منابع پایان نامه درمورد مدل سازی، انفورماتیک، پایگاه اطلاعات، توزیع فراوانی

دانلود پایان نامه ارشد

بالای اتصال و قابلیت چندین بار استفاده با یکدیگر ادغام شده اند. علاوه بر این شرایط جداسازی پروتئین جذب شده از ستون (Elution) انعطاف پذیر بوده و برای این کار نیاز به مقدار های بالا از بافر جدا کننده نیست (218). واکنش دنباله هیستیدینی با Ni-NTA تحت تاثیر عواملی همچون نمک بالا(تا1M) شوینده های غیر یونی (مثلTritonX-100 ویاTween20 تا1درصد) حلال های آلی(مثل اتانل یا گلیسرول تا 30 درصد) عوامل کاهنده(بتامرکاپتواتانول تا 10mM) و یا شرایط دناتوره کننده (مثل8mM اوره و یا6mM گوانیدین هیدروکلراید) قرار نمی گیرند به این ترتیب با دنباله های هیستیدینی علاوه بر پروتئین های محلول می توان پروتئین های نوترکیب نا محلول هیستیدینه را نیز به وسیله کروماتوگرافی تمایلی تثبیت شده فلزی در شرایط دناتوره تخلیص کرد و مجددا در آن تاخوردگی ایجاد کرد (219). رزین Ni-NTA خود نیز در رنج PH=2.5-13 پایدار است و قادر به تحمل SDS دو درصدو اتانول صد درصد است. همچنین تحت تاثیر نوکلئاز ها و یا پروتئاز ها قرار نمی گیرد بنابراین ستون مذکور می تواند به عنوان اولین مرحله تخلیص نیز استفاده گردد (219).
2-40- فرضیات و هدف از انجام تحقیق
2-40-1 -فرضیات
1. طراحی یک واکسن یونیورسال بر مبنای پروتئین L1،L2 برای پاپیلوما ویروس های انسانی
(45،31 ،18، 16،11،6،5) شدنی می باشد.
2. پروتئین نوترکیب این واکسن یونیورسال قابل تولید و تخلیص می باشد.
3. تزریق این پروتئین به موش قابلیت تحریک آنتی بادی ها را دارد.
2-40-2 – هدف از انجام تحقیق
2-40-2 – 1- هدف کلی
طراحی و ساخت واکسن کاندید یونیورسال بر علیه ویروسهای پاپیلوما انسانی (45،31 ،18، 16،11،6،5) بر پایه پروتئینهای L1 و L2
2-40-2 – 2- اهداف فرعی
1. طراحی یونیورسال واکسن و آنالیز بیوانفورماتیک آن
2. تولید پروتئین مذکور در E.coli
3. تخلیص پروتئین و ارزیابی بیان با Western Blot
4. تزریق به موش و بررسی پاسخ آنتی بادی
2-40-2 – 3- هدف کاربردی
هدف از این مطالعه در واقع تولید یک واکسن یونیورسال برای ویروس پاپیلوما است که بتواند تیپ های مختلفی را پوشش دهد .

3-1-مجموعه توالی های پروتئین
توالی های پروتئین مرجع L1 و L2 از HPV های پر خطر شایع شامل نوع 6، 11، 16، 18، 31 و 45 است که از پایگاه اطلاعاتی http://ncbi.nlm.nih.gov بازیافت شده است. توالی L1 و L2 از HPV6 و 11 بطور کامل مشابه بودند، بنابراین توالی های L1 و L2 HPV6 برای آنالیز بعدی بکار گرفته شد. این توالی ها و کدهای دستیابی به آن ها در جدول 1 فهرست شده است.
Serotype
L1(Accession)
L2(Accession)
Importance
HPV type 11
CCB84764
CCB84763
High prevalent/moderate risk
HPV type 16
AAV91691
AAO85414
High risk
HPV type 18
AAP20601
AGU90429
High risk
HPV type 31
AEI61093
AEI61092
High risk
HPV type 45
AGU90648
AGU90647
High risk
جدول3-1: سکانس های استفاده شده برای طراحی ساختار کاندید یونیورسال واکسن HPV
3-2-پیش بینی اپی توپ سلول B
برای پیش بینی مناطق اپی توپ در پروتئین های L1 و L2، از سرور BCRPEDS بر اساس نقایص توصیه شده استفاده شد. این سرور سبب می شود کاربر سنجش مدل سازی را در بین سه روش پیش بینی موجود انتخاب کند: 1) روش AAP، 2) BCPred؛ 3) FBCred. در سنجش پیش بینی ما، روش BCPred انتخاب شد، زیرا می توان در آن طول اپی توپ مورد نظر را انتخاب کرد و همچنین دارای اختصاصیت ارائه توالی آنتی ژنی می باشد. انتخاب اپی توپ با طول ثابت پپتید 20 mers بوده است.

