منبع مقاله درباره ارزیابی کیفی

دانلود پایان نامه ارشد

100 میلی لیتر آب مقطر رقیق شد. محلول در حرارت اتاق تا یکسال قابل نگهداری است.
• مخلوط SDS / پروتئیناز K
برای هر نمونه 5 میکرولیتر پروتئیناز K (10 میلی گرم پودر پروتئیناز K در 1 میلی لیتر آب مقطر) با 70 میکرولیتر SDS 10 % مخلوط و مصرف شد.
• محلول NaCl/CTAB
1/4 گرم نمک (مرک)، در 80 میلیلیتر آب مقطر حل شد. سپس 10 گرمCTAB در حال گردش به آن اضافه شد. محلول فوق تا 65 درجه سانتیگراد، گرم و حجم محلول با آب مقطر به 100 میلی لیتر رسانیده شد. محلول فوق را میتوان به مدت 6 ماه در هوای اتاق نگهداری نمود.
3_4_7_2_ كنترل و جمع آوري سلولهاي باكتري رشد يافته
سطح لولههاي حاوي كشت باكتريها در فواصل 24-72 ساعت پس از انكوباسيون، از نظر آلودگي احتمالي با ساير باكتريها بررسي و سپس هفتهاي يكبار تا شش هفته كنترل میگرديد. در حدود شش تا هشت هفته پس از انكوباسيون كلنيها به اندازه كافي رشد كرده بودند. سپس با استفاده از يك آنس پلاستيكي استريل تحت شرايط ايمن در زير هود از سطح محيط كشت لونشتین جانسون حداقل به میزان یک لوپ کامل از كلنيهاي باكتري برداشته و به آرامي در درون يك میکروتیوب حاوي 400 میکرولیتر بافر 152TE انتقال داده میشد. به منظور جلوگيري از تشكيل آئروسل و نيز آلودگي درب و سطح خارجي لولهها، اصول ايمني به طور کامل رعايت میگردید.
سوسپانسيون حاصل به مدت 30-20 دقيقه جهت غیر فعال شدن سلولهای باکتری در دمای C° 80 قرار داده میشد. در صورتیکه مراحل استخراج DNA در همان روز ادامه نمییافت، سلولهای باکتری در یخچال و برای نگهداری طولانی مدت در دمای C° 20- نگهداری میشد.
3_4_7_3_ مراحل استخراج DNA
پروتکل زیر دستورالعملی است که توسط ون سولینگن و همکاران در سال 1997 تدوین و WHO آنرا برای استخراج DNA مایکوباکتریها توصیه نموده است. در مطالعه حاضر برای استخراج تمامی نمونهها، از این دستورالعمل پیروی گردید ون سولینگن(1996). برای استخراج DNA به ترتیب مراحل زیر انجام میگرفت.
1- به هر یک از میکروتیوبهای حاوی سوسپانسیون غلیظ و کشته شده مایکوباکتری 50 میکرولیتر لیزوزیم 10 mg/ml اضافه میشد و پس از ورتکس شدن، حداقل یکساعت یا ترجیحا یک شب در Cº 37 گرمخانه گذاری میگردیدند (در این تحقیق تمامی میکروتیوبها یک شب در انکوباتور شیکردار قرار داده میشدند).
2- 75 میکرولیتر مخلوط پروتئیناز K و SDS 10% 153 به هر میکروتیوب اضافه و خیلی کوتاه ورتکس شده و به مدت 10 دقیقه در Cº 65 انکوبه می گردید. طی این دو مرحله پيكره باكتريها توسط آنزيمهاي ليزوزيم، پروتئيناز K و SDS از بين رفته و DNA باكتري آزاد میگردد. (در این تحقیق برای بدست آوردن حداکثر بازدهی، به مدت یک شبانه روز در 55 درجه سانتی گراد انکوباسیون انجام شد).
3- به میکروتیوبها 100 میکرولیتر NaCl 5 مولار اضافه میشد.
