منبع مقاله درباره سازمان بهداشت جهانی، تشخیص بیماری، استان خراسان

دانلود پایان نامه ارشد

آنها بر روی ژل آگارز الکتروفورز گردید. نمونه هایی برای RFLPانتخاب شدند که دارای یک باند واضح و مشخص بودند و نمونه های دارای اسمیر و شکستگی کنارگذاشته شدند.

شکل (4-5):DNA های مناسب برای انجام RFLP
4-6- نتايج هضم آنزيمي(RFLP)، بررسی الکتروفورز و تهیه عکس
قطعات DNA با وزن مولکولی در حدود 5/0 تا 25کیلو باز، هضم شده بوسیله آنزیم محدود کننده PvuII بر روی ژل آگارز، الکتروفورز شدند(تصویر 4-5). در کنار نمونه ها از سايز ماركرDNA شماره 2 نشاندار با دیگوکسیژنین شرکت رش آلمان، برای تعیین اندازه باند ها استفاده شد.

تصویر(4_6): قطعات DNA ، هضم شده بوسیله آنزیم محدود کننده Pvu II
M-سایز مارکر شماره 2رش آلمان- P- کنترل مثبت – ستون اول نمونه شماره 1753- ستون دوم نمونه شماره 1756- ستون سوم نمونه شماره 1760- ستون چهارم نمونه شماره 1761- ستون پنجم نمونه شماره 1762- ستون ششم نمونه شماره1763- ستون هفتم نمونه شماره 1764- ستون هشتم نمونه شماره 1772
4-7-نتایج ساترن بلاتینگ:
نتایج الگوهای به دست آمده با استفاده از روشهای فوق به شرح زیر میباشد:
الف- با مقایسه چشمی باندهای با وزن مولکولی بالا ( 6557 تا 23130 جفت باز) و با استفاده از نرم افزار

ژل پرو182، از 8 سویه هضم شده با آنزیم Pvu II، پس از RFLP و هیبرید شدن با پروب PGRS و آشکار سازی، تعداد 2 الگوی متفاوت به دست آمد که در تصویر 4-5 نشان داده شده است. الگوها با نامهای PP1 تاPP2 (P حرف اول ابتدای آنزیم Pvu II و P حرف دوم ابتدای پروب PGRS) نامگذاری گردید (جدول 4-1)

تصویر(4-7): RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب PGRS
M-سایز مارکر شماره 2رش آلمان- P- کنترل مثبت- ستون اول نمونه شماره 1753- ستون دوم نمونه شماره 1756- ستون سوم نمونه شماره 1760- ستون چهارم نمونه شماره 1761- ستون پنجم نمونه شماره 1762- ستون ششم نمونه شماره1763- ستون هفتم نمونه شماره 1764- ستون هشتم نمونه شماره 1772
ب – با مقایسه چشمی باندهای با وزن مولکولی2027 الی23130 جفت باز و با استفاده از نرم افزار ژل پرو، از 8 سویه هضم شده با آنزیم Pvu II، پس از RFLP و هیبریدیزاسیون با پروب DR و آشکارسازی، 3 الگو به دست آمد، که با علامت اختصاری PD1 تاPD3 (حرف اول آنزیم Pvu II و حرف اول پروب مصرفی) نامگذاری گردید (تصویر 4-6).

