منبع مقاله درباره آذربایجان غربی، استان خراسان، استان اصفهان، استان گیلان

دانلود پایان نامه ارشد

بعد از استخراجDNA از سلول، ژنوم باكتري توسط آنزيم هاي محدودكننده مورد هضم آنزيمي قرار مي‌گيرد كه اين آنزيم‌ها سكانس‌هاي خاصي از باكتري را برش داده و DNA را به قطعات كوچك تقسيم مي‌كنند و اين قطعات توسط ژل آگارز در ميدان الكتروفورز از يكديگر جدا مي‌شوند. در اين تحقيق و با توجه به تحقيقات صورت گرفته ديگر محققين و روش استاندارد پيشنهاديWHO ارائه شده توسط ون سولينگن براي هضم DNA از آنزيم PvuII استفاده گرديد.
در يك تحقيق كه توسط رومانو و همكاران انجام گرفت از 82% جدايه هاي مايكوباكتريوم بويس گاوهاي آرژانتين، تنها يك كپي از IS6110 مشاهده شده بود و الگوي حاصل به صورت مونومورفيك بود.(ابرایان، 2000)
در تحقيق سينگ و همكاران تحت عنوان ” انگشت نگاري ژنومي نمونه هاي كلينيكي مايكوباكتريوم بويس و مايكوباكتريوم توبركلوزيس به روش RFLP ” در بيشتر سويه هاي مايكوباكتريوم توبركلوزيس تعداد 8 كپي از IS6110 ديده شده و در جدايه هاي مايكوباكتريوم بويس تنها يك كپي از IS6110 در مكان 7/1 كيلو باز وجود دارد. (راستوجی، 1993)

در تحقيقات مولكولار تايپينگ كه توسط گيتيرز و همكاران در سال 1995 برروي40 سويه مايكوباكتريوم بويس جدا شده از گاو و بز در اسپانيا با تكنيك RFLP و با استفاده از پروب‌هاي IS6110 و PGRSو DR انجام گرفت، بيشتر سويه هاي جدا شده از گاو با ماركر IS6110 تنها يك كپي را نشان دادند.(54) در صورتي كه استفاده از ماركرهاي PGRSو DR بيشترين كپي را نشان داد.(فانگ و همکاران، 1997)
با توجه به اينكه ايران در قاره آسيا قرار گرفته است احتمال داشتن الگوي مشابه‌اي با تحقيقات انجام گرفته در هند وجود دارد، و همچنين تحقيقاتي كه توسط رفيعي در4 استان مركزي، ‌البرز، گلستان و گيلان به روش RFLP با آنزيم PvuIIو هيبريدسازي با IS6110 انجام گرفت، نشان داد كه بيشترين تعداد كپي ها در استان گيلان با 15 كپي بوده است و با توجه به تعداد كم كپيIS6110 كه توسط رفيعي در استان هاي ديگر و همچنين با توجه به توصيهOIE و وجود تعداد كپي بيشتر با ماركر هايPGRS و DR، لذا از اين دو ماركر در تحقيق حاضر استفاده شد.(رفیعی، 1391)
با توجه به وجود يك كپي از سكانسIS1081 و IS6110در بيشتر مايكوباكتريوم بويسهاي جدا شده از گاوهاي سراسر دنيا به ويژه آسيا به غير از اسپانيا، از هيبريد نمودنDNA هضم شده با پروب IS6110صرفنظر گرديده است. در مطالعات دیگر ژنوتایپینگ بر روی مایکوباکتریوم بویس های جدا شده از استرالیا، کانادا، ایرلندو ایران با استفاده از چهار روشIS6110-RFLP ، RFLP–DR، PGRS-RFLPو اسپولیگوتایپینگ، به صورت مقایسهای انجام پذیرفت. نتايج این مطالعه نشان مي دهد که PGRS متمایز کننده ترین مارکر(77 نوع را از میان 273 ایزوله تعیین نمود) مي باشد و بدنبال آن DR-RFLPو اسپولیگوتایپینگ(35 نوع) و IS6110(23 نوع) قرار دارند.(کولینز، 1991)
در تحقيق حاضر تعداد65 نمونه از عقده هاي لنفاوي گاوهاي توبركولين مثبت استان خراسان ارسالي به بخش توبركولين موسسه رازي، طي سال‌هاي 1388-1390 مورد بررسي قرار گرفتند. نمونه هاي ارسالي به آزمايشگاه، پس ازآلودگی زدایی، جهت جداسازي اولیه برروي تمام محیطهاي لونشتاين جانسون گليسيرن دار و پيروات دار و در دماي 37 درجه سانتيگراد به مدت 4 هفته کشت داده شدند. اگرچه کشت آزمون قطعی براي تایید عفونتهاي مایکوباکتریال محسوب میشود ولی این روش ممکن است هفته ها یا ماه ها طول بکشد.(فرنیا، 1387)
سپس با استفاده از آزمايش PCR با سكانس IS6110 و مشاهده باند bp245، تعداد 12 جدايه كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس شناسايي شد. براي اطمينان از قرار گرفتن اين ايزوله ها در گونه مايكوباكتريوم بويس، بر روی 8 نمونه مناسب آزمايش PCR-RFLPانجام گرديد و اثبات شد كه اين جدايه ها به گونه مايكوباكتريوم بويس تعلق دارند.