4- به هر میکروتیوب 100 میکرولیتر محلول154 CTAB/NaCl که قبلا به مدت 15 دقیقه در فور Cº65 قرار داده شده بود (تا سیال گردد)، اضافه میگردید و تا ظهور محلول سفید شیری رنگ ورتکس میشد. سپس به مدت 10 دقیقه در انکوباتور Cº 65 قرار میگرفت.
• CTAB برای جداسازی بقایای سلولی و دناتوره شدن پروتئینها و همچنین برای ترکیب شدن پلیساکاریدها با CTAB در محلول حاوی اسید نوکلئیک استفاده میگردد.
5- یک حجم (در حدود 750 میکرولیتر) ایزوآمیل الکل– کلروفرم (نسبت 1 به 24) به هر میکروتیوب اضافه و حداقل به مدت 10 ثانیه ورتکس شده و در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه در g 12000 سانتریفیوژ میگردید.
ترکیبات یاد شده باعث جداسازی ترکیب CTAB- پروتئین/پلیساکارید میگردد و سه فاز آبی حاوی DNA در بالا، تركيبات آلي در فاز پائینی و فاز پروتئينی به صورت يك لايه سفيد رنگ در حد واسط فاز آبي و فاز پائینی پدید میآورد. به دلیل عوارض بیماریزای فنل، در روشهای جدید استخراج DNA از فنل استفاده نمیشود (ون سولینگن 1996).
6- با دقت و با کمک سمپلر200 به تدریج و به آهستگی فاز آبي را كه حاوي DNA بود و در قسمت فوقاني دو فاز ديگر قرار داشت (در هر بار حدود 180 میکرولیتر)، برداشته و به یک میکروتیوب دیگر منتقل میگردید. در حين انتقال ممكن بود مقداري پروتئين به همراه محلول حاوي DNA وارد میکروتیوب شود كه برای تخلیص بیشتر DNA مراحل 5 و 6 مجدداً تكرار میشد. نکتهای که از این مرحله به بعد رعایت میگردید این بود که بعلت بزرگ و شکننده بودن DNA ژنومی نمونههای استخراج شده، بعد از لیز سلولها، میکروتیوبها به آرامی تکان داده میشد و هرگز از ورتکس شدید استفاده نمیگردید.
7- به میزان 6/0 حجم (450 میکرولیتر) ایزوپروپانول به فاز آبی حاوی اسید نوکلئیک اضافه و به مدت 30 دقیقه در Cº 20- نگهداری می گردید. در این مرحله بعد از سروته کردن میکروتیوپ کلاف های DNA قابل مشاهده می باشد.
8- میکروتیوبهای حاوی DNA به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق در g 12000 سانتریفیوژ و مایع رویی تا حد امکان دور ریخته میشد و تنها حدود 20 میکرولیتر مایع در انتهای لوله بر روی رسوب باقی میماند.
9- مقدار 1 میلیلیتر اتانول 70% سرد اضافه و میکروتیوبها چند بار سروته میگردید.
10- محلول فوق 5 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ و سپس مایع رویی دور ریخته شده و حدود 20 میکرولیتر مایع بالای رسوب باقی میماند.
11- میکروتیوبها به مدت 1 دقیقه مجدداً سانتریفیوژ شده و با استفاده از سمپلر 20 با احتیاط آخرین 20 میکرولیتر بالای رسوب دور ریخته میشد تا اطمینان حاصل شود که تمام اتانول خارج شده است. طی مراحل 7 الی 11 املاح اضافی نیز حذف میگردید.
12- میکروتیوب حاوی رسوب DNA در دمای اتاق قرار میگرفت تا خشک شود.
13- مجدداً روی رسوب DNA، 20 میکرولیتر بافرTE ریخته می شد تا به خوبی حل گردد.
DNA به دست آمده برای بررسی اولیه توسط الکتروفورز و تخمین میزان DNA در دمای Cº 4 نگهداری میشد و پس از آن در دمای Cº 20- ذخیره میگردید. .