تصویر(4-8):RFLP با آنزیم Pvu II و هیبریداسیون با پروب DR
M-سایز مارکر شماره 2رش آلمان-P- کنترل مثبت- ستون اول نمونه شماره 1753- ستون دوم نمونه شماره 1756- ستون سوم نمونه شماره 1760- ستون چهارم نمونه شماره 1761- ستون پنجم نمونه شماره 1762- ستون ششم نمونه شماره1763- ستون هفتم نمونه شماره 1764- ستون هشتم نمونه شماره 1772
در الگوهاي بدست آمده در اين تحقيق با استفاده از آنزيم PvuIIو پروبهايPGRS و DR، از2 الگوي بدست آمده از8 جدايه هضم شده با آنزيم PvuII و هيبريد شده باPGRS ، بيشترين الگو مربوط به الگوي PP-1مي‌باشد كه اين الگو كاملا شبيه به الگوي بدست آمده از مايكوباكتريوم بويسBCGاست، و از3 الگوی بدست آمده از8 جدايه هضم شده با آنزيم PvuII و هيبريد شده با پروب DR نشان داد كه بيشترين الگو بدست آمده مربوط به PD-1مي‌باشدكه اين الگو كاملا شبيه به الگوي بدست آمده از مايكوباكتريوم بويسBCG است.
جدول 4-1- نمونههای مورد استفاده در این تحقیق به همراه الگوهای مشاهده شده و مکان جغرافیائی نمونهها
ردیف
شماره
سویه
RFLP با آنزیم Pvu II
استان
شهرستان

پروب
PGRS
پروب DR

P
BCG
PP-1
PD.1
سویه استاندارد
1
Razi01753
PP-1
PD.1
مشهد
2
Razi01756
PP-1
PD.1
مشهد
3
Razi01760
PP-1
PD.1
مشهد
4
Razi01761
PP-2
PD.2
مشهد
5
Razi01762
PP-2
PD.1
مشهد
6
Razi01763
PP-2
PD.2
مشهد
7
Razi01764
PP-1
PD.1
مشهد
8
Razi01772
PP-1
PD.3
مشهد

