منبع مقاله درباره مايكوباكتريوم، تكنيك، توبركولوزيس، مي‌باشد

دانلود پایان نامه ارشد

مايكوباكتريوم قابل استفاده مي‌‌باشند و برخي از آن‌ها در مورد كمپلكس مايكوباكتريوم توبركولوزيس و گروهي تنها درمورد گونه مايكوباكتريوم توبركولوزيس و تعدادي نيز براي گونه‌هاي ديگر حالت اختصاصي دارند. در برخي موارد حساسيت PCRكم مي‌باشد و علت اين امر آن است كه هر باكتري تنها حاوي يك رونوشت از سكانس DNA(به مبحث انگشت‌نگاري DNA مراجعه نماييد) خاصي است كه پرايمر به آن اتصال مي‌يابد. اينسرشن سكانس44به سكانس‌هايي اطلاق مي‌گردد كه در اغلب موارد(اما نه در تمام حالات) به تعداد فراوان در طول ژنوم ميكروب تكرار مي‌‌گردند(بیر و همکاران45، 2012).
انجام چندين واكنش PCR مختلف به صورت همزمان(مشهور به PCR چندگانه46) نيز امكان‌پذير مي‌باشد و اين موضوع تأييد مي‌كند كه حالت بازدارندگي متقابل در بين واكنش‌هاي آمپليفيكاسيون وجود ندارد. بر همين اساس انجام اين گونه تست‌ها جهت شناسايي مايكوباكتريوم‌ها اعم از اعضاي كمپلكس مايكوباكتريوم توبركولوزيس و خود گونه مايكوباكتريوم توبركولوزيس به صورت همزمان و در يك لوله قابل اجرا مي‌‌باشد(گودفلو و واین47، 1982).
در طي سال‌هاي اخير تكنيك PCR به صورت گسترده توسط گروه زيادي از محققين به منظور تشخيص بيماري سل و نيز ساير بيماري‌هاي مايكوباكتريايي مورد ارزيابي قرار گرفته است. نكته مهمی كه در مورد PCR وجود دارد اين است كه اين تكنيك قادر است علاوه بر DNAباكتري‌هاي زنده، DNA باكتري‌هاي مرده را نيز تکثیر نمايد. از این تکنیک برای آشکار نمودن وجود باسیلهای سل در اسكلت‌هاي قديمي باقیمانده از دوران گذشته استفاده شده است. نیمان و همکاران48(2002). تاكنون اصلاحات ويژه‌اي در تكنيك PCR انجام گرديده است و اين تكنيك‌هاي اصلاحي نسبت به تكنيك‌هاي اوليه از مزاياي متعددي برخوردار هستند. امروزه بر اساس تعدادي از اين اصلاحات، كيت‌هاي قوي، با روش كار ساده والبته گران قيمت‌تر عرضه شده است به عنوان مثال مي‌توان به كيت‌هايي كه براي نشان دادن وجود مايكوباكتريوم توبركولوزيس براساس آمپليفيكاسيون RNA ريبوزومي S16در بازار موجود مي‌باشد، اشاره نمود. در اين تكنيك RNAريبوزومي توسط يك آنزيم ترانس كريپتاز معکوس به DNA ترجمه مي‌گردد و تركيب اخير توسط آنزيم RNAپلي‌مراز(يكي از پروموتورهايي كه در پرايمرها شركت دارد) در چرخه‌هاي متعدد به كپي‌هاي جداگانه rRNAترجمه خواهد شد. اين سيستم از سه مزيت برخوردار مي‌باشد كه عبارتند از:
1- از نظر دما يكنواخت و به اصطلاح ايزوترمال مي‌‌‌باشد(به عبارت ديگر تمام مراحل كار در يك دما انجام مي‌گيرد و به همين دليل نيازي به استفاده از وسيله كنترل دما وجود ندارد).
2- از حساسيت خوبي برخوردار است زيرا هر سلول باكتريايي محتوي 2000 نسخه كپي از RNAمورد نظر مي‌‌باشد.
3- در اين سيستم محصولات و تركيبات تکثیر شده ناپايدار هستند وبدين ترتيب خطر انتقال‌ آلودگي ضمن كار كاهش مي‌يابد(شنیک و گود49، 1994).