3_4_8_ ارزيابي كيفيت و کمیت DNA استخراج شده
3_4_8_1_ ارزيابي كيفيت DNA استخراج شده
3_4_8_1_1_آماده سازی مواد مصرفی جهت ارزیابی کیفی DNA استخراج شده
• بافر تریس – بورات – EDTA یک برابر(TBE 1X)
89 میلی مول تریس (p.a)، 89 میلی مول اسید بوریک و 5/2 میلی مول EDTA مخلوط و pH محلول روی 2/8 تنظیم شد.حجم نهایی یک لیتر در نظر گرفته شد و محلول فوق پس از اتوکلاو در حرارت اتاق بمدت یکسال قابل نگهداری است.
• بافر نمونه یا Loading buffer 1X DNA همراه با RNase
یک استوک با محلول بافر نمونه 5X DNA همراه با RNase تهیه گردید. 50 گرم گلیسیرین ، 50 میلی مولار تریس HCl با pH 5/7، 5 میلی مولار EDTA 05/0 گرم بروموفنل بلو ، 300 میکرولیتر از RNase 10 میلیگرم در میلیلیتر به مواد بالا آب مقطر اضافه شد تا حجم نهائی محلول به 100 میلیلیتر برسد. محلول بمدت 15 دقیقه در بن ماری 100 درجه قرار گرفت. برای به دست آوردن غلظت یک برابر (این محلول استوک)، به نسبت 1 به 4 با آب مقطر رقیق شد.
• ژل آگارز
عدم دقت در طول مراحل استخراج DNA ژنومي با توجه به اندازه بزرگ آن ميتواند موجب شکستگی DNA گردد و در روي ژل به صورت اسمير بلندي ظاهر شود.DNA مناسب بر روي ژل به صورت باند واضح و مشخص، كمي پائينتر از چاهك مشاهده ميشود. برای مشاهده خلوص و عدم شکستگی در DNA استحصال شده، کیفیت تمام نمونهها با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل آگارز بررسی میشد.
آگارز از یک نوع جلبک دریائی استخراج میشود و یک پلیمر خطی د- گالاکتوز و 3 و 6- آنهیدروز ال- گالاکتوز است. ژل آگارز به وسیله ذوب آن و سپس ریختن داخل یک قالب و اجازه دادن جهت بستن ژل در دمای اتاق تهیه شد. دانسیته آن بستگی به غلظت آگارز دارد. هنگامیکه یک فیلد الکتریکی در سراسر ژل برقرار میگردد ، DNA که دارای شارژمنفی میباشد در pH خنثی به طرف آند (مثبت) مهاجرت میکند. سرعت مهاجرت به پارامترهای متعددی مانند: سایز مولکولی DNA، غلظت آگارز و شکل و ترکیب DNA بستگی دارد.
در این تحقیق ارزیابی كيفيت DNA با روش الكتروفورز در ژل اگارز، به ترتیب زير انجام میشد.
1- مقدار 5/0 گرم آگارز با درجه مولكولار بيولوژي وزن و داخل ارلن 250 ميليليتري منتقل میشد.
2- روي آگارز 50 ميلي ليتر TBE ريخته و بر روي حرارت شعله قرار میگرفت تا اگارز كاملاً حل شده و كاملاً شفاف گردد.
3- محلول فوق از روي شعله برداشته و در فضاي آزمايشگاه قرار داده میشد تا دماي آن به Cº 60-50 برسد.
4- مقدار 10 ميكروليتر اتيديوم برومايد رقيق شده (5/0 ميكروگرم در ميليليتر) به محلول آگارز اضافه میشد، بنحوی که رنگ آن پوست پيازي گردد.
5- دو سمت باز سيني مخصوص تانك الكتروفورز (محفظه ژل) با چسب نواري كاغذي به دقت مسدود میشد. لازم به ذکر است که اگر محدود نمودن لبههای سيني تانك توسط چسب با دقت انجام نمیگرفت باعث خروج ژل از محفظه ژل ميگردید.