در ادامه تحقيق، DNA جدايه هاي مايكوباكتريوم بويس با تكنيك RFLP با استفاده ازآنزيم محدودگرPvuII مورد هضم آنزيمي قرار گرفتند و پس از انجام مراحل ساترن بلاتينگ و هيبريداسيون با پروب‌هاي (تكرارهاي مستقيم) DRو (توالي هاي غني از CG) PGRS و مرحله تشخيص و شناسايي، به ترتیب 3 و 2 الگو بدست آمد.
در تحقيق ديگري كه در سال 1385 بر روي سويه‌هاي مايكوباكتريوم بويس جدا شده از سراسر كشور با كمك تكنيك RFLP و با استفاده از آنزيم‌هاي محدودگر آندونوكلئاز PvuII و AluI انجام پذيرفت از 124 جدايه مايكوباكتريوم بويس هضم شده با آنزيم PvuII و هيبريد شدن با ماركرهاي PGRS و DR به ترتيب7 و 8 الگو مشاهده شد كه الگوي غالب PP-1وPD-1بوده‌اندكه اين الگو، الگوي مشابه با BCG1173P2 را به نمايش گذاشت و از تعداد 59 جدايه مايكوباكتريوم بويس هضم شده با آنزيم AluI و هيبريد شدن با ماركرهاي PGRS و DR تعداد 10 و 8 الگو به دست آمد كه الگوي غالب AP-4بود. (علوی، 1388)
ريگاني و همكاران در سال 1387 برروي جدايه هاي مايكوباكتريوم بويس حاصله از گاوهاي آلوده كشور، به كمك تكنيكRFLPيك تحقيق مقايسه‌اي با استفاده از آنزيم‌هاي PvuIIو AluI و ماركر PGRS انجام دادند. بطوريكه از تعداد 25 جدايه مايكوباكتريوم بويس با استفاده از آنزيم PvuII تعداد 2 الگو شناسايي شد كه الگوي غالب در آنPP-1 بوده است و هنگام استفاده از آنزيمAluI تعداد 5 الگو شناسايي شد كه الگو غالب، الگو AP-4 بوده است.(رفیعی، 1392)
حاتمی و همکاران در سال 1391 برروی جدایه های مايكوباكتريوم بويسحاصله از گاوهای آلوده استان همدان، به كمك تكنيكRFLP تحقیقی با استفاده از آنزيم‌ PvuII و ماركرهایPGRS و DR انجام دادند. از 43 جدايه مايكوباكتريوم بويس هضم شده با آنزيم PvuII و هيبريد شدن با ماركرهاي PGRS و DR از هر کدام 1 الگو مشاهده شد كه شامل PP-1وPD-1بوده‌اندكه اين الگو، الگوي مشابه با BCG1173P2 را به نمايش گذاشت.
