منبع مقاله درباره ارزیابی کیفی

دانلود پایان نامه ارشد

3- 8: صفحه گزینه های برنامه های نانودراپ
2- پایه مخصوص قرار گرفتن محلول نمونه با 1-2 میکرولیتر آب مقطر شستشو میگردید. برای اینکار ابتدا بازوی متحرک به سمت بالا و عقب دستگاه حرکت داده میشد تا به میله عقب تکیه کند. سپس 2 میکرولیتر آب مقطر روی پایه پائینی در بازوی ثابت قرار میگرفت و بازوی متحرک به سمت پائین و جلو به آرامی حرکت داده میشد تا با آب مقطر تماس حاصل نماید. به آرامی بازوی متحرک چند بار فشرده میشد تا آب مقطر کاملا پایه مخصوص قرار گرفتن نمونه را شستشو دهد و سپس پایهها با کاغذ صافی خشک میگردید.
3- یک قطره آب مقطر در حدود 1-2 میکرولیتر بین دو پایه مخصوص نمونه قرار میگرفت و گزینه OK انتخاب میگردید. سپس دستگاه عملیات لازم را انجام داده و نموداری که متشکل از دو محور عمود بر هم (محور افقی میزان طول موج و محور عمودی مقدار جذب) و یک خط عمودی برای مشخص نمودن پیک منحنی است، نشان میدهد. خط عمودی پیک منحنی با درگ کردن بر روی 260 نانومتر (تعیین میزان اسیدنوکلئیک در این طول موج است) تنظیم میگردید (تصویر3-9) .

تصویر 3-9: نحوه شروع کار و تنظیم دستگاه با آب مقطر
4- جهت بلانک نمودن دستگاه، پایه مخصوص نمونه با کاغذ صافی خشک شده و سپس مقدار 1-2 میکرولیتر محلولی که DNA در آن رقیق شده بر روی پایه فوق قرار میگرفت و گزینه بلانک انتخاب میشد.
5- برای اندازه گیری نمونه، پایه مخصوص خشک شده و مقدار 1-2 میکرولیتر محلول نمونه روی پایه مخصوص قرار و مشخصات آن در محل ثبت مشخصات ذخیره میگردید و گزینه اندازه گیری (Measurement) کلیک میشد. سپس دستگاه عملیات قرائت و اندازه گیری نمونه را به اتمام رسانده و تخمین میزان DNA را نشان میداد (حدود 10 ثانیه). پس از تخمین میزان DNA، منحنی مربوط به مشخصات نمونه آزمایش شده، در محورهای ذکر شده ظاهر میگردید و میزان دقیق DNA بر حسب نانوگرم بر میکرولیتر در کادر مستطیل شکل پائین و سمت راست کادر نوشته میشد. همچنین در کادرهای دیگر مانیتور کلیه جذبهای ضروری مورد نیاز برای عملیات مولکولی توسط این دستگاه محاسبه و ارائه میگردید. به طور مثال میزان جذب در 260 نانومتر (مقدار اسیدنوکلئیک) بر 280 نانومتر (مقدار پروتئین) که برای انجام عملیات RFLP مناسب، این نسبت میبایستی بین 2/2-8/1 باشد (تصویر 3-10).

