منبع تحقیق درمورد اکسیداسیون

دانلود پایان نامه ارشد

سانتریفیوژ گردید. مایع رویی جدا و رسوب باقیمانده به 2 میلیلیتر آب مقطر در حمام آب جوش به مدت 5 دقیقه حرارت داده شد و سپس 2 میلیلیترNaOH (5/0نرمال) اضافه شد و به مدت 15 دقیقه در حمام آب جوش حرارت داده شد (افزودن سود به این دلیل است که رسوب فیتات فریک در دامنه طول موجهای مورد نظر در این آزمایش رنگی بوده و ایجاد تداخل و خطای آزمایش میکند).
بنابراین رسوب فیتات فریک تبدیل به رسوب فیتات سدیم میشود. پس از اعمال حرارت 15 دقیقهای برای تشکیل بهتر رسوب، عصاره از واتمن شماره 4 به داخل لولههای هضم دستگاه کلدال صاف گردید. بنابراین داخل لولههای هضم فیتات سدیم بود و روی کاغذ صافی رسوب هیدروکسید فریک باقی ماند. رسوب با آب داغ شسته و عمل صاف کردن ادامه داده شد.
پس از بدست آمدن عصاره، اندازهگیری فسفات به روش رنگ سنجی وانادومولیبدات انجام شد.
انتخاب این روش بدین دلیل است که اسید فیتیک نمونه به صورت ارتوفسفات در عصاره موجود است. اصول این روش بر پایه بر این پایه است که محلول اسیدی حاوی ارتوفسفاتها در مجاورت اسید مولیبدیک و اسید وانادیک ایجاد رنگ زرد اسید وانادی- مولیبدی فسفریک مینماید که شدت رنگ با مقدار فسفات موجود نسبت مستقیم داشته و با در نظر گرفتن منحنی استاندارد مقدار فسفات موجود اندازهگیری میشود.
در این آزمایش به دلیل مایع بودن نمونهها روش هضم برگزیده شد. در روش هضم 10 میلی لیتر H2So4 و 5 میلیلیتر HNO3 غلیظ به محلول اضافه گردید (هضم با اسید نیتریک بقیه فسفر باقیمانده را نیز به شکل ارتوفسفات در میآورد که با این روش قابل اندازهگیری است). سپس لولهها به مدت 1 ساعت در اجاق مخصوص هضم قرار گرفت تا سایر مواد آلی منهدم شوند و محلول شفاف بدست آید (عدم شفافیت به دلیل وجود اسید نیتریک است).
به لولهها پس از سرد شدن20 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد و به یک بالن 100 میلیلیتر منتقل شد. پس از آن مرحله خنثی شدن با آمونیاک انجام شد. چند قطره محلول آمونیاکPH محیط را خنثی میکند.
سپس با افزودن نیتریک اسید (1حجم اسید نیتریک + 2 حجم آب)pH اسیدی شد، چون اساس این روش رنگ سنجی در محیط اسیدی است. سپس 25 میلیلیتر معرف وانادات مولیبدات اضافه شد و تا خط علامت بالن با آب مقطر رقیق گردید و پس از 10 دقیقه (زمان لازم برای تشکیل کمپلکس رنگی اسیدی وانادی مولیبدی فسفریک است). مقدار جذب نور رنگ حاصل، در طول موج 450 میلی میکرون با دستگاه اسپکتوفتومتر اندازهگیری شد.
با توجه به مقدار جذب و منحنی استاندارد، مقدار فسفات و در نتیجه فیتات نمونه محاسبه گردید. مقدار فیتات بر حسب میلیگرم در 100 گرم وزن خشک گزارش شد و رقت سازیها هم محاسبه شد.
بدین ترتیب که آزمایشات روی 5 گرم نمونه انجام شد که در 100 گرم محاسبه شد و در مرحله دیگر هنگام سانتریفیوژ کردن از 100 میلی لیتر عصاره حاوی اسید فیتیک، 20 میلی لیتر آن به لوله سانتریفیوژ انتقال یافت که در اینجا نیز رقت محاسبه گردید.از آنجاییکه هر مولکول اسید فیتیک حاوی 6 اتم فسفر میباشد از روی میزان فسفر محاسبه شده مقدار اسید فیتیک نمونه محاسبه گردید.

