منبع مقاله درباره استان خراسان، روش تحقیق، خراسان رضوی

دانلود پایان نامه ارشد

(4/79%) داراي الگوي متفاوت IS6110 بودند . با توجه به مشاهدات و تنوع بالا IS6110 در سويه هاي مختلف مايكوباكتريوم توبركولوزيس مي توان نتیجه گرفت که اكثر افراد با منشا متفاوت به بيماري سل مبتلا شده اند.
در تحقیقی که در سال 1389 توسط جبارزاده و سیفی تحت عنوان ” شناسایی سریع گونه های مختلف مایکوباکتریوم ها در بیماری سل” صورت گرفت نشان داده شد که اگرچه استفاده از تکنیک هایی چون کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و کروماتوگرافی گاز مایع ((GLC روشهای بسیار مفیدی برای تعیین گونه مایکوباکتریومها هستند ولی انجام آنها فقط محدود به آزمایشگاههای مرجع می باشد و روش PCR-RFLP یک روش آسان، سریع، دقیق و ارزان برای تشخیص گونه های مایکوباکتریوم می باشد.
بر اساس تحقیقات انجام شده توسط ذاکر بستان آباد و همکاران در سال 1390 تحت عنوان “تایپینگ سوش های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس جدا شده در بیماران شهر تهران با استفاده از اسپولیگوتایپینگ” کشت مثبت140 بیمار مبتلا به سل ریوی از نظر اسپولیگوتایپینک مورد بررسی قرار گرفتند. سویه های بدست آمده به 9 دسته متمایز شدند که دو سویه متعلق به مایکوباکتریوم بویس شناسایی شد. نتایج نشان می دهد که اسپولیگوتایپینگ یک روش ساده و دارای حساسیت بالا برای تمایز سویه های مایکوباکتریوم می باشد.
در تحقیقی که توسط مظفری و همکاران در سال 1390 انجام شد از روش اسپولیگوتایپینگ برای بررسی 212 سویه مایکوباکتریوم توبرکلوزیس استفاده گردید. نتایج نشان می دهد که اسپولیگوتایپینگ یک روش آسان و سریع جهت شناسایی سویه های رایج در کشور است.
در حال حاضر تنها روش شناسایی گاوهای آلوده در ایران و اکثر نقاط جهان آزمون توبرکولین میباشد. در سال‌هاي اخير اشتياق زيادي براي استفاده از تكنيك‌هاي مولكولي در آزمايشگاههاي سل ديده مي‌شود. دليل اصلي اين اشتياق آن است كه به كمك اين تكنيك‌ها مي‌توان با سرعت بسيار و در عين حال حساسيت و ويژگي‌ بالا به تشخيص مورد نظر دست يافت. در واقع در حال حاضر از نظر تكنيكي امكان تعيين آلودگي يك نمونه به يكي از اعضاء كمپلكس مايكوباكتريوم توبركولوزيس ظرف تنها چند ساعت وجود دارد و هم چنين مشخص‌نمودن مقاومت احتمالي اين عضو به ريفامپيسين ظرف مدت يك روز،‌ امكان‌پذير مي‌‌‌‌باشد. علاوه بر اين‌ها،‌ تكنيك‌ RFLPو تكنيك‌هاي وابسته به انگشت‌نگاريDNA، روشهاي تفريقي بسيار خوبي را كه براي تفكيك اعضاي زير گروه كمپلكس مايكوباكتريوم توبركولوزيس و ساير مايكوباكتريوم‌ها مناسب هستند، به منظور استفاده در زمينه اپيدميولوژي فراهم مي‌نمايند(کول، 1998).
http://www.cdc.hbi.ir/Images/PDF.jpg

فصل سوم
مراحل روش تحقیق

3- مراحل روش تحقيق
3-1-جمع آوری نمونه ها
در مطالعه حاضر طی سال 1388-1390 تعداد 65 نمونه از استان خراسان به بخش سل موسسه واکسن و سرم سازی رازی منتقل شد که از این تعداد 53 مورد اسمیر منفی و12 نمونه اسمیر مثبت شناسایی گردید. 8 نمونه مناسب مایکوباکتریوم جدا شده و یک سویه استاندارد مایکوباکتریوم بویس (ب.ث.ژ 1173P2به عنوان شاهد استاندارد برای مقایسه)، جهت انگشت نگاری ژنومی و بررسی پلی مورفیسم مایکوباکتریوم بویس استان خراسان مورد بررسی قرار گرفت. جدول 3-1 تعداد نمونه های ارسالی را نشان میدهد و تصویر 3-1 یکی از نمونههای مورد بررسی را نمایش میدهد.