تصویر 3-10: نمودار طول موج DNA نمونه و محاسبات ضروری برای کارهای مولکولی
3_4_8 _3_ PCR براساس پروتکل WHO
به عبارت دیگرPCR يك روش تكثير آنزيماتيك براي يك قطعه اختصاصي DNA ميباشد. در اين واكنش از 2 پرايمر اوليگونوكلئوتيدي در دو طرف ناحيهاي كه DNA بايد تكثير و با رشته هاي مكمل هيبريد گردد، استفاده ميشود. سنتز توسط آنزيم DNA پليمراز از روي ناحيهاي از DNA هدف كه بين دو پرايمر محدود گشته انجام ميگيرد. در هر چرخه موفق، anealing پرايمرها و سنتز توسط آنزيم انجام شده و مقدار DNA به صورت تصاعد هندسي افزايش ميگردد.
در این تحقیق بر روی DNA استخراجی از تمامی جدایهها ، با استفاده از پرايمرهاي1-INS و 2- INS كه نشان دهنده حضور سکانس IS6110 می باشد و مختص خانواده كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس ميباشد PCR انجام گرفت. بدين منظور براي هر DNA يك محلول واكنش155 تهيه و در دستگاه ترموسايكلر قرار گرفت و به دستگاه برنامه داده میشد. سپس محصول PCR الكتروفورز گرديد و در نهايت باندهاي 245 جفت بازي براي هر نمونه بر روي ژل مشاهده و با شاهد مثبت که DNA استخراج شده از باکتری مایکوباکتریوم بویس ب.ث.ژ. (1173 P2) بود و از قبل مثبت بودن آن مورد تائید قرار گرفته بود، مقایسه میگردید. نهایتاً از ژل تهیه شده عكس گرفته شده و بدین ترتیب قرار داشتن تمام نمونههاي مورد آزمايش در خانواده کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مورد تاييد قرار گرفت. ردیف پرایمرهای فوق به شرح زیر است (ون سولینگن، 1997).
INS-1 (631-650) 5’([CGT GAG GGC ATC GAG GTG GC )3’
INS-2 (856-875) 5’([GCG TAG GCG TCG GTG ACA AA) 3’
مواد متشکله آزمایش PCR در میکروتیوبهای 5/1 میلیلیتری ریخته میشد و برای جلوگیری از اتلاف زمان بر حسب تعداد نمونه مورد آزمایش یک مخلوط اصلی156 تهیه شد. برای انجام هر واکنش PCR مواد مورد نیاز به شرح زیر با یکدیگر مخلوط می شدند.
3_4_8_3_1 مراحل PCR روی نمونه های DNA استخراج شده
بافر 10x PCR حاوی MgCl2 5 میکرولیتر
مخلوط dNTP (هر dNTP ؛ 5/2 میلی مول) 4 میکرولیتر
پرایمرجلو برنده (50 نانوگرم در میکرولیتر) 5 میکرولیتر
پرایمر پس ران (50 نانوگرم در میکرولیتر) 5 میکرولیتر
1- به مخلوط فوق مقدار 25/0 میکرولیتر(25/1 واحد) آنزیمDNA پلیمراز اضافه میگردید و پس از ورتکس، مخلوط روی یخ نگهداری میشد.
2- مخلوط PCR به میکروتیوب های PCR با تقسیمات 20 میکرولیتری انتقال داده میشد.
3- حدود 150-100 نانوگرم از هر DNA استخراج شده به مخلوط PCR اضافه میگردید و حجم نهائی با آب مقطر به 50 میکرولیتر رسانیده میشد.
4- بر اساس پروتکلی که پیروی می شد برای جلوگیری از تبخیر، لازم بود روی هر میکروتیوب حدود 75 میکرولیتر (دو قطره) روغن معدنی ریخته شود ولی به دلیل در پوش داشتن لید در ترموسایکلر مورد استفاده، که در دمایCº105 تنظیم گردیده بود افزودن روغن معدنی ضرورتی نداشت.
5- مخلوط فوق به کمک یک میکروسانتریفوژ در g 12000 به مدت 5 ثانیه سانتریفوژ گردیده و سپس میکروتیوبها داخل دستگاه ترموسايكلر گذاشته میشد.
6- برنامه دما و زمان شامل جدا شدن دو رشته DNA (دناتوره شدن)، چسبیدن پرایمرها به هر زنجیره (آنیلینگ) و ساخت زنجیره مورد نظر (سنتز) مطابق جدول 3-5 اجرا میگردید.
جدول 3-5: برنامه دما، زمان و چرخه ترموسایکلر (ون سولینگن، 1996)
مراحل PCR
دما
زمان
تعداد سیکل
دناتوراسیون اولیه
94 درجه سانتیگراد
3 دقیقه
یک سیکل
دناتوراسیون
94 درجه سانتیگراد
1 دقیقه