فصل پنجم
نتیجه گیری و پیشنهادات

5-نتیجه گیری
سل كه از ديرباز بعنوان يكي از معضلات زندگي بشريت شناخته شده است، در انسان و حيوانات توسط كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس ايجادمي‌شود براي آگاهي از منابع آلودگی، مسیرهاي انتقال، اپيدميولوژي و تغييرات مولكولي عامل سل در گاو، در طي چند سال اخير بررسي مولكولي سويه هاي مايكوباكتريوم بويس جدا شده از گاوهاي توبركولين مثبت و گاوهاي سلي كشتار شده در كشتارگاه‌هاي سراسر كشور، تحقيقات و مطالعاتي صورت گرفته است. حیدرزاده، رفیعی و علوی(1388، 1392 و 1388)در ادامه مطالعات فوق، تحقيق حاضر در نظر دارد ميزان تنوع ژنتيكي كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس در استان خراسان را با استفاده ازتکنیکهاي مولکولی مانند PCRو RFLP مورد بررسي قرار دهد.
از بين مايکوباکتريوم‏هاي گروه کمپلکس مايکوباکتريوم توبرکلوزيس که عامل ايجاد کننده سل در پستانداران مي‏باشند مايکوباکتريوم بوويس بيشترين ميزان ميزباني را بخود اختصاص مي‏دهد. تاج بخش و طباطبایی(1366) محققان دريافتند که در بين اعضاي گروه مايکوباکتريوم کمپلکس توبرکلوزيس100-85 درصد تشابه ژنومي وجود دارد. در حال حاضر تمايز بين گونه ايکمپلکس مايکوباکتريوم توبرکلوزيس براساس مشخصات فتوتايپيک از جمله مورفولوژي کلني، ميزان رشد و انجام تست‏هاي بيوشيميايي ميسر مي‏‏باشد که پس از کشت انجام مي‏گيرند.
در حال حاضر طبق دستورالعملOIE و سازمان بهداشت جهانی، کشت و جداسازی مایکوباکتریوم قطعی ترین روش تشخیص بیماری سل میباشد. میلان(2004) در روش استاندارد جداسازی مایکوباکتریوم، محیطهای لوانشتین جانسون به عنوان بهترین محیطها معرفی شده است. میلان(2004) در این تحقیق نیز از روش کشت در محیطهای لوانشتین جانسون گلیسرین دار، پیروات دار برای جداسازی مایکوباکتریوم از نمونههای ارسالی استفاده گردید. (میلان، 2004)
دراین تحقیق براي جداسازي DNA ازمایکوباکتریومها از روش استاندارد ارائه شده توسط ونسولینگن در دستورالعمل WHO درسال1993میلادي براي انگشت نگاري ژنومیمایکوباکتریومها استفاده شد. این دستورالعمل درسال2002میلادي نیزباتغییراتی مجددا ارائه شد وشناخته شده ترین روش استخراج DNAاز مایکوباکتری ها جهت استفاده در RFLPاست.(سراینو و همکاران، 1999)
بهرهمندی از تکنیکهای تايپينگ مولکولي مانند پليمورفيسم قطعات به وسیله آنزيمهاي محدود كننده(RFLP) در گلههايي كه اين بيماري در آنها شيوع دارد جهت تشخيص دقيقتر مواردي مانند راه انتقال و جستجوي ردپاي بيماري بسيار مفيد مي باشد. همانگونه که در مبحث روش کار تحقیق حاضرنیز به آن اشاره شد، انتخاب آنزیم Pvu IIبرای هضم آنزیمی توصیهای بوده که در روش استاندارد ارائه شده توسط ون سولینگن در دستورالعمل WHO برای انگشت نگاری ژنومی کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ارائه شده است. (سراینو و همکاران، 1999)
در تحقیقات مولکولار اپیدمیولوژی سل گاوی برای جدایههای کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس از مارکرهای مختلف ژنتیکی استفاده میشود. دراين بين توالي هاي غني از GC بنامPGRS و رونوشت هاي مستقيم DR به عنوان ماركرهايي سودمند در RFLP انواع سويه هاي كمپلكس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مورد استفاده قرار مي گيرد. تکنیکهای مولکولی به کار رفته در این تحقیق همگی طبق توصیه OIE انتخاب گردیده و برای پلی مورفیسم مایکوباکتریوم بویس بالاترین تمایز را ایجاد مینماید. میلان(2004) به دلیل بزرگ بودن ژنوم مایکوباکتریومها بادارا بودن حدود 4/4 جفت بازتفسیرالگویRFLP به تنهائی وبدون هیبریداسیون مشکل میباشد، درحالیکه پس از انتقال DNAبه غشاء وهیبریداسیون باپروب وآشکارسازي، تفسیرامکانپذیرمیگردد.
همچنین دلیل انتخاب روشRFLP و هیبریداسیونDNA در مطالعه حاضر ارجحیتی است که این تکنیک بر سایر روشهای مولکولی در متمایز نمودن سویه های مایکوباکتریائی داراست. مثالهای زیر که به اختصار به آنها اشاره میگردد، شواهدی بر این انتخاب است.
تحقیقات زیر تجربیات محققین را در این خصوص نشان میدهد.