3-3-1-طرز تهیه معرف وانادات _ مولیبدات
10گرم مولیبدات آمونیوم در 400 میلیلیترآب مقطر گرم (50oc) حل شده و سرد گردید 1 گرم وانادات آمونیوم را در300 میلی لیتر آب مقطر جوشان حل کرده و پس از سرد کردن در حالی که بهم زده میشد، 140 میلی لیتر اسید نیتریک غلیظ به آرامی بدان اضافه گردید و بعد محلول مولیبدات به آهستگی به محلول وانادات اضافه و با آب مقطرتا حجم یک لیتر رقیق شد(پروانه،1371).

3-4-اندازهگیری اسید فیتیک در نان

پس از آسیاب کردن نمونههای خشک شده توسط آسیاب آزمایشگاهی 5 گرم از آن به دقت توزین گردیده و مطابق روش مشروحه در مورد آرد، مقدار فیتات آنها اندازهگیری شد.

3-4-1-استاندارد کردن دستگاه اسپکتوفتومتری و بدست آوردن منحنی استاندارد و معادله رگرسیون:
ابتدا باید محلول استاندارد فسفات تهیه گردد. بدین منظور مقدار3.834 گرم دیهیدروژنفسفات پتاسیم (KH2PO4) را در آب حل کرده و حجم آن به یک لیتر رسانده شد و 25 میلی لیتر از این محلول تا حجم 250 میلی لیتر با آب مقطر رقیق گردید (1 میلی لیتر از محلول معادل 0.2 میلی لیتر P2O5 است). سپس به یکسری بالن حجمی 100 میلی لیتر مقادیر 0، 2.5، 5، 10 و 20 میلی لیتر محلول استاندارد فسفات اضافه شد و به هر بالن 50 میلی لیتر آب مقطر و چند قطره محلول آمونیاک افزوده شد تا pH محیط قلیایی شود و با افزودن اسید نیتریک (1 حجم اسید + 2 حجم آب)pH اسیدی گردید. در مرحله بعد 25 میلی لیتر معرف وانادات_ مولیبدات اضافه و تا خط علامت بالن با آب مقطر رقیق شد. پس از گذشت 10 دقیقه مقدار جذب نور محلولها در طول موج 400 میلیمیکرون اندازهگیری شد.

3-5- اندازهگیری جوششیرین

نان را کاملا خرد کرده، سپس مقدار 2.89 گرم از آرد حاصله وزن شد وتبدیل به خاکستر شد.20 میلی لیتر آب مقطر ولرم به خاکستر افزوده شد و پس از تکان دادن صاف شد و مایع صاف شده در یک ارلن 300 میلی لیتر ریخته شد. کپسول 2 تا 3 مرتبه با چند میلیلیتر آب مقطر ولرم شسته. هر بار آب شستشو روی کاغذ صافی ریخته شد.10 میلیلیتر اسید سولفوریک دسی نرمال به مایع صافی افزوده شد. به مدت 3 دقیقه جوشانده و سرد شد. پس از آن 2 قطره فنل فتالئین اضافه شد و به سود دسینرمال تا ایجاد رنگ صورتی کمرنگ پایدار تیتر شد.
مقدار بیکربنات سدیم از معادله زیر به دست میآید:
(n-10)420/0=بی کربنات سدیم (گرم در کیلوگرم)
n˸میلیلیتر سود دسینرمال مصرف شده

3-6-اندازهگیری آنتیاکسیدانهای سرم خون، مدفوع، کبد و استخوان (عناصر کمیاب)

3-6-1-جمع آوری نمونههای خون
پیش از شروع دوره هر موش با اتر بیهوش شد و خونگیری از قلب انجام شد.پس از اتمام دورهی 5 هفتهای هر موش صحرایی جداگانه با اتر بیهوش شده و سپس خونگیری از قلب انجام شد. حجم کافی از خون در لولهی حاوی EDTA ریخته شد و بقیه در لولهای جهت جداسازی سرم تخلیه شد. به منظور جداسازی سرم لولهها به مدت 10 دقیقه با دورrpm 2500 سانتریفیوژ شدند. سپس سرمهای جدا شده در لولههای اپندرف 1.5 میلی لیتری ریخته شدند. نمونههای سرم خون تا انجام آزمایشات در فریزر 80-، نگهداری شدند.