25 سیکل
آنیلینگ
65 درجه سانتیگراد
1 دقیقه

بسط زنجیره
72 درجه سانتیگراد
1 دقیقه

بسط نهائی
72 درجه سانتیگراد
4 دقیقه
یک سیکل

برای كنترل مثبت از DNA استخراج شده باکتری مایکوباکتریوم بویس ب.ث.ژ. (1173 P2) که قبلاً مثبت بودن آن تائید شده بود، استفاده میشد و كنترل منفي، میکروتیوب حاوی تمامی اجزاء میکروتیوب کنترل مثبت و فاقد DNA الگو بود که به جای DNA، آب مقطر اضافه میشد.
3-4-9- الكتروفورز محصول ‍PCR
جهت بررسي نتیجه واكنشPCR ، محصول به دست آمده PCR الكتروفورزمیگرديد. قطعات PCR میبايستي با استفاده از پرايمرهاي INS-2 و INS-1 به اندازه bp 245 (جفت باز) طول داشته باشد كه با قرار دادن يك ماركر مناسب، نتيجه بررسي میشد.
:RFLP
3_4_10_ هضم DNA کروموزمی به وسیله آنزیم Pvu II
آنزیم محدود کننده آندونوکلئاز توالیهای کوتاه DNA را شناسایی نموده و در مکانهای خاصی داخل و یا در مجاورت سکانس شناسایی شده DNA دو رشتهای برش ایجاد مینماید. این برش موجب شکلگیـری گسستـگی در قطعات DNA میگـردد. آنزیـم II Pvu در سکانسـهای /
CAG|CTG
GTC|GAC
برشهایش را ایجاد مینماید. در این تحقیق نمونه های DNAجدایههای مایکوباکتریوم بویس، توسط آنزیمII Pvu تحت تاثیر هضم قرار گرفته و سپس کلیه مراحل الکتروفورز، انتقال به غشاء (ساترن بلاتینگ)، هیبریداسیون با پروبهای PGRS و DR (به طور جداگانه) و آشکارسازی عیناً بر روی آنها انجام میپذیرفت.
این نمونه ها هضم آنزیمی گردیده (با آنزیم Pvu II) و غشاء پس از انتقال DNA به آن با دو پروب مورد هیبریداسیون قرار میگرفت (تصویر 3-11 ).