6- آگارز در حرارت Cº 60-50 به آرامي درون محفظه ژل ريخته میشد. اگر دماي ژل آگارز پائين میبود باعث غير يكنواختی در هنگام بستن ژل ميگردید و در اين صورت جريان به خوبي از ژل عبور نمينمود و اگر دماي آن بالا بود باعث باز شدن چسبها و نشت آگارز ميگردید.
7- قبل از ريختن آگارز در سيني ژل، شانه ژل با تعداد چاهك مناسب در درون سيني ژل قرار گرفت. در هنگام قرار دادن شانه، فاصله مناسب شانه از طرفين و پائين، نسبت به محفظه ژل رعايت میگردید.
8- بعد از بستن ژل، شانه به آرامي و با دقت از درون ژل خارج میشد.( این کار به نحوی صورت می پذیرفت که موجب بريدگي ژل و بهم ریختگی چاهكها، نگردد).
9- نوار چسب انتهاي سيني به آرامي كنده میشد تا در هنگام قرار گرفتن در تانك الكترفورز جريان برق به خوبي برقرار گردد.
10- سيني ژل آگارز درون تانك الكترفورز به نحوی قرار داده میشد که جهت چاهك ژل در طرف كاتد (الكترود منفي یا سياه) تانك الكترفورز قرار میگرفت.
11- درون تانك الكترفورز بافر TBE ريخته میشد. لازم به ذکر است که همیشه غلظت و نوع بافر مورد استفاده در تهيه ژل و تانك الكترفورز يكسان بود.
12- مقدار 25 ميكروليتر از مخلوط DNA و بافر نمونه به آرامي درون چاهكها ژل ريخته میشد (نسبت DNA به بافر نمونه 1 به 5 ميباشد).
13- درب تانك الكترفورزگذاشته وتانك الكترفورزبه منبع الكتريكي متصل ودستگاه باولتاژ 80 روشن شد.
14- بعد از گذشت زمان كافي (تقريباً 5/0-1 ساعت) كه رنگ بروموفنل بلو نزديك به انتهاي ژل میرسيد، دستگاه الكترفورز خاموش میشد.
15- ژل به آرامي از محفظه ژل (سيني تانك الكترفورز) جدا و بر روي دستگاه ترانس لوميناتور قرار داده و DNA از نظر ميزان و كيفيت، بررسي میشد.
16- در صورت مناسب بودن كيفيت DNA از ژل عكس برداری و مشخصات آن در كامپيوتر ثبت و ذخیره میشد. ميتوان از سايز ماركر مناسب جهت تخمين ميزان DNA استفاده نمود و با توجه به الگوي نمونههاي استاندارد DNA مایکوباکتریوم، غلظت تقریبی DNA را تخمين زد. در این تحقیق به دلیل موجود بودن دستگاه نانودراپ و تعیین بسیار دقیق غلظت DNA از تخمین آن به این روش صرف نظر گردید.
3_4_8_2_ ارزيابي کمیت DNA استخراج شده برای انجام PCR و RFLP
تخمین غلظت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ
دستگاه نانودراپ متشکل از یک بدنه و دو بازو می باشد. یکی از بازوها روی بدنه آن ثابت بوده و دیگری حول محوری حدود 90 درجه قابلیت جابجائی و حرکت دارد که به وسیله فیبر نوری به بدنه متصل است و ضمناً روی هر کدام از بازوهای دستگاه محلی جهت قرار گرفتن مایع، برای اندازه گیری قرار دارد. این دستگاه بر اساس سنجش طول موج به دست آمده از نمونه مورد ارزیابی کار میکند (تصویر 3-7).

تصویر3-7: دستگاه نانودراپ
مراحل تعیین کمیت DNA با استفاده از این دستگاه به صورت زیر انجام میپذیرفت.
1- دستگاه کامپیوتر و نانودراپ روشن میگردید و گزینه ND-1000-V3, 2, 1 انتخاب و برنامه اسید نوکلئیک اجرا میشد (تصویر 3- 8).

تصویر

پایان نامه
Previous Entries منبع مقاله درباره مایکوباکتریوم، كشت، میگرفت، میگردید. Next Entries منبع مقاله درباره ارزیابی کیفی