جدول 3-1: تعداد 65 نمونه عقدههای لنفاوی گاو ارسالی به دپارتمان تهیه توبرکولین و مالئین موسسه سرم سازی رازی ، طی سالهای 1388 الی 1390 از استان خراسان
ردیف
نام استان
تعداد نمونه
1
مشهد
30
2
خراسان رضوی
35
3-2- مواد و تجهیزات مورد نیاز
وسایل، مواد و محیط های کشتی که در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفتند به شرح زیر میباشد.
3_2_1_ مواد مصرفی

جدول 3-2: ليست مواد مصرفي *
كشور سازنده
نام شركت
نام مواد
رديف
آلمان
سيگما
آنزيم پروتئيناز K
1
آلمان
مرك
آنزيم ليزوزيم
2
آلمان
رش
آنزيم Taq DNA Polymerase
3
آلمان
رش
MgCl 2 Stock Solution
4
آلمان
رش
بافر PCR بدون كلريد منيزيم
5
آلمان
رش
كيت نشاندار اليگونوكلئوتيد
6
آلمان
رش
Anti Digoxigenin
7
آلمان
رش
سوبسترا BCIP122
8
آلمان
رش
سوبسترا NBT123
9
آلمان
رش
سايز ماركر DNA
10
آلمان
رش
سايز ماركر DNA نشاندار
11
آلمان
رش
آنزيم Alu -I
12
آلمان
رش
آنزيم Pvu -II
13
آلمان
رش
اگارز MP
14
آلمان
مرك
پودرSDS
15
آلمان
رش
Tris Base
16
آلمان
رش
Tris –HCl
17
دانمارك
تکنولوژی
پرايمرIS6110
18
دانمارك
تکنولوژی
پرايمرDR
19
آلمان
رش
Blocking Reagent
20
آلمان
رش
Deoxy Nucleoside Tri Phosphate Set
21
آلمان
سيگما
پودر EDTA
22
آلمان
سيكما
اسيد بوريك
23
آلمان
مرك
مالئيك اسيد
24
آلمان
مرك
نمك NACl مولكولار
25
آلمان
سيگما
پودر CTAB 124
26
آلمان
مرك
سيترات سديم
27
دانمارك
تکنولوژی
پرايمرPGRS
28
المان
مي تسوبيوشي
كاغذ پرينت ژل داك
29
آلمان
مرك
ايزواميل الكل مولكولار
30
آلمان
مرك
كلروفرم مولكولار
31
آلمان
رش
بافر هيبريداسيون
32
آلمان
رش
Dig Wash and Block Buffer Set
33
آلمان
رش
Hybridization Buffer
34
آلمان
رش
كاغذ نايلون ممبرن مولكولار
35
امريكا
BBL
غنی کننده او– ای–دی –سی125
36
امريكا
BBL
پنتا126
37