در تحقيقي كه مصوري و همكاران در سال 2011 با عنوان ” ژنوتايپنگ مولكولي و اپيدميولوژي سويه‌هاي مايكوباكتريوم بويس بدست آمده از گاوهاي ايران ” انجام دادند از تعداد 140 نمونه كشتار شده گاوميش هاي توبركولين مثبت استان آذربايجان غربي با استفاده از روشاسپوليگوتايپينگ تنها يك جدايه مشاهده كرده‌اند.(15) همچنين از تعداد 56 جدايه مايكوباكتريوم بويس ازگاوهاي راكتور مثبت در 11 استان مختلف كشور به روش RFLP و با استفاده از آنزيم PvuII و هيبريد سازي با ماركرهاي PGRS و DR به ترتيب 7 و 9 الگو بدست آمد كه بيشترين فراواني مربوط به الگويPP-1 بود. همچنين براي برخي از استانها الگوهاي منحصربفردي بدست آمد كه خاص آن استان بود و در استان‌هاي ديگر مشاهده نشده است. بطور مثال الگوهای به دست آمده با استفاده PGRSدر استان آذربایجان غربی(PP-3) ، استان گیلانPP-4) )، استان اردبيل(PP-5وPP-7 ) و در استان اصفهان ((PP-6بود بطوريكه الگو PP-2يك الگو منحصر به فرد در جدايه گاوميش هاي استان آذربايجان غربي بوده است. همچنين هنگام استفاده ازآنزيم هضمي AluI و هيبريدسازي با ماركر PGRS و DR به ترتيب 10 و 7 الگو مورد شناسايي قرار گرفتند.(فرنیا، 1387)
نتايج حاصله از تحقيق حاضركه بر روي 8 جدايه مايكوباكتريوم بويس به روش RFLP PGRS-و RFLP DR-انجام گرفته است نشان مي‌دهد كه از اين تعداد 8 جدايه مايكوباكتريوم بويس هضم شده با آنزيم PvuII و هيبريد شده با ماركر PGRS، تعداد 2الگو و هنگام استفاده از ماركر DR3 الگو بدست آمد و الگوهاي غالب در اين تحقيقPP-1 وPD-1 است. همچنين لازم به ذكر است كه الگوهاي غالب و همچنين تمام الگوهاي بدست آمده به الگوي مايكوباكتريوم بويسBCG شبيه مي‌باشند.
ژنوم مایکوباکتریوم توبركلوزيس كمپلكس، شامل زنجيره مضاعف و دايره‌اي DNA بوده که تقریبا دارای 4/4 ميليون جفت باز مي‌باشد. میشل(2008) ويژگي ديگر ژنوم مایکوباکتریوم توبركلوزيس كمپلكس، عدم تنوع و تغییر پذیری در آن مي‌باشد. راستوجی(1996) كه اين حالت به دلیل فقدان کنژوگاسیون و ترانسفورماسیون بین مایکوباکتریهای پاتوژنیک و محدود بودن تماس با باکتریوفاژها جهت ترانسدوکسیون شناخته شده است. مطالعات آزومال مشخص نمود که DNA ژنوم باکتری دارای مقادیر بالای G+C میباشد و میزان آن تقريباً 65% برآورد شده است. بادینگ هایس و همکاران184 (1990) استفاده از ماركر هاي ژنتيكي PGRS كه داراي توالي غني از GC مي باشند و رونوشت هاي مستقيم DR، ماركرهاي سودمندي در RFLP انواع سويه هاي كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس مي‌باشند.