3-3-قابلیت دسترسی اپی توپ به حلال
بعد از انتخاب اپی توپ ها، در مرحله بعد از نظر میزان از قابلیت دسترسی به حلال بررسی شدند. سطح یک پروتئین می تواند بطور احتمالی با آب در تماس باشد و آن منطقۀ اتم روی سطح که بوسیله آب در تماس است، سطح مولکول قابل دسترس یا منطقۀ در معرضِ حلال نامیده می شود. بنابراین انتخاب اپی توپ های با میزان بالاتر قابلیت دسترسی به حلال توصیه می شوند. بدین منظور، به ساختمان پروتئین های L1 و L2 نیاز بود. ساختمان های کریستال پروتئین L1 و L2 قبلاً تعیین شدند. برای کسب مدل ساختمانی سه بعدی پروتئین های L1، ساختمان کریستال این پروتئین ها به عنوان قالب PDB در سرور مدل سازی پروتئین رباط Swiss Model Alignment بکار برده شد (220). ساختمان کریستال L1 HPV 11 برای L1 HPV11، ساختمان کریستال L1 HPV 16 برای L1 HPV 16، ساختمان کریستال L1 HPV 18 برای L1 HPV 18، ساختمان کریستال L1 HPV 31 برای L1 HPV 31 و ساختمان کریستال L1 HPV 45 برای L1 HPV 45 استفاده شد. علارغم در اختیار داشتن توالی پروتئین های L2 به علت در دسترس نبودن ساختمان کریستال این پروتئین ها در قالب PDB، مدل های ساختمان سه بعدی L2 بدست نیامدند. تناسب بین مدل های ساختمان سه بعدی در SWISS-PDB Viewer توسط محاسبۀ میانگین انحراف مربع ریشه یا جذر بعد از تناسب بندی تکراری ارزیابی شد. بعد از آماده سازی ساختمان ها، قابلیت دسترسی این اپی توپ ها به حلال در نرم افزار spdbv مورد مطالعه قرار گرفت. در نهایت، اپی توپ هایی با میزان بالای قابلیت دسترسی به حلال انتخاب شدند.
3-4-محل های N-Glycosylated
زنجیره های کربوهیدرات در N-Glycosylation به نیتروژن آسپاراژین متصل می شوند و عملکردهای مختلفی را در بر دارند. گلیکوزیلاسیون متصل به N شایع ترین نوع پیوند گلیکوزیدی است و برای چین خوردن بعضی از پروتئین های یوکاریوتیک اهمیت دارد و در یوکاریوتیک ها رخ می دهد اما در باکتری ها نادر است. بدین منظور بیان نهایی تولید پروتئین در اشرشیا کولی طراحی شد، بنابراین حذف اپی توپ هایی که محل های N-Glycosylated دارند، ضروری است. برای پیش بینی محل های N-Glycosylated، سرور ensemblegly –Iowa مورد استفاده قرار گرفت. اپی توپ های انتخاب شده از مرحله قبلی در سرور ensembelgly –Iowa مورد انالیز قرار گرفتند و توالی هایی که حتی یک محل N-Glycosylated داشتند در طرح ساختار نهایی حذف شدند.
3-5-ترجمۀ معکوس اولین ساختمان
بعد از انتخاب بهترین اپی توپ های آنالیز بیوانفورماتیک مبتنی بر L1 و L2، این اپی توپ ها به یکدیگر متصل شدند و اولین ساختمان این ساختار بوسیله سرور Lasergene Seqbuilder ساخته شد. ساختار نهایی با استفاده از ابزار ترجمۀ معکوس Sequence Manipulation Suite (http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html) ترجمه شد.Sequence Manipulation Suite یک مجموعه از برنامه های JavaScript برای آنالیز توالی های پروتئینی و DNA کوتاه است. در این سرور، ترجمۀ معکوس یک توالی پروتئینی را قبول می کند، یک جدول کاربرد کدون را برای ایجاد توالی DNA نمایش می دهد و یک توالی از همه کدون های احتمالی برای ترجمه معکوس هر اسیدآمینه به اسیدنوکلئیک را ارائه می دهد.