دکونکس
محلول دکونکس127
38
امريكا
BBL
کیت مایکوپرب **
39
* در این لیست مواد مصرفی روتین آزمایشگاهی باکتریولوژی سل منظور نگردیده است.
** کیت مایکوپرب بی.بی ال128 برای هضم129 (هموژن نمودن)، عفونت زدایی130 و آماده سازی نمونههای تشخیصی مشکوک به مایکوباکتریوم میباشد.
3_2_2_ تجهیزات مورد نیاز
3_2_2_1_ تجهیزات مورد نیاز برای کشت مایکوباکتریوم
3_2_2_1_1_ هود ایمنی میکروبیولوژی مدل SDS-156 ، شرکت بعثت131، ساخت ایران
3_2_2_1_2 _دستگاه سانتریفوژ مدل 16-2، شرکت سیگما132، آلمان
3_2_2_1_3_ میکروسکوپ فلورسنت مدل PP-15، شرکت سارتوریوس133، ساخت آلمان
3_2_2_2 _تجهیزات مورد نیاز برای استخراج DNA
3_2_2_2_1 _میکروسانتریفوژ شرکت سیگما، ساخت آلمان
3_2_2_2_2_ ورتکس مدل TTS-2، شرکت یلو لاین134 ، ساخت آمریکا
3_2_2_2_ 3_ترمو میکسر مدل HBT-2-133، شرکت اپندورف، ساخت آلمان
3_2_2_3_ تجهیزات برای PCR
3_2_2_3_1_ دستگاه ترموسایکلر مدل HLN2-GMBH، شرکت اپندورف135، ساخت آلمان
3_2_2_4_ تجهیزات برای هضم آنزیمی
3_2_2_4_1_ بن ماری شرکت ممرت136، ساخت آمریکا
3_2_2_4_2_ PCR Work Station شرکت کیاژن137، ساخت ایران
3_2_2_5_ تجهیزات الکتروفورز DNA و ساترن بلاتینگ
3_2_2_5_1_ دستگاه ژل الکتروفورز شرکت بیو رد138، ساخت آمریکا
3_2_2_5_2_ منبع تغذیه مدل EPS-600، شرکت پایا پژوهش، ساخت ایران
3_2_2_5_3_ ترانس لومیناتور UV شرکت بیو رد، ساخت آمریکا
3_2_2_5_4_ دستگاه تصویر برداری با نرم افزار ژل پرو شرکت بیو رد، ساخت آمریکا
3_2_2_5_3_ دستگاه هات پلیت و استریر مدل HCR2، شرکت گرهارت139، ساخت آلمان
3_2_2_6_ تجهیزات هیبریداسیون
3_2_2_6_1_ فور برای تثبیت DNA روی غشاء شرکت ممرت آمریکا
3_2_2_6_2_ آون هیبریداسیون مدل Shaken Stack شرکت ترمو هیبید140، ساخت انگلستان
3_2_2_7_ تجهیزات آشکار سازی
3_2_2_7_1_ بن ماری شیکر دار شرکت جی-اف- ال141 ، ساخت آلمان
3_2_2_7_2_ صفحه متحرک شرکت تی-تی-ال142 ، ساخت آلمان
3_2_2_8_ تجهیزات مورد نیاز برای نانودراپ143(سنجش میزان DNA)
3_2_2_8_1_ دستگاه نانودراپ با دستگاه کامپیوتر برنامه ریزی شده، شرکت نانودراپ، ساخت آمریکا
اين پژوهش بر طبق محورهاي زير انجام پذيرفت
مراحل روش تحقیق:
3_3_13_4_1_تهیه گسترش از نمونهها و رنگآمیزی
مشاهده باسيل هاي قرمز رنگ در زمينه آبي نمونه از نظر وجود باسيل اسيدفست مثبت محسوب ميگرديد. گسترش مستقیم در دو مرحله در زمان کشت نمونه انجام میگرفت:
3_4_1_1_ مرحله اول تهیه گسترش به وسیله اسکالپل و پنس از کورتکس و پارا کورتکس عقدههای لنفاوی و از قسمتهای ضایعهدار و مجاور آنها در مورد نمونههای ریه یا بافتهای دیگر ارسالی، تکههایی جدا و در چند قسمت لام فشار داده میشد، تا گسترش تهیه گردد.
3_4_1_2_ مرحله دوم تهیه گسترش قطرهای از محلول تغلیظ شده آماده کشت بر روی لامهائي كه قبلا شماره گذاري شده بودند، قرار داده و گسترش تهیه و سپس به روش کینیون اسید فست به شرح زیر رنگآمیزی شد.
این روش رنگآمیزی به جز نوع فوشین مصرفی و به کار نبردن حرارت با تکنیک ذیل– نلسون معمول، یکسان است. در این روش فوشین بازیک (کینیون) روی لام به مدت 5 دقیقه بدون حرارت، ریخته میشود. سپس بقیه مراحل مشابه روش ذیل– نلسون است. روش مورد استفاده در این تحقیق، همین روش رنگآمیزی بود که در زیر به طور کامل توضیح داده خواهد شد.
1- ثابت نمودن گسترش توسط شعله آتش
2- ریختن متانول روی گسترش به مدت پنج دقیقه
3- شستشوی سطح لام با آب مقطر به نحوی که آب به آرامی از روی لام عبور کند.
4- ریختن فوشین بازیک روی سطح لام به مدت پنج دقیقه
5- شستشوی سطح لام سه مرتبه با آب مقطر
6- رنگ زدایی با اسید الکل (ml 3 اسید کلریدریک نرمال + ml 97 الکل اتیلیک) به مدت سه دقیقه
7- شستشوی سطح لام سه مرتبه با آب مقطر
8- ریختن رنگ زمینه متیلنبلو روی سطح لام به مدت دو دقیقه
سپس لام توسط میکروسکوپ نوری با عدسی نمره 100، برای مشاهده باسیل اسیدفست مورد بررسی قرار میگرفت (تصویر 3-2 و 3-3). در صورت وجود باسیل قرمز رنگ در زمینهای آبی لام از نظر وجود باسيل اسيدفست مثبت قلمداد میشد.