با مقايسه الگوهاي بدست آمده از سويه هاي جدا شده از نقاط مختلف كشور در تحقيقات مصوري و ريگاني كه در طي سالهاي 1382 تا 1387 انجام گرفته است اين تحقيقات در سال 1387 نشان داد كه استفاده از تكنيك RFLP و آنزيم PvuII و هيبريدسازي با ماركرهاي PGRSوDR الگوهاي غالبي شناسايي شدند كه اين الگوهاي غالب در سراسر كشور شامل PP-1وPD-1 مي باشند، بطوريكه اين الگوها با الگوي بدست آمده از سويه مايكوباكتريوم بويسBCG استاندارد 1173P2 شباهت دارند. الگوي هاي غالب مذكور كه در استانهاي تهران، قزوين، ‌لرستان، كردستان، همدان،‌ اصفهان و اردبيل مشاهده شده اند كاملا شبيه الگوي بدست آمده از مايكوباكتريوم بويسBCG بودند. همچنين الگوي هاي غالب مشاهده شده هنگام استفاده از آنزيم AluI و هيبريداسيون با ماركرهاي PGRS و DR، AP-4 و AD-2بوده اند كه يك الگوي غالب در استانهاي آذربايجان غربي، قزوين، تهران، همدان، چهارمحال و بختياري، قم، كردستان و اردبيل بودند. علاوه بر اين الگوي غالب AP-4، با الگوي بدست آمده از مايكوباكتريوم بويسBCG متفاوت بود. همچنين الگوي غالبAD-2 ، با الگويAD-1 كه متعلق به مايكوباكتريوم بويسBCG مي‌باشد شباهت نداشت. نتيجه كلي تحقيق فوق نيز نشان داد كه الگوهاي بدست آمده از هضم آنزيمي با PvuIIو AluI تقريبا در تمامي سويه ها مشابه مي‌باشند و مي‌توان با استفاده از آنزيم AluI وپروب PGRS، تفاوتBCG را از جدايه ها مشخص نمود.(علوی، 1388)
همچنين در سال 1387 از تعداد 25 جدايه مايكوباكتريوم بويس مورد مطالعه، با استفاده از تكنيك انگشت نگاري ژنومي و هضم آنزيمي با آنزيمPvuII و هيبريد شدن با PGRS، 2 الگوي متفاوت شناسايي شد كه الگوي غالبPP-1بود و اين الگوي غالب شناسايي شده در استانهاي تهران، يزد، البرز،كردستان، همدان، ‌اصفهان، مركزي، مازندارن، آذربايجان شرقي و فارس با الگوي بدست آمده از سويه مايكوباكتريوم بويسBCG استاندارد P21173شباهت داشت. اما از هضم آنزيمي اين سويه ها به كمك آنزيم AluIو هيبريد سازي با PGRS،5 الگو متفاوت بدست آمد كه الگوي غالب AP-4بود بطوريكه الگوي غالب در استانهاي يزد، كردستان، تهران، ‌همدان و مركزي شناسايي شد كه قبلا در سال 1385 نيز مشاهده شده بودند.(فرنیا، 1387)
مايكوباكتريوم بويس جزء كمپلكس مايكوباكتريوم توبركلوزيس است كه ازراسته اكيتنوماسيتالز مي باشد همچنين اين باكتري داراي ديواره سلولي آرابينوز و مزوديآمينو پیمیلیک بوده و درصد بازهاي گوانين و سيتوزين در اسيد هستهDNA آنها در حدود 62 تا 70 درصد مي‌باشد و بويژه ميزان CG در گونه مايكوباكتريوم بويس حدود80% مي‌باشد. ژنوم مايكوباكتريوم بويس داراي زنجيره مضاعف DNAبا 4/4 ميليون جفت باز هست و با استفاده از روش RFLP، DNAمايكوباكتريوم بويس به قطعات مختلف شكسته مي‌شود كه اين قطعات داراي بازهاي يكساني مي‌باشند از اين‌رو استفاده از پروب هايي كه DNA آنها نشاندار شده است تنها در سکانس‌هاي خاصي از بازها كه چندين بار در ژنوم باكتري تكرار شده‌اند، آنها را شناسايي و آشكار مي‌نمايد. اين امر سبب مي‌گردد تا يك پليمورفيسم و تمايز خوب بين سويه‌ها با مشاهده باندهاي اصلي نمايان شود. اگر در طول رشته DNAي جدايه هاي مايكوباكتريوم بويس كه توسط آنزيم هضم كننده PvuII به قطعات مختلف تبديل شده است جهش يا موتاسيون به وجود بيايد با استفاده از ماركرها و هيبريداسيون، باندهاي جديدي مشاهده مي‌شود و يك الگوي جديد بوجود مي‌آورد.
نتايج تحقيق حاضر از 8 جدايه

پایان نامه
Previous Entries منبع مقاله درباره سازمان بهداشت جهانی، تشخیص بیماری، استان خراسان Next Entries منبع مقاله درباره دانشگاه تهران، دانشگاه علوم پزشکی، استان خراسان، استان تهران