منبع تحقیق درمورد ميلیليتر، آنزيم، ميزان

دانلود پایان نامه ارشد

قادر باشد جذب را در 450 نانومتر بخواند، دستگاه ورتکس، آب مقطر

نمونههای جمع شده و ذخیره شده
سرم و پلاسمای EDTAدار
نمونههای سرم آماده شده و پلاسمای EDTAدار الزامی هستند. از نمونههایی که به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق نگه داشته شدهاند استفاده نکنید. نمونههای همولیزی و چربیدار نباید در آزمایش استفاده شود. نمونهها به مدت 36 ساعت در دمای 8-2 درجه می توانند ذخیره شوند. برای یک مدت طولانی (بیشتر از 2 هفته نمونهها باید در دمای 20- درجهی سانتیگراد ذخیره شوند).
پروتئینهای بزرگ میتوانند با دستگاه سانتریفیوژ از نمونه خارج شوند (برای مدت 5 دقیقه در ئور g 10000 ). پلاسمای هپارینه و خون نمیتوانند برای این آزمایش استفاده شوند.

انجام آزمایش
قبل از استفاده همهی مواد را در دمای اتاق بگذارید و انها را مخلوط کنید، توصیه میشود دو برابر کار کنید.

آماده کردن مواد
ترکیب شناساگر A
10 میلیلیتر از مادهبافر و 10 میکرولیتر از محلول پراکسید را ترکیب کنید (برای تشخیص 96 درصدی کافی است).

ترکیب شناساگر B
5 میلیلیتر از مادهی بافر و 50 میکرولیتر از substrate و 5 میکرولیتر از پراکسیداز را ترکیب کنید(برای تشخیص 96 درصدی کافی است).

آزمایش TAC
1. 25 میلیلیتر از محلول استاندارد را بردارید و کنترل و نمونهها را با دقت درون خانههای میکروتیتر پلت بریزید
2. 100 میکرولیتر از محلول شناساگر A را بردارید و به داخل خانهها بریزید. برداشتن و ریختن درون خانهها بیشتر از 1 دقیقه طول نکشد.
3. 50 میکرولیتر از محلول شناساگر B را بردارید و داخل خانهها بریزید.
4. دقیقا برای مدت 20 دقیقه در دمای 8-2 درجهی سانتی گراد گرمخانهگذاری کنید.
5. 50 میکرولیتر از محلول پایان را درون هر خانه بریزید ( بیشتر از 1 دقیقه طول نکشد).
6. دستگاه میکروپلت خوان را در 450 نانومتر تنظیم کرده و جذب محلول در خانهها را بخوانید.

محاسبه نتیجه
پس از تعیین میزان جذب نوری و ترسیم منحنی استاندارد غلظت TAC بر حسب میلی مول در لیتر محاسبه شد.

3-14-اندازهگيری فعاليت آنزيم سوپراکسيد ديسموتاز

اين آنزيم توسط کيت رانسود106 بر اساس روش مربوطه ( مک کورد و فريدوويچ، 1969) اندازهگيری شد.

اساس روش کار:
نقش آنزيم سوپراکسيد ديسموتاز (SOD) خنثی کردن راديکال هاي سمی سوپراکسيد توليد شده طی واکنشهای انرژیزای اکسيداتيو و تبديل آنها به هيدروژن پراکسيد و اکسيژن مولکولی
میباشد. در اين روش، از گزانتين107 و گزانتين اکسيداز108 (XOD) برای توليد راديکالهای سوپراکسيد استفاده میگردد. اين راديکالهای توليد شده با مادهای موسوم به آی. ان. تی. (INT) (2-4-يدوفنيل-3- 4- نيتروفنول- 5- فنيل تترازوليوم کلرايد) که در کيت موجود میباشد، واکنش داده و ماده قرمز رنگی موسوم به فرمازان109، توليد میکند. سپس ميزان فعاليت آنزيم سوپراکسيد ديسموتاز از طريق اندازهگيری درصد مهار انجام واکنش تعيين میگردد. يک واحد از آنزيم سوپر اکسيد دیسموتاز، مقدار آنزيمی است که توانایی مهار 50 درصد از سرعت احياء ماده آی. ان. تی. را در شرايط آزمايش دارد.