تصویر 3-2 باسیل اسیدفست در روش رنگآمیزی سرد كينیون در لام تهیه شده از سوسپانسیون آماده جهت کشت

تصویر 3-3: باسیل اسیدفست در روش رنگآمیزی سرد كينیون در لام تهیه شده از عقده لنفاوی
3_4_1_3_ تفسیر نتایج گسترش
چنانچه تنها یک تا دو عدد باسیل درسرتاسر هر عدد لام دیده ميشد، آزمایش تکرار میگرديد. اگرچنانچه این تعداد بین 9 – 3 عدد در هر لام باشد، نتیجه (+) و اگر بیش از 10 عدد باسیل در هر لام ديده ميشد باشد، نتیجه (++) است و در حالت کلی، چنانچه در هر شان میکروسکپی بیش از یک باسیل مشاهده ميشد، نتیجه (+++) منظور ميگرديد.
3_4_ 2_کشت نمونهها
به منظور كشت و جداسازي مايكوباكتريومها مراحل زير برای تمامي نمونههاي مورد مطالعه انجام میگرفت.
3_4_2_1_ صلایه نمودن
3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون
3_4_2_3_ سانتریفوژ و خنثی نمودن pH
3_4_2_4_ کشت در لولههای لونشتاین- جانسون حاوي گلیسرین و پیروات
3_4_2_5_ بررسی لوله های کشت شده
در این مرحله با رعایت کلیه شرايط ایمنی در زیر هود ایمنی میکروبیولوژی، به ترتیب زیر کشت انجام می گرفت.
3_4_2_ 1_صلایه کردن نمونهها
در این مرحله با کمک شن سترون شروع به صلایه نمودن نمونه داخل هاون کرده تا یک مخلوط هموژن و یکنواخت حاصل گردد.
3_4_2_2_ آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون
پس از صلایه نمونه، برای آلودگی زدایی و هموژنیزاسیون از سود نرمال و یا از بطریهای مایکوپرب استفاده ميشد.
کیت مایکوپرب برای هضم و عفونت زدایی نمونههای درمانگاهی که احتمالاً حاوی مایکوباکتریومها بخصوص کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس هستند، به کار میرود. اغلب نمونههای درمانگاهی که به آزمایشگاههای مایکوباکتریولوژی برای تأیید کشت و تشخیص قطعی ارسال میگردند، معمولاً به باکتریهای سریع الرشد دیگری آلوده هستند. جهت فراهم نمودن حداکثر امکان رشد مایکوباکتریوم در این گونه نمونهها میبایست مراحل هضم و عفونت زدایی انجام گیرد. محلول ان ـ استیل ـ ال ـ سیستئین144 و سود145، بهترین محلولی است که برای این کار توصیه گردیده است.
از سود برای عمل هموژن نمودن و عفونت زدایی استفاده میگردد. محلول 2% سود مناسبترین غلظت برای بر طرف کردن

پایان نامه
Previous Entries منبع مقاله درباره بیماران مبتلا، استان لرستان، استان همدان Next Entries منبع مقاله درباره مایکوباکتریوم، كشت، میگرفت، میگردید.