+
+
ضعیف
خوب
کند

+
مایکوباکتریوم بویس





خوب
ضعیف
کند


دیگر مایکوباکتریها

+/-
+/-
+/-
+
متغیر
متغیر
متغیر
+/-
+/-
3_4_5_1_ تست نياسين
ابتدا يك ميلي‌ليتر آب مقطر استريل به محيط كشت اضافه و توسط نوك پيپت پاستور خراشهايي بر روي سطح محيط ايجاد میشد. سپس لوله به صورت افقي در هواي اتاق قرار میگرفت و مقدار 6/0 ميلي‌ليتر از مايع برداشته و داخل لوله استريل ديگري ریخته میشد و يك نوار تست نياسين داخل لوله قرار میگرفت (با توجه به جهت راهنماي موجود بر روي نوار تست). پس از گذشت 20 دقيقه در صورتي كه مايع برداشت شده به رنگ نوار شاهد تغيير رنگ میداد، جواب تست مثبت (یعنی گونه مورد آزمایش تولید نیاسین مینماید)، و در صورت بي‌رنگ ماندن نتیجه تست منفي تلقي ‌میشد (تصویر 3-5).

تصویر 3-5: لولههای تست نیاسین مثبت و منفی
3_4_5_2_ تست كاتالاز
براي انجام تست كاتالاز از دو تامپون فسفاته A و B استفاده مي‌شد (براي تهيه محلول A، gr4/9 فسفات دي سديک در يك ليتر آب مقطر و براي تهيه محلول B، gr07/9 فسفات منوپتاسيك در همان مقدار آب مقطر حل ميگردید). از محلول A به ميزان ml1/61 و از محلول B به ميزان ml 9/38 با هم مخلوط میگردید. pH محلول فوق معادل 7 بود. ml5/0 از مخلوط تامپون فسفاته برداشته در دو لوله جداگانه ریخته و یکی از لوله ها را به مدت 20 دقيقه در بن‌ماري C°68 و لوله ديگر به همين مدت در بن‌ ماري با دماي C° 22 قرار داده می شد. سپس به محتويات هر دو لوله ml5/0 از مخلوط مساوي توئين80 و آب اكسيژنه 30 حجمي اضافه میشد. حضور توئين80 سبب افزايش ميزان كشش سطحي مايع مي‌گردد و بدين ترتيب در صورت توليد شدن حباب ضمن انجام تست كاتالاز، اين حبابها در سطح مايع باقي مانده و توليد آنها بهتر مشخص مي‌‌گردد. در صورت مشاهده حباب پاسخ تست مثبت و در غير اينصورت منفي بود.
3_4_ 6_کشت مجدد در لوله لونشتین جانسون
برای استخراج DNA به اندازه كافي، لازم است تعداد قابل توجهی سلول باکتری در اختیار باشد به همین منظور از هر نمونه كشت تازه محيط لونشتین جانسون به کمک آنس یک بار مصرف درون ده محيط كشت جدید لونشتین جانسون باکتری تلقیح گردید.باکتری به صورت يكنواخت روي سطح محيط كشت با حركت ملايم توزيع شده و مدت 8-6 هفته در دمای C° 37 انکوبه میشدند. در این تحقیق از هر لوله حاوی کشت غلیظ باکتری حداقل دو بار DNA استخراج گردید (تصویر 3-6).

تصویر 3-6- نمائی از لولههای کشت مجدد مایکوباکتریوم بویس، از هر نمونه روی 10 لوله لوانشتین جانسون پیرواتدار
3_4_7_ استخراج DNA
3_4_7_1_آماده سازی مواد مصرفی برای استخراج DNA
• بافر 10 X TE
100 میلی مول تریس HCl، دارای 8pH= با 10 میلی مول EDTA مخلوط و اتوکلاو شد. حجم محلول نهایی یک لیتر در نظر گرفته شد. برای ساختن 1xTE، 10 میلیلیتر از محلول فوق در

پایان نامه
Previous Entries منبع مقاله درباره استان خراسان، روش تحقیق، خراسان رضوی Next Entries منبع مقاله درباره ارزیابی کیفی