در حال حاضر در شركت‌هاي صنعتي– تجارتي انگيزه‌اي قوي براي انجام اصلاحات بيشتر بر روي تكنيك‌هاي پايه آمپليفيكاسيون وجود دارد به همين دليل مراجعه مكرر به نوشتار‌هاي علمي موجود و همچنين جديد، ضروري است (بیر و همکاران، 2012).
1-15-2-2تعيين هويت مولکولي مايکوباکتري هاجهت تعیین گونه
1-15-2-2-1پروب هاي اسيدنوکلئيک
ماهيت پروب هاي مذکور بر اساس توانايي زنجيره هاي منفرد DNA (يا RNA) براي به هم پيوستن و اتصال به شکل يک مارپيچ مضاعف بوده و ايجاد سکانس بازهاي آن را به صورت مکمل يکديگر سبب خواهد شد و براي اولين بار در دهه 70 ميلادي مورد استفاده واقع گرديد. بال و همکاران50،(1992) در اين مطالعات DNA به عنوان ژنوم کامل باکتري به يک غشا متصل بوده و درجه اتصال DNA نشاندار راديواکتيو در مورد گونه هاي همولوگ و هترولوگ تعيين مي گردد. اين تکنيک با پيچيدگي هاي بالاي خود به طور گسترده استفاده نگرديد (هیفتز51، 1994).
1-15-2-2-2 ريبوتايپینگ
RNA ريبوزومي(rRNA) که مي تواند هم در تست هاي تشخيصي متکي بر آمپليفيکاسيون اسيدنوکلئيک استفاده شده و هم براي شناسايي گونه مورد استفاده واقع شود. با وجود پايداري شديد rRNA، تفاوتهاي کوچکي درسکانس بازهاي آن دربين گونه هاي مختلف مايکو باکتريوم ديده مي شود و از روش تعيين سکانس بازهاي rRNA مانند S16 و S23 مي توان تمايز گونه اي بين اعضاي مايکوباکتريوم را مشخص نمود (فادن52، 1994).
1-15-2-2-3- روش هيبريديزاسيونDNA – DNA
اين تکنيک در تعيين هويت گونه ها روشي رفرانس است و آينه ي تمام ژنوم مي باشد. نتايج بر اساس درصد هيبريداسيون يا (اختلاف درجه حرارت بين هتروهومودوپلکس) بيان مي شود. استاندارد کردن نتايج نيازمند براي ارزيابي دقيق پايداري حرارت هيبريدهاي به دست آمده از آزمايشات است که مي بايست از 6 درجه سانتيگراد براي سويه هاي مشابه کمتر باشد. در عين حال درصد هيبريديزاسيون بين تجربيات يا روش هاي مختلف فرق دارد ( کوسینز، 1993).
1-15-2-2-4 پروب هاي هيبريداسيون داخل ژنومي تجاري
اين سيستم ارزشمند و پر استفاده مي باشد و جهت پلي مورفيسم S rRNA16 )اسيد ريبونوکلئيک ريبوزومي( است. پروب هاي اختصاصي تجارتي جهت م. توبرکلوزيس، م. ايویوم، م اينتراسلولارم . کانزاسي اي تهيه شده است (براند53،1993).
1-15-3- ژنوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس
به طور کلی مایکوباکتریوم های پستانداران را که دارای ژنوم مشابه هستند در یک گروه بنام مایکوباکتریوم توبرکلوزیس کمپلکس تقسیم بندی می کنند. اولینبار در سال 1998 ژنوم م. توبرکلوزیسH37Rv بهطور کامل توالییابی و منتشر شد. طول توالي کامل ژنومH37RV(اولين مايکوباکتريوم توبرکلوزيسي است که جهش و موتاسيوني روي آن رخ نداده است و معمولا به عنوان سوش استاندارد از آن استفاده مي کنند) با استفاده از روش Shot gun، 4411532 جفت باز آنتوالییا بیشده است که حاوی 5/65 % G+Cاست (تصوير 1-15). ژنوم حاوي تقريبا 4000 ژن است که بيشتر از 91% آن ظرفيت کد کردن رادارد. ژنها در 11 گروه عملکردي تقسيم بندي شده اند. نقش عملکردي به 52% از آنها نسبت داده مي شود و 48% فعاليت آنها هنوز شناخته نشده است(تصوير2-6).قسمتهای بزرگ در ژنوم باکتری، آنزیمهایی را جهت متابولیسم چربیها تولید میکنند)80.( تعداد بسياري از موتاسيون ها در طول ژنوم رخ مي دهد که باعث ايجاد مقاومت دارويي مي شود. به نظر مي رسد که بيشتر نوترکيبي ها از طريق ترانسپوزون هاي متفاوت صورت مي گيرد. که اجزايي بسيار ناپايدارند و قادر به ايجاد انواع مختلفي از باز آرايي ها مانند جايگزيني، حذف، معکوس شدن و دو برابر شدن مي باشند(بور و همکاران54، 1999).