تصویر 3-11: مراحل اجرائی الکتروفورز DNA هضم شده، ساترن بلات، هیبریداسیون و آشکارسازی (Cousins 1998)
3_4_10_1_ روش کار هضم DNA کروموزومی با آنزیمهای محدود کننده Pvu II
در حدود 2 میکروگرم از نمونههای DNA (با استفاده از دستگاه نانودراپ پس از ارزیابی کیفیت DNA و نیز قبل از انجام هضم آنزیمی، میزان دقیق DNA تعیین میگردید) و حدود 2 میکروگرم از DNA ژنومی مایکوباکتریوم بویس ب.ث.ژ سویه رفرانس PT 123 با استفاده از Pvu II در یک میکروتیوب (اپندورف) به حجم نهائی 20 میکرولیتر رسانیده و هضم میگردید.
X μl DNA (2 μg)
2 μl 10 x M buffer
Y μl (Water to adjust final volume on 20 μl)
1 μl Pvu II (10 U/μl )
———————————–
20 μl
در فرمول بالا X بیانگر میزان حجمی DNA استفاده شده و Y بیانگر میزان آب مقطر مورد استفاده میباشد.
مواد فوق به مدت 5 ثانیه در یک میکروسانتریفیوژ در دور g 12000 سانتریفیوژ و حداقل به مدت یک ساعت در 37 درجه سانتیگراد (ترجیحاً یک شب بهتر است و در این تحقیق به مدت یک شب در بن ماری Cº37 قرار گرفت) انکوبه میگردید.
• نکاتی که در هضم آنزیمی DNA به آن توجه میشد
• اگر غلظت DNA یک نمونه از 2000 میکروگرم در میلیلیتر بیشتر بود، میزان مورد نیاز برای هضم آنقدر کم بود که پیپت کردن آن را مشکل میساخت. در این موارد ترجیحا DNA را رقیق نموده و آنرا دوباره تعیین غلظت مینمودیم و بالعکس اگر غلظت DNA کمتر از 50 میکروگرم در میلیلیتر بود، غلظت آن جهت هضم بسیار پائین بود لذا بایدDNA جدید استخراج میکردیم و از این DNA صرف نظر میکردیم.
• آندونوکلئاز محدود کننده به حالت های بافر بسیار حساس است. بنابر این قبل از اضافه کردن آنزیم، بافر محدود کننده، آب و DNA را با یکدیگر مخلوط نموده و این محلول را چند ثانیه با میکروسانتریفوژ اسپین (دور تند سانتریفوژ) سانتریفوژ کرده و سپس آنزیم را اضافه میکردیم.
• حجم نهائی آنزیم محدود کننده اضافه شده نباید از 10 % بیشتر میشد، در غیر این صورت گلیسرول آنزیم موجب نگهداری بافر شده و در واکنش اختلال ایجاد مینمود.
• هنگامیکه تعداد زیادی نمونه DNA را با همان آنزیم هضم مینمودیم، میزان کل آنزیمی را که مورد نیاز است محاسبه (3 – 2 واحد آنزیم برای 1 میکروگرم DNA )و ابتدا آنزیم را در بافر محدود کننده 1X تهیه و بعد مخلوط آنزیم/بافر را در میکروتیوبهای واکنش تقسیم و سپس نمونهها را در مخلوط واکنش پیپت میکردیم. این روش باعث صرفهجوئی زیادی در زمان و آنزیم میشد.
3_4_11_ جداسازی قطعات DNA به وسیله الکتروفورز
الکتروفورز DNA هضم شده، جهت جدا سازی قطعات DNA با وزن مولکولی در حدود 5/0 تا 25 کیلو باز در ژل آگارز برای مقاصد تجزیهای– تحلیلی و کارهای مقدماتی صورت می پذیرفت و در ادامه قطعات جدا شده به غشاء نایلونی با شارژ مثبت (ساترن بلاتینگ) انتقال مییافت.
بعد از آماده سازی ژل، 5 میکرولیتر بافر نمونه 5X DNA همراه با RNase به 20 میکرولیتر DNA نمونه هضم شده اضافه شد (غلظت نهائی بافر نمونه 1X شد). همچنین 1 میکرولیتر بافر نمونه 5X DNA همراه با RNase به 4 میکرولیتر سایز مارکر نشاندار با دیگوکسیژنین اضافه میشد.مقدار 5 میکرولیتر از مخلوط سایز مارکر نشاندار با دیگوکسیژنین در اولین خانه ریخته شد. در دومین خانه 25 میکروگرم DNA کروموزومی هضم شده با Pvu II از سویه رفرانس 1173 P2 مایکوباکتریوم بویس ریخته میشد. از سومین خانه تا خانه انتهائی میزان مورد کاربرد از هر یک از نمونه های DNAهای هضم شده با Pvu II ریخته میشد. الکتروفورز ولتاژ تا 8/. ولت بر سانتیمتر (25ولت) برای یک شب ادامه می یافت.
3_4_12_ ساترن بلاتینگ
3_4_12_1_ آماده سازی محلول های مورد نیاز ساترن بلاتینگ
• محلول خنثی کننده157
5/0 مول تریس HCl، با3 مول نمک مخلوط گردیده و با آب مقطر حجم آن به یک 1 لیتر رسانیده و سپس pH آن روی 5/7 تنظیم گردید.
• بافر SSC بیست برابر (20x SSC)
مقدار 5/175 گرم کلریدسدیم خالص به همراه 2/88 گرم سیترات سدیم در یک لیتر آب مقطر حل و سپس pH آن روی 7 تنظیم شد. برای تهیه 2x SSC یک حجم از 20x SSC به 9 حجم آب مقطر اضافه شد. برای تهیه 5x SSC یک حجم از 20x SSC به 3 حجم آب مقطر اضافه شد.
• محلول Depurinationn
5 ccاز محلول HCL 10 نرمال را به 195cc آب مقطر اضافه کردیم.
• محلول

پایان نامه
Previous Entries منبع مقاله درباره ارزیابی کیفی Next Entries منبع مقاله درباره میکروتیوب، میگرفت.، موئینهای، SSC