3-6-2-جمعآوری نمونههای مدفوع
پیش از شروع دوره و پس از اتمام آن از هر موش نمونه مدفوع گرفته شد و در ظروف جداگانه جمعآوری شده و تا انجام آزمایشات در فریزر 80-، نگهداری شدند.

3-6-3-جمع آوری نمونههای کبد و استخوان
پس از اتمام دورهی 5 هفتهای، هر موش صحرایی جداگانه با اتر بیهوش شده و پس از خونگیری از هر یک نمونه کبد و استخوان ران گرفته شده و درهر یک در ظروف جداگانه جمع آوری شدند و تا انجام آزمایشات در فریزر 80-، نگهداری شدند.

3-6-4-آمادهسازی نمونهی استخوان
پس از جدا کردن مواد اضافی از روی استخوانها، آنها را جداگانه وزن کرده، سپس بوتهها هم وزن شده و نمونهها به مدت یک شب در آون و در دمای 50 قرار گرفت.پس از آن نمونه روی شعله سوزانده شد و بعد از این مرحله به کوره با دمای 550 منتقل شد تا تبدیل به خاکستر شود.سپس بوته حاوی خاکستر وزن شده و مقدار 200از استخوان پودر شده به لوله فالکون منتقل شد.1سی سی محلول هضم روی آن ریخته شد و نمونه ها در لولههای مدرج به مدت 20-16 ساعت بسته به حجم آنها،به صورت متوالی در بنماری جوش با دمای 100-90 درجه سانتیگراد،قرار گرفتند.
3-6-5-آمادهسازی نمونهی کبد
از هر نمونه مقدار 200 را با اسکالپل کاملا له کرده و در لوله فالکون ریخته و1سی سی محلول هضم به آن افزوده شد. نمونهها در لولههای مدرج به مدت 20-16 ساعت بسته به حجم آنها،به صورت متوالی در بنماری جوش با دمای 100-90 درجه سانتیگراد،قرار گرفتند.

3-6-6-آمادهسازی نمونهی مدفوع
از هر نمونه مقدار 200 وزن شد و به لوله فالکون انتقال یافت و 1سی سی محلول هضم روی آن ریخته شد. نمونهها در لولههای مدرج به مدت 20-16 ساعت بسته به حجم آنها،به صورت متوالی در بنماری جوش با دمای 100-90 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.

3-6-7-آمادهسازی نمونهی سرم
پس از خارج سازی نمونههای سرمی از انجماد، مقدار 500 میکرولیتر از سرم هر نمونه با 500 میکرولیتر محلول هضم که مخلوطی از اسید نیتریک (HNO3) و اسید پرکلریک (HCLO4) به نسبت 70 :30 بود، به آن اضافه گردید، به گونهای که حجم نهایی،یک میلی لیتر بدست آمد. هدف از هضم سرم، آزادسازی عناصر و از بین رفتن مواد آلی (پروتئینها و آنزیمها) در روش هضم، بوده است. نمونهها در لولههای مدرج به مدت 2 -16 ساعت بسته به حجم آنها،به صورت متوالی در بنماری جوش با دمای 100-90 درجه سانتیگراد، قرار گرفتند.پس از انجام عملیات هضم و بدست آمدن محلولی زرد رنگ و شفاف، حجم محلولها با آب مقطر دیونیزه به حجم اولیه (یک میلیلیتر) رسانده شد تا در ضریب رقت محاسبه شدهی قبلی، تغییری ایجاد نگردد.

