منبع مقاله درباره مايكوباكتريوم، الگوي، تكنيك، زيادي

حاصله به سختي و به زحمت قابل خواندن بودند. اين مشكل را به دو روش مي‌توان حل نمود. اولين راه، هضم DNA و جدا كردن قطعات حاصله بر روي يك ژل مي‌باشد و سپس از يك پروب DNA نشاندار استفاده مي‌‌گردد، اين پروب تنها سكانس‌هاي خاصي از بازها را شناسايي و آشكار مي‌نمايد كه چندين بار در ژنوم ميكروب‌ تكرار شده‌اند، اين امر سبب مي‌گردد تعداد خطوط قابل رؤيت به ميزان قابل توجهي كاهش يابد. اين سكانس‌هاي تكراري شامل ترانس پوزون‌ها64 و اينسرشن سكانس‌ها65 و يا ژن‌هاي پرنده66 مي‌باشند. تقريباً در ميان تمام سويه‌هاي كمپلكس مايكوباكتريوم توبركولوزيس بين 1 تا بيش از 20 نسخه از يك اينسرشن سكانس به نام IS6110 يافت شده است موقعيت ونيز تعداد اين اينسرشن سكانس‌ها در بين سويه‌هاي مختلف تا حد زيادي متفاوت است و در عين حال در يك سويه واحد نسبتاً پايدار و ثابت مي‌باشد. با اين وجود گاهي اوقات وجود تغييرات جزيي نيز درميان نمونه‌هاي جدا شده متوالي از يك بيمار مشخص و يا در ميان نمونه‌هاي جدا شده از اپيدمي‌هاي محدود سل ديده شده است كه اين موضوع به خصوص در سويه‌هاي داراي نسخه‌هاي متعدد اينسرشن سكانس‌ها، مشاهده مي‌شود. از طرف ديگر تيپ‌هاي به دست آمده توسط RFLP از سويه‌هاي دختري واكسن BCG با وجود كشت‌هاي مجدد فراوان در شرايط مختلف و در آزمايشگاههاي متعدد سرتاسر جهان، به صورت مشخص ثابت و بدون تغيير باقي مانده‌اند (هوپر و همکاران67، 1986).
براي انگشت‌نگاري، به ويژه در شرايطي كه يك و يا تعداد محدودي اينسرشن سكانس وجود دارد و همچنين در شرايطي كه هيچ سكانسي وجود ندارد از انواع ديگر DNA چند نسخه‌‌‌اي استفاده مي‌‌شود ون‌سولينگن68 در سال 1994 به شرح اين گروه ماركرها شامل سكانس‌هاي تكراري مستقيم69، اليگوتيدهاي واقع در فضاي بين اين سكانس‌ها (از اين اليگوتيدها به صورت فزاينده در تكنيك تايپينگ با كمك اليگوتيد يا به اصلاح اسپوليگوتايپينگ70 استفاده مي‌شود) و سكانس‌هاي مكرر چند شكلي غني از GC، پرداخت (ون سولینگن، 1994).
جزئيات فني تكنيك تايپينگ به روش RFLP كمپلكس مايكوباكتريوم توبركولوزيس توسط ون امبدن71 در سال 1993 ارائه شده است. به طور كلي در اين تكنيك DNA از كشت‌هاي تهيه شده از نمونه‌هاي باليني استخراج مي‌شود و پس از هضم توسط يك آنزيم اندونوكلئاز رستريكشن به كمك ژل الكتروفورز تفكيك مي‌گردد. پس از اين مرحله قطعات DNA جدا شده توسط تكنيك ساترن بلاتينگ72 به يك غشاء نايلون انتقال داده مي‌‌شوند و پروب‌هاي DNA كه با استفاده از تركيب كروموژن‌ ديگوكسي ژنين نشان‌دار شده‌اند براي سكانس‌ IS6110 به كار گرفته مي‌شوند. وضعيت تحرك باندهاي مشاهده شده با اثرات نشانگر چندگانه در مجاورت اثرات مربوط به نمونه مقايسه مي‌شود. اشكال به دست آمده از RFLP مربوط به سويه‌‌ها را مي‌توان به صورت چشمي و يا توسط يك سيستم كامپيوتري به صورت نوري تصويربرداري و با يك مجموعه رفرانس مقايسه نمود(تصویر 1-16و 1-17) (ون امبدن، 1993).