تكنيك انگشت‌نگاري DNA يا آناليز به روش RFLP رايج‌ترين روش براي تقسيم‌بندي مايكوباكتريوم از نظر اپيدميولوژي مي‌باشد. از اين روش عمدتاً براي تايپينگ اعضاي كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس استفاده مي‌شود. اساس كار تكنيك RFLP به این صورت است كه رشته‌هاي DNA توسط آنزيم‌هايي به نام رستريكشن اندونوكلئاز هضم مي‌گردند و بدين ترتيب به قطعاتي با طول‌هاي مختلف تبديل مي‌شوند كه مي‌توان اين قطعات را بر مبناي ميزان تحرك وابسته به اندازه آنها در يك ژل الكتروفورز تفكيك نمود.
گويال و همكاران در سال 1999 در غنا در يك تحقيق مقايسه‌اي كه با دو روش اسپوليگوتايپينگ و RFLP انجام دادند، تعداد 16 الگو به روش اسپوليگوتايپينگ و25 الگو به روشRFLP را شناسايي كردند كه نشان دهنده اين است كه روش انگشت نگاري ژنومي با استفاده ازRFLP تمايز بيشتري را نشان مي‌دهد.(52)
همچنين زوماراگا در سال 1999 در جنوب امريكا طي يك تحقيق از روش هاي اسپوليگوتايپينگ وRFLP استفاده نمودو از تعداد154جدايه مايكوباكتريوم بويس با روش اسپوليگوتايپينگ تعداد 31 الگو و به روشRFLP43 الگوي متفاوت را بدست آورد.(سری واتسان و همکاران183، 1997)
در ادامه در تحقيق ديگري كه در سال 2012 در دهوك عراق انجام پذيرفت تنوع ژنتيكي سويه هاي مايكوباكتريوم توبركلوزيس در بيماران مسلول با استفاده از سه روشIS6110–RFLP، اسپوليگوتايپينگ و VNTR مورد بررسي قرار گرفت كه نتايج آن حاكي از تمايز بالاي الگوهاي بدست آمده به روش RFLP-IS6110 نسبت به دو روش ديگر بود.(78)
در جمع بندي نتايج تحقيقات فوق چنين نتيجه گيري مي‌شود كه با توجه به نحوه انجام روش‌هاي اسپوليگوتايپينگ وVNTRكه به PCR وابسته مي باشند، اين تكنيك ها راحت‌تر بوده وبراي تست اوليه، روش هاي مبتني برPCR مناسب مي‌باشند ولی نسبت به روشRFLPتمايزي كمتري را نشان مي‌دهندزیرا قطعه کوچکی از ژنوم را مورد بررسی قرار می دهند و روشRFLPگستره بيشتري از كل ژنوم را نشان مي دهد و براي شناسايي دقيق سويه‌ها و مشاهده پلي مورفيسم بين آنها روشRFLP يك روش استاندارد و توصيه شده توسطOIE وWHO مي‌باشد. در نتیجه تکنیک کارآمدتر و قویتری می باشد.
در تحقيقي كه در سال 2006 توسط مصوري و همكاران با عنوان ” بررسي پلي مورفيسم سويه هاي مايكوباكتريوم بويس جدا شده از نمونه هاي ارسالي به موسسه رازي به روشRFLP انجام گرفت تعداد 14 سويه مايكوباكتريوم بويس در ايران شناسايي شدند كه بيشتر اين سويه‌ها مربوط به استان‌هاي شمالي و غرب كشور بودند.(فرنیا، 1387)
در مطالعه علوي و همكاران در سال 1387براي تشخيص و تعيين هويت مولكولي مايكوباكتريوم،‌ جدايه‌هاي گاوي مايكوباكتريوم بويس از جدايه‌هاي انساني مايكوباكتريوم توبركلوزيس در ايران به روشPCR-RFLP و مقايسه آنها با 5 سويه استاندارد انجام پذيرفت و نتايج آن تعيين هويت سريع دو گونه از يكديگر بود. شیمی(1376) استفاده از تكنيكPCR-RFLPيك روش سريع و دقيق جهت شناسايي گونه مايكوباكتريوم بويسنسبت به سايركمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس با استفاده از ژن كاذبي بنام oxy R مي‌باشد كه اين قطعه ژن در نوكلوئيد شماره 285 خود حاوي باز آدنين بوده اما در ساير كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس داراي باز گوانين ميباشند. استفاده از اين تكنيك براي شناسايي گونه مايكوباكتريوم بويس از كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس در مناطق افريقا، امريكاي جنوبي ومركزي، جنوب شرق آسيا و ساير مناطق كه انتقال مايكوباكتريوم بويس از حيوانات به انسان و ‌بعلكس مي‌تواند رخ دهد، بسيار مفيد خواهد بود. شیرانی (1385) در تحقيق حاضر نيز از روش فوق براي شناسايي گونه مايكوباكتريوم بويس استفاده شده است و نشان داد كه بين نتايج آزمايشات بيوشيميايي و تست هاي ملكولي 100% مطابقت وجود داد.
در تكنيكRFLP

پایان نامه
Previous Entries منبع مقاله درباره نمونه برداری، استان خراسان Next Entries منبع مقاله درباره آذربایجان غربی، استان خراسان، استان اصفهان، استان گیلان