روش تهيه نمونه :
ابتدا 5/0 ميليليتر از نمونه خون هپارينه يا EDTA دار را در دور 3000، به مدت 10 دقيقه، سانتريفيوژ نموده و پلاسمای نمونه را جدا میکنيم. سپس گلبولهای قرمز را 4 بار شستشو
میدهيم. روش شستشو به اين صورت است که گلبولهای قرمز را با 3 ميلیليتر محلول سديم کلرايد 9/0 درصد مخلوط کرده و سپس 10 دقيقه در دور 3000 سانتريفيوژ میکنيم. پس از اتمام شستشوی گلبولهای قرمز، به گلبولهای شسته شده، 2 ميلیليتر آب مقطر سرد اضافه کرده و خوب مخلوط مینمائيم و سپس به مدت 15 دقيقه، در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار میدهيم. اين کار باعث لايز شدن گلبولهای قرمز میگردد. سپس محلول حاصل را با استفاده از بافر فسفات 01/0 مولار با اسيديته 7، 50 بار رقيق مینماييم (كه در اينجا فاكتور رقت كل را به 200 ميرسانيم). اين کار درصد مهار آنزيم را به ميزانی بين 30 تا 60 درصد میرساند.

آمادهسازی معرفها
کيت شرکت راندوکس برای اندازهگيری سوپراکسيد ديسموتاز، حاوی 4 نوع معرف به شرح زير می باشد:
معرف شماره یک يا سوبسترای مخلوط :
محتوی 05/0 ميلیمول بر ليتر از ماده گزانتين و 025/0 ميلیمول بر ليتر از ماده آی. ان. تی.
معرف شماره دو يا بافر :
محتوی40 ميلی مول بر ليتر از ماده سی. ای. پی. اس (CAPS) با اسيديته 2/10 و 94/0 ميلی مول بر ليتر از ماده EDTA.
معرف شماره سه يا گزانتين اکسيداز :
محتوی 80 واحد بر ليتر از آنزيم گزانتين اکسيداز (XOD)
استاندارد

آمادهسازی معرف شماره یک
يک ويال از معرف شماره یک را با 10 ميلی ليتر آب مقطر مخلوط می نمائيم.

آمادهسازی معرف شماره سه :
يک ويال از معرف شماره سه را با 10 ميلیليتر آب مقطر مخلوط مینمائيم.

آمادهسازی معرف شماره چهار (استاندارد) :
يک ويال از معرف شماره چهار را با 10 ميلیليتر آب مخلوط مینمائيم. اين محلول S6 ناميده می شود. جهت تهيه منحنی استاندارد، از محلول S6 بايد رقتهای مختلف به شرح زير تهيه گردد :
تهيه S5 : 5 ميلیليتر از محلول S6 را برداشته و با 5 ميلیليتر بافر فسفات 01/0 مولار مخلوط
مینمائيم.
تهيه S4 : 5 ميلیليتر از محلول S5 را برداشته و با 5 ميلیليتر بافر فسفات 01/0 مولار مخلوط
مینمائيم.
تهيه S3 : 5 ميلیليتر از محلول S4 را برداشته و با 5 ميلیليتر بافر فسفات 01/0 مولار مخلوط
مینمائيم.
تهيه S2 : 3 ميلیليتر از محلول S3 را برداشته و با 6 ميلیليتر بافر فسفات 01/0 مولار مخلوط
مینمائيم.