از آن‌ جايي كه روش انگشت‌نگاري مذكور داراي يك پروب DNA مي‌باشد لذا فقط در مورد سويه‌هايي قابل استفاده است كه حاوي يك اينسرشن سكانس هستند. روش جايگزين كه براي تمام سويه‌هاي مايكوباكتريايي استفاد می شود روشی است كه DNA را تنها در تعداد بسيار محدودي از نقاط آن قطع مي‌نمايد اين امر سبب مي‌گردد تعداد كمي از قطعات بسيار بزرگ DNA پديد آيد. با وجود آن كه اين گونه قطعات در يك سيستم الكتروفورز استاندارد به سادگي حركت و مهاجرت نمي‌نمايند اما با استفاده از تغييرات متوالي جريان الكتريكي در جهات مختلف اين قطعات غول‌پيكر به آهستگي در درون ژل بر روي يكديگر لغزيده وبدين ترتيب از يكديگر جدا مي‌شوند. از اين روش براي تمايز سويه‌هاي مايكوباكتريوم توبركلوزيس، كمپلس مايكوباكتريوم ايويوم و مايكوباكتريوم شلونئی استفاده شده است. تاكنون چندين تكنيك جهت انگشت‌نگاري محصولات PCR شرح داده شده است كه از اين تكنيك‌ها مي‌توان به عنوان تست‌هاي غربالي جهت دسته‌بندي‌هاي احتمالي از نظر اپيدميولوژي استفاده نمود (هاس و همکاران73، 1993)
از تكنيك انگشت‌نگاري DNA براي مطالعه پراكندگي با سيل‌هاي سل در اپيدمي‌هاي كوچك اين بيماري واز جمله موارد ناشي از مواجهه افراد HIV مثبت با بيماران مسلول عفوني در بيمارستان‌ها استفاده شده است تا اهميت نسبي فعاليت مجدد بيماري سل با منشاء داخلي و عفونت مجدد با منشاء خارجي در اپيدمي‌هاي سل تعيين گردد و همچنين از اين تكنيك‌ براي آشكار نمودن گستردگي باسيل‌هاي سل مقاوم به دارو در يك جامعه به صورت غيرمستقيم نيز استفاده شده است (کولینز، 1997).

تصویر1-16: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با استفاده از روش REA (Durr et al., 2000).

تصویر1-17: مراحل اصلی برای تشخیص پلی مورفیسم در ژنوم مایکوباکتریوم بویس با استفاده از روش RFLP (Durr 2000).
1_16_1_2_1_ RFLP به كمك سکانس الحاقی 6110
در اوائل سال 1990، روشRFLP-IS6110 به عنوان روشي استاندارد در اپيدميولوژي بيماري سل شناخته شد. اساس RFLPمبتني بر وجود ترانسپوزون هاي IS6110 بوده که به طور اختصاصي در طول ژنوم کمپلکس مايکوباکتريوم توبرکلوزيس به تعداد متنوع و در جايگاههاي مختلف وجود دارد. تعداد و موقعيت اين باندها در طول ژنوم گونه هاي مختلف مايکوباکتريوم توبرکلوزيس باعث الگوي انگشت نگاري ژنتيکي مي شود. تعداد کپي IS6110 در هر سويه بين 0-25 عدد متغيير است و به عنوان وسيله اي مناسب براي تعيين سويه، به علت قدرت افتراق زياد و تکرار پذيري بالا مورد استفاده قرار مي گيرد. یوکویاما74 (2007 ). اين روش بر اساس PCR نمي باشد بلکه بر اساس هيبريداسيون ساترن بلات مي باشد، بسيار پرزحمت است وبه مقدار زيادي DNA نياز دارد اما اين روش براي تاييد نتايج به دست آمده از روش هايي که بر اساس PCR که جديدتر و سريعتر هستند بکار مي رود. ون امبدن، ون سولینگن(1993، 1994) براي بدست آوردن الگوي IS6110-RFLP ، DNA از کشت باکتريايي استخراج شده، تخليص مي گردد. سپسDNA به وسيله آنزيم برش دهنده PVUII قطعه IS6110 را مي