4/3 ژنوم ترکيبي از ترانسپوزون ها، توالي الحاقي55(IS) و پروفاژهای(phiRV1 ,phiRV2) است. 56کپي از IS که متعلق بهIS259،IS110،IS30،IS21،IS5،IS3،ISL3 بوده شناسايي شده. IS6110، يک عضو IS3 است که فراوان ترين عضو بوده و مهمترين نقش در ژنوم را دارد. اطلاعات بدست آمده از توالي ژنوم، نگرشي جديد در مورد بيولوژي باسيل ارايه مي دهد (کاستلو و همکاران، 1999 ؛ بنهوور و همکاران56، 1995).
ماركرهاي مخصوص، براي تمايز سويه هاي مايكوباكتريوم توبركلوزيس كمپلكس، ابزارهاي قابل قبول براي تشخيص سويه ها و مطالعات اپيدميولوژي سل مي باشند. انواع مایکوباکتریهارا ميتوان به راحتي بوسيله تعداد زيادي از روشهاي انگشت نگاري DNA تشخيص داد. اين روشها به چند دسته تقسيم مي شوند:
1- روش هايي که پروفايل انگشت نگاري توليد مي کنند مانند RFLP – IS6110
2- روش هايي که اساس آن PCRمي باشند مانند اسپوليگوتايپينگ57وVNTR58
3- PCR ترکيبي59 و…(فرنیا، 1387).

تصویر1-13:ژنوم مايکوباکتريوم توبرکلوزیس(27)

تصویر1-14:ژنوم مايکوباکتريوم توبرکلوزيس

تصویر1-15:ژنوم کامل سویهH37Rvمایکوباکتریوم توبرکلوزیس به انضمام موقعیت سکانسهای مهم تکراری مورداستفاده درتایپینگ کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس(بور و همکاران، 1999).
1-16- تکنیک های ژنومی
1 _16_1_ تكنيك‌هاي ژنومي كه اساس آنها PCR نمي‌باشد
تعدادی از این تكنيك‌ها، براساس وجود مناطق ويژه بر روي ژنوم مايكوباكتريوم ها طراحی شده است. یكي از جديدترين اين تكنيك‌هاRFLP60 است كه در حقیقت اصلاح شدة تكنيك REA مي‌باشد. RFLP دارای دستورالعملی مشابه براي هضم آنزيمي DNA ( كه از II Pvu يا I Alu استفاده مي‌شود)، میباشد و اين قطعات تولیدی توسط ژل آگارز در ميدان الكتريكي قابل تفكيك هستند. تنها وجه تمایز آن، اضافه شدن یک مرحله ساترن بلات61 برای جدا کردن DNA در روي غشاء نيتروسلولز يا فيلتر نايلون است و در ادامه اضافه كردن پروب‌ها جهت متصل شدن به مناطق مزبور، مي‌باشد و اين پروب‌ها صرفاً جهت چسبیدن به قسمتي از DNAی شكسته شده انتخاب شده‌اند. بنابراين بعد از هيبريداسيون، تنها تعدادی از قطعات هیبرید شده قابل مشاهده خواهند بود. دور (2000) در گذشته پروب‌هاي لیبل شده با32P با خاصيت راديواكتيو، مورد استفاده قرار مي‌گرفت و توسط در معرض قرار دادن در فيلم‌هاي مخصوص رادیوگرافی با اشعه ایکس قابل مشاهده بودند ولي به علت خطرات ناشی از آن براي سلامتي افراد، از متدهاي غير راديواكتيو و عمدتا از روشهاي شيميايي استفاده مي‌شود. کوسین(1993) اولين مرحله در اين تكنيك، انتخاب پروب میباشد.‌ تا پليمورفيسم و تمايز خوب بين سويه‌ها را آشكار سازد. پروب‌ها بر اساس سکانس تكرار شونده، انتخاب میگردند زيرا اينها با تعداد بيشتري از قطعات باند شده و اين مي‌تواند میزان آشكارسازي را براي پلي‌مورفيسم افزايش دهد. اين عناصر تكراري كه براي RFLP استفاده مي‌شوند، شامل IS، قطعات تكراری GCیا (PGRS) و قطعات DR مي‌باشد دور (2000).