3-6-8-اندازهگیری عناصر آهن، مس، روی و منگنز با استفاده از دستگاه جذب اتمی
در نهایت اندازهگیری میزان عناصر کمیاب در رقتهای مختلف بسته به استانداردهای آنها با دستگاه جذب اتمي انجام شد (Schmidt و همکاران، 1976; ،Takahashi و همکاران،2000;Lyubimov و Kapetanovi،2007).
میزان این عناصربه جز آهن در حد میکروگرم در میلیلیتر یا گرم میباشد. مقدار آهن در حد میکروگرم در دسیلیتر میباشد.

3-7-اندازهگیری سرولوپلاسمین سرم

سرولوپلاسمین سرم به روش ساندرمن و نوموتو 1970 با سنجش فعالیت اکسیدازی آنها اندازهگيري شد. سرولوپلاسمین در pH=4.5 می تواند پارافنیلن دي آمین (PPD) را اکسید کند و فراورده ای رنگی ایجاد کند که میزان تولید آن با غلظت سرولوپلاسمین در سرم یا پلاسما متناسب است. البته مقداری از PPD به روش غیر آنزیمی نیز اکسید میشود که از این نظر باید در تخمین مقدار واقعی سرولوپلاسمین تصحیح لازم صورت گیرد. بنابراین سنجش فعالیت اکسیدازی سرولوپلاسمین به طور همزمان یکبار در حضور آزید سدیم و یکبار بدون حضور این ماده انجام میگیرد. آزید سدیم، اکسیداسیون آنزیمی PPD را مهار می‌کند، به بیانی دیگر از فعالیت سرولوپلاسمین جلوگیری میکند و موجب میشود که اکسیداسیون غیر آنزیمی PPD ادامه یابد. تفاوت حاصل از شدت جذب نور در این آزمایش با غلظت سرولوپلاسمین متناسب خواهد بود.

مواد :
استات سدیم (محلول 0.2 مول در لیتر) :
4/16 گرم استات سدیم با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده میشود و این محلول باید در یخچال نگهداری شود.
اسید استیک (محلول 2/0 مول در لیتر) :12 میلیلیتر اسید استیک با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد.
محلول بافر استات (1/0 مول در لیتر ، 45/5=pH در دمایC˚37 ) در یک فلاسک حجمی یک لیتری ، 430 میلی لیتر محلول استات سدیم (2/0 مول در لیتر ) ، 70 میلی لیتر محلول اسید استیک (2/0 مول در لیتر ) و حدود 400 میلیلیترآب مقطر با هم مخلوط شد. محلول در حمام آب گرم تا 37 درجه گرم شد.pH آن با افزودن استات سدیم یا اسید استیک به 45/5 (بین 40/5 تا 50/5) رسید و سپس با آب مقطر به حجم رسانده شد این محلول باید در یخچال نگهداری شود.
سدیم آزید (محلول 5/1 مول در لیتر) :5/97 گرم آزید سدیم با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد.

هیدروکسید سدیم (محلول 1 مول در لیتر ) :40 گرم هیدروکسید سدیم با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد.
پارافنیلن دی آمین دی هیدروکلرید2(C6H4CNH2) محلول بافر 6/27 میلی مول در لیتر:در یک فلاسک حجمی 100 میلیلیتر، 5/0 گرم PPD و حدود 75 میلی لیتر بافر استات (45/5=pH) که تا 37 گرم شده است. با هم مخلوط میشوند. pH محلول در دمای 37 با افزودن قطره قطره از محلول هیدروکسید سدیم (1مول در لیتر) به 45/5 رسانده میشود. سپس محلول با آب مقطر به حجم می رسد. با توجه به اینکه پایداری این محلول تنها 3 ساعت است، لازم است که دقیقا قبل از مصرف تهیه شود.
روش کار:
در دو لوله آزمایش که یکی با R (واکنش) و دیگری با B (شاهد) مشخص شد، 2 میلیلیتر محلول بافر استات و 1/0 میلیلیتر سرم با هم مخلوط

پایان نامه
Previous Entries منبع تحقیق درمورد بیماری مزمن، اکسیداسیون Next Entries منبع تحقیق درمورد 1000میکرولیتر، 8-2، کالیبراتور