شکند و قطعات DNA بين 10-9/0 کيلو بازي توليد مي کند. سپس قطعات توليد شده بر روي ژل آگارز از يکديگر جدا مي شوند براي مشاهده قطعات حاوي IS6110، پروب نشاندار شده با پر اکسيداز حاوي DNA مکمل توالي IS6110 به بافر هيبريداسيون اضافه مي شود که پس از آن بر روي غشاي نيتروسلولزي ريخته مي شود. قطعات توليد شده توسط آنزيم PvuII که با پروب IS6110 هيبريد شدند، بوسيله واکنش کمي لومينسانس مشخص مي شوند و الگوي RFLP به وسيله فيلم حساس به نور رديابي مي شود. ون سولینگن( 2001) مقايسه اثر انگشت هاي بدست آمده، فرايند مشکلي است که نياز به مهارت زيادي دارد. بنابراين براي آناليز آن از نرم افزار خاصي استفاده مي شود. اساس ژنتيکي IS6110-RFLP بدين صورت است که توالي درج شده IS6110 حاوي 355/1 جفت باز مي باشد که اين توالي در تعداد کپي هاي متفاوت موجود مي باشد و ممکن است در سويه هاي مختلف، در مناطق متفاوتي درج شده باشد. اين تنوع، اساس پلي مرفيسم را تشکيل مي دهد که در انگشت نگاري کمپلکس مايکوباکتريوم توبرکلوزيس بکار مي رود. توالي هاي درج شده، بيشتر تمايل دارند که به مناطق خاصي در ژنوم مايکوباکتريوم درج يابند که به اين مناطق، نقاط داغ75 مي گويند. يک نمونه آن در مايکوباکتريوم توبرکلوزيس IS6110 مي باشد. اطلاعات نشان مي دهد که جابجايي قطعه IS6110 به صورت اتفاقي رخ نمي دهد بلکه IS6110 نيز نقاط داغ خاصي براي درج ژنوم دارد. تا به حال چندين نقطه داغ شناسايي شده است که شامل :
1- منطقه DR مورد استفاده در روش اسپوليگوتايپينگ يک يا دو IS6110 در اين منطقه درج شده است.
2- لوکوس IPL
3- منطقه بين ژنومي dnaA-dnaN
4- منطقه بين RV62C , RV1754C مي باشد (وارن76، 2000).
هاگ77 و همکارانش بعد از آناليز توزيع قطعات IS6110 – RFLP نشان دادند که به احتمال قويIS6110 ، نقاط داغ بيشتري از آنچه توضيح داده شد دارا مي باشند. وارن و همکارانش اين مسئله را تاکيد و همچنين نشان دادند که الگوي RFLP مي تواند تغيير کند. اگرچه قطعه IS6110 همچنان در نقاط داغ قرار دارد، اما مناطق مجاور نقاط داغ نيز فراواني موتاسيون زيادي دارند که مناطق محدود کننده براي آنزيم هاي محدود کننده به وجود مي آورند.
پايداري RFLPوابسته به تعداد کپي IS6110 مي باشد، هر چه تعداد کپي IS6110 بيشتر باشد، احتمال جابجايي قطعه بيشتر مي شود. بوار 78و همکارانش با بررسي الگوهاي RFLP در ايزوله هاي 544 بيمار، به اين مسئله پي بردند. بورگدورف79 (1999) نيمه عمر الگوي RFLP،32 سال است که براي مطالعات اپيدميولوژي مي توان از اين روش استفاده کرد. در يک مطالعه ديگر، Yeh و همکارانش نشان دادند که IS6110 در بدن فرکانس جابجايي زيادي دارد، که در طول سه سال،12 بيمار از 49، بيمار الگوي IS6110-RFLP تغيير يافته اي داشتند. همه اين تغييرات در سويه هاي داراي 14-8 کپي IS6110 رخ داد. با استفاده از روش تايپينگ استاندارد IS6110 و آناليز با کمک کامپيوتر، اين امکان وجود دارد که يک بانک اطلاعاتي بين المللي از الگوي مختلف RFLP از مناطق جغرافيايي مختلف ايجاد شود.