اسپکتروفتومتری :
برای اندازهگيری فعاليت آنزيم سوپراکسيد ديسموتاز به روش اسپکتروفتومتری، در طول موج 505 نانومتر، با کووت کوارتز، در دمای 37 درجه سانتیگراد و در مجاورت هوا، با توجه به جدول زیر، اقدام مینمائيم :

روش تهيه محلولهای مورد نياز در اندازهگيری آنزيم SOD به طريقه اسپکتروفتومتری
شاهد
استاندارد (S2-S6)
نمونه



ml 05/0
نمونه رقيق شده

ml 05/0

معرف استاندارد
ml 05/0


بافر فسفات 01/0 مولار
ml 7/1
ml 7/1
ml 7/1
معرف شماره يک آماده شده

پس از تهيه مخلوطهای ذکر شده در جدول هر کدام را با 25/0 ميلیليتر از معرف آماده شده شماره 3 (گزانتين اکسيداز)، مخلوط کرده و سريعاً توسط دستگاه اسپکتروفتومتری جذب آن را پس از 30 ثانيه (A1) و نيز پس از 3 دقيقه (A2)، در مقابل هوا قرائت میکنيم.

محاسبه :
ابتدا تغيير جذب در دقيقه (min/) را با توجه به فرمول زير محاسبه مینمائيم:
(تغيير جذب در دقيقه برای استاندارد و يا نمونه)
سپس با استفاده از فرمول زير درصد مهار را برای استاندارد و نمونه بدست میآوريم :

سپس اقدام به تهيه منحنی استاندارد بر اساس درصد مهار محلولهای مختلف استاندارد
(S2 تا S6) در مقابل لگاريتم بر مبنای 10 غلظتهای محلولهای استاندارد مینمائيم (غلظت محلول استاندارد S6 در راهنماي كيت 54/3 ذكر گرديده است و غلظت ديگر استانداردها را مي توان با ضرب كردن اين عدد در فاكتور رقتشان بدست آورد).
آن گاه با استفاده از منحنی استاندارد و با داشتن درصد مهار هر نمونه، فعاليت سوپراکسيد ديسموتاز برای هر نمونه را بر حسب واحد بر ميلیليتر (ml / U) پيدا مینمائيم. سپس ميزان اين آنزيم در کل خون را با استفاده فرمول زير بر حسب واحد بر ميلیليتر خون تام، محاسبه مینمائيم :
فاکتور رقت ميزان SOD نمونه (ml / U) = ميزان SOD (U/ml whole blood)
همانطور كه گفته شد، در اين جا فاکتور نهايی رقت، 200 میباشد.
در نهايت با استفاده از فرمول ميزان فعاليت ويژه SOD ر ا بر حسب واحد بر گرم هموگلوبين محاسبه مینمائيم :

01/0 × ميزان هموگلوبين (gr/dl) = ميزان هموگلوبين (ml/gr)

3-15-اندازهگيری فعاليت آنزيم گلوتاتيون پراکسيداز

فعاليت آنزيم GPX بر اساس روش پاگليا و والنتين110 (1967) و توسط کيت رانسل ساخت شرکت راندوکس111 اندازهگيری شد.

اساس روش کار:
آنزيم گلوتاتيون پراکسيداز (GPX)، واکنش اکسيداسيون گلوتاتيون احیا شده (GSH) را به وسيله کيومن هيدروپراکسيد112 کاتاليز میکند.
در حضور آنزيم گلوتاتيون ردوکتاز (GR) و NADPH، گلوتاتيون اکسيده شده (GSSG) به فرم احيا شده (GSH) تبديل میگردد.
کاهش جذب در طول موج 340 نانومتر اندازهگيری میشود:

آمادهسازی نمونه :
برای اندازهگيری فعاليت ويژه آنزيم گلوتاتيون پراکسيداز، از خون کامل هپارينه استفاده
میشود. برای خون گوسفند، 05/0 ميلیليتر از خون کامل هپارينه را با 3 ميلیليتر عامل رقيق کننده آماده شده موجود در کيت مخلوط مینمائيم.

آمادهسازی معرفها
کيت شرکت راندوکس برای اندازهگيری گلوتاتيون پراکسيداز حاوی 4 نوع معرف به شرح زير می باشد.