1_16_1_1آنالیز توسط آنزیمهای محدود کننده62
تكنيك REA اولين تكنيكي بود كه براي تفکیک گروه خاصی از مايكوباكتريوم بويس ارائه داده شد. در اين تكنيك، بعد از استخراج DNA از سلول، ژنوم باکتری به طور کامل با 3 آنزيم محدود کننده BstE12، Pvu II و Bc22 مورد هضم آنزیمی قرار مي‌گيرد. این آنزیمها سکانس های خاصی را با ویژگی بالا برش داده و قطعات کوچکی را از DNA ایجاد کرده، كه اين قطعات توسط ژل آگارز در ميدان الكتروفورز از يكديگر جدا مي‌شوند. بر حسب وزن مولکولی، كوچكترين قطعات در فاصله دورتر قرار مي‌گيرند و سپس سویهها بر اساس قطعات الگوی رنگ شده با اتیدیوم بروماید، تعیین هویت و به وسیله دستگاه ترانس لومیناتور از آنها عکس تهیه میگردد. در اواخر دهه 1980 و اوايل دهه 1990، تكنيك REA تنها تکنیک مورد استفاده برای تایپینگ، بوده است كه براي مطالعات مولكولار اپيدميولوژيك در نيوزيلند و ايرلند مورد استفاده قرار گرفت. کولینز (1991) اجرای این روش بسیار سخت و تفسیر الگوهای کمپلکس در آن مشکل میباشد. علاوه بر این هيچ روشي براي مقايسه تيپ‌هاي به دست آمده از اين طریق وجود ندارد. لذا از اين تكنيك بندرت استفاده مي‌گردد. به جز کشور نیوزلند که این روش همچنان به عنوان یک روش انتخابی مورد استفاده قرار میگیرد(کولینز، 1999).
1_16_1_2_انگشت‌نگاري DNA به روش RFLP
تكنيك انگشت‌نگاري DNA يا اصطلاح درست‌تر آن آناليز به روش RFLP رايج‌ترين روش براي تقسيم‌بندي مايكوباكتريوم از نظر اپيدميولوژي مي‌باشد. از اين روش عمدتاً براي تايپينگ اعضاي كمپلكس مايكوباكتريوم توبركولوزيس استفاده مي‌شود اما ضمناً از آن براي تايپينگ اعضاي مايكوباكتريرم ايويوم نيز استفاده شده است. اساس تكنيك RFLP به این صورت است كه تمام رشته‌هاي DNA از هر منبعي كه باشند محتوي سكانس‌هاي كوتاهي از چندين باز هستند كه معمولاً تعداد آ‌نها 6-4 مورد در طول رشته مي‌‌باشد، اين رشته‌ها توسط آنزيم‌هايي به نام رستريكشن اندونوكلئاز63 هضم مي‌گردند و بدين ترتيب به قطعاتي با طول‌هاي مختلف تبديل مي‌گردند كه مي‌توان اين قطعات را بر مبناي ميزان تحرك وابسته به اندازه آنها در يك ژل الكتروفورز تفكيك نمود (کولینز، 1997).
در روش‌هاي تايپينگ اوليه، هضم يك ژنوم مايكوباكتريايي توسط اندونوكلئازها، سبب توليد هزاران قطعه مي‌گرديد كه ژل‌هاي

پایان نامه
Previous Entries منبع مقاله درباره سیر تکاملی، مورفولوژی، تاکسونومی Next Entries منبع مقاله درباره مايكوباكتريوم، الگوي، تكنيك، زيادي