1_16_1_2_ 2_RFLP به كمك قطعات 1081
تحقيقات نشان میدهد که قطعه IS 1081 براي تایپینگ مایکوباکتریوم توبركلوزيس كمپلكس مورد توجه قرار گرفته است کولینز (1991). همچنین IS1081-RFLP در مطالعه سویههای مايكوباكتريوم بويس جنبه كاربرديتری داشته و براي تشخيص مایکوباکتریوم بویس ب.ث.ژ، از ديگر سویههای مايكوباكتريوم بويس مفيدتر است ون سولینگن(1992). ولي معمولاً IS 1081 در تركب با ديگر پروب‌ها مورد استفاده قرار مي‌گيرد تا تمایز و افتراق را در RFLP افزايش دهد (اسکوس80، 1994).
1_16_1_2_3_ RFLP به كمك قطعات تكراري GC (PGRS)81
در داخل ژنوم مایکوباکتریومها، تركيب GC به صورت قطعات تكرار شده، در بيش از 80% آن موجود مي‌باشد. اين قطعات(PGRS) در بيشترآنها به صورت پراكنده در سراسر ژنوم وجود دارد (روس82، 1992).
PGRS همچنين در تعدادي از پلاسميدها موجود مي‌باشند و زماني به صورت کلی توسعه پيدا كرد كه پلاسميد PTBN12 براي بهبود بخشيدن پروب رونوشت مورد استفاده قرار گرفت روس (1992). در اين ميان، توصيه و پيشنهاد شد كه این پروب شامل مجموعه‌اي از الیگونوكلئوتيدهاي سويه و شامل تعدادي از قطعات PGRS مي‌باشد. تحقيقات براي نشان دادن ظرفيت PGRS-RFLP براي مايكوباكتريوم بويس مشخص كرد كه وقتي از آنزیم Alu I براي DNA هضم شده مايكوباكتريوم بويس استفاده شود درجه خوبي از افتراق و تمايز گونهای و نژادی با موفقيت به دست مي‌آيد (کوسین، 1998).
کازین و همكاران، نشان دادند كه PGRS-RFLP قدرت افتراق گونه‌اي بالا را نسبت به اسپولیگوتایپینگ و IS6110-RFLP و DR-RFLP در اروپا، كانادا، استراليا و ايران دارد کازین (1998). در بررسي‌هاي انجام شده در جمهوري ايرلند بر روي گونه‌هايي از گوساله‌ها و گوركنها و آهوهای کوهی نتايج خوبي به دست آمد کاستلو83 (1999). در نتيجه PGRS-RFLP به عنوان يك متد و روش انتخابی، زمانيكه نیاز به بيشترين تفريق و جداسازی گونه‌اي مورد نظر باشد و نيز كپي‌هاي زيادي از IS6110 وجود داشته ‌باشد، توصیه شده است. اگرچه اجرای اين تكنيك کمی مشكل و سخت است لیکن نتايج بسیار رضایت بخش مي‌باشد (41). در یک مطالعه در سال 2001توسط ز. اچ یانگ84 در امریکا نشان داده شد که از سه روش اسپولیگوتایپینگ وانگشت نگاری ژنومی به وسیله پروب PGRSو پروب IS6110:اسپولیگوتایپینگ کمترین میزان تمایز دهندگی را شامل می شود و همچنین همین میزان افتراق دهندگی بین دو پروبPGRS و IS6110مشابه هم است، اما تفسیر نتایج در مورد RFLPبا پروب PGRSپیچیده تر است (ز. اچ یانگ، 2001).
1_16_1_2_4 RFLPبه کمک قطعات جدا شده سکانس های مستقیم تکرارشونده85(DR-RFLP) يك گروه بی نظیر براي گونه‌ها با نژادهاي مايكوباكتريوم توبركلوريس كمپلكس، گروه و دسته DR مي‌باشد كه