معرف شماره يک:
محتوی 4 ميلیمول بر ليتر از ماده گلوتاتيون، 5/0 واحد بر ليتر (و يا کمی بيشتر) از آنزيم گلوتاتيون ردوکتاز و 34/0 ميلیمول بر ليتر از آنزيم NADPH.
معرف شماره دو (بافر):
محتوی 05/0 ميلی مول بر ليتر از بافر فسفات با اسيديته 2/7 و 3/4 ميلیمول بر ليتر از ماده EDTA.
معرف شماره سه:
محتوی 18/0 ميلیمول بر ليتر از ماده کيومن هيدروپراکسيد
معرف شماره چهار:
محتوی عامل رقيق کننده113

آمادهسازی معرف شماره يک :
يک ويال از معرف شماره يک را با 10 ميلیليتر از معرف شماره دو (بافر) مخلوط میکنيم.

آمادهسازی معرف شماره سه :
10 ميکروليتر از معرف شماره سه را با 10 ميلیليتر آب مقطر مخلوط کرده و خوب تکان میدهيم تا کاملاً حل شود.

آمادهسازی معرف شماره چهار :
يک ويال از معرف شماره چهار را با 200 ميلیليتر آب مقطر مخلوط مینمائيم .

اسپکتروفتومتری :
اندازهگيری فعاليت آنزيم گلوتاتيون پراکسيداز توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 340 نانومتر و باکووت کوارتز يک سانتیمتری، در دمای 37 درجه سانتیگراد و در مجاورت هوا انجام می گيرد. برای اين منظور 05/0 ميلیليتر از نمونه خون رقيق شده را با 5/2 ميلیليتر از معرف شماره يک آماده شده و 1/0 ميلیليتر کيومن هيدروپراکسيد آماده شده مخلوط میکنيم. برای تهيه بلانک (شاهد) آزمايش، 05/0 ميلیليتر آّب مقطر را با 5/2 ميلیلیتر از معرف شماره يک آماده شده و 1/0 ميلیليتر کيومن هيدروپراکسيد آماده شده، مخلوط مینمائيم. سپس توسط دستگاه اسپکتروفتومتر جذب نمونه را در 3 زمان، يکی در ثانيه اول (A1) يکی در دقيقه اول (A2) و ديگری در دقيقه دوم (A3) در مقابل هوا قرائت میکنيم.
آن گاه از طريق فرمولهای زير ميزان فعاليت آنزيم گلوتاتيون پراکسيد را محاسبه مینمائيم:
(تفاوت جذب در دقيقه)
8412 = ميزان گلوتاتيون پراکسيداز در خون ليز شده (U/L)
در مرحله بعد بايد ميزان گلوتاتيون پراكسيداز بدست آمده براي هر نمونه (بر حسب واحد بر ليتر) را از ميزان گلوتاتيون بدست آمده براي نمونه شاهد (بر حسب واحد بر ليتر)، كم كنيم. از طرفي چون نتيجه بدست آمده مربوط به ميزان فعاليت اين آنزيم در نمونه خون رقيق شده است، بنابراين آنرا در فاكتور رقت كه در اينجا 60 مي باشد، ضرب مينمائيم تا ميزان فعاليت آنزيم گلوتاتيون پراكسيداز در خون كامل (بر حسب واحد بر ليتر) بدست آيد. همچنين برای جلوگيری از ايجاد خطا در آزمايش، در نتيجه تغييرات هموگلوبين خون، ميزان فعاليت گلوتاتيون پراکسيداز بر حسب واحد گرم هموگلوبين (U/gr Hb) اندازهگيری میشود. برای اين منظور ابتدا، ميزان هموگلوبين هر نمونه را اندازهگيری میکنيم. مقدار اندازهگيری شده بر حسب گرم بر دسیليتر (gr/dl) میباشد. با ضرب اين عدد در عدد 10، ميزان هموگلوبين بر حسب گرم بر ليتر (gr/l) محاسبه میگردد. آن گاه با تقسيم ميزان فعاليت آنزيم گلوتاتيون پراکسيداز بر حسب واحد بر ليتر، بر ميزان هموگلوبين

پایان نامه
Previous Entries منبع تحقیق درمورد 1000میکرولیتر، 8-2، کالیبراتور Next Entries منبع تحقیق درمورد انحراف معیار، گروه کنترل، تحلیل داده