3-6-بهینه سازی کدون، تعیین کدون های نادر (rare codon)
بهینه سازی کدون تکنیکی است که از کارایی حامل های بیان DNA که در واکسیناسیون DNA برای کسب بیان بهینۀ ژن خارجی در جسم سلول میزبان استفاده می شود، حمایت می کند (221) . ساختارهای بهینه شده با استفاده از ابزار OPTIMIZER در سرور ژنوم که کدون مطلوب معادل با هر اسید آمینه را ارزیابی می کنند، بوسیله DNA و تعویض کدون ها کدگذاری می شوند. OPTIMIZER یک وسیله PHP on line است که کاربرد کدون یک توالی DNA را برای افزایش سطح بیان آن بهینه سازی می کند. کاربرها می توانند جداول ارجح خود را برای استفاده در فرایند بهینه سازی معرفی کنند یا از جداول از پیش تعیین شده بیشتر از 150 گونه پروکاریوتیک تحت انتخاب با ترجمه ایی قوی استفاده کنند. این سرور می تواند برای پیش بینی و بهینه سازی بیان سطح یک ژن در بیان ژن هترولوگ با مطلوب ترین کدون مفید باشد. ارزشیابی ساختار نهایی برای آنالیز کدون نادر برای تشدید سطح بیان ژن و انحلال پذیری پروتئین یک مرحله بسیار مهم است. به این منظور، از ابزارهای آنالیز rare codon در سرور GenScript استفاده شد. این ابزار توالی DNA کدگذاری پروتئین مورد نظر را می خواند و خصوصیات مربوط به ارگانیسم آن را محاسبه می کند، این نرم افزار همچنین قابلیت تعیین CAI (شاخص انطباق کدون)، محتوای GC و توزیع فراوانی کدون را دارد. این اطلاعات برای پیش بینی این مسئله که ژن ساختمان نهایی در اشرشیا کولی به خوبی بیان خواهد شد، بسیار مفید است. CAI برای ساختمان ارتقا یافته در بهترین حالت بیان، به بالاتر از 0.8 می رسد.
3-7-تولید ساختار واکسن
آنالیز نهایی ساختار واکسن مشتمل بر 20 اپی توپ 20 اسیدامینه ای حاوی 400 اسید آمینه که بعد از ترجمه معکوس به صورت 1200 اسیدنوکلئیک در نظر گرفته شد شامل درصد احتمالی قرارگیری ساختار فوق در سطح سلول، منطقۀ آلفا آلفاتیک و بتا آلفاتیک، ترجمۀ توالی آنتی ژنیک، شاخص آنتی ژنی سیتی و پیش بینی میل ترکیبی پیوند به صورت آخرین نقطه کنترل برای اعتبارسنجی و اطمینان پذیری با روش hopp و woods در ابزار Expasy اندازه گیری شدند. نرم افزار آنزیم برش گر BamHI را برای برش ابتدای توالی و آنزیم برش گر HindIII را برای برش انتهای توالی انتخاب گردید. بنابراین، کدون آغازین ATG و توالی GGATCC (کدون BamHI) در آمینوترمینال ساختمان نهایی وارد شدند و همچنین توالی AAGCTT (کدون HindIII) نیز در کربوکسیل انتهایی وارد شد. در نهایت آنها به همدیگر متصل شدند و توالی مشاهده شد. در مرحلۀ نهایی، حامل pET28a به عنوان یک وکتور بیان پلاسمید برای ساختن واکسن مبتنی بر مولتی اپی توپ انتخاب شد. سیستم بیان p ET یکی از گسترده ترین سیستم های مورد استفاده برای کلونینگ و بیان پروتئین های نوترکیب در اشرشیا کولی در محیط آزمایشگاه است.
3-8-تهیه باکتری مستعد شده
سلول مستعد سلولی است که توانایی ترانسفورم شدن با یک قطعه DNA خارجی را داشته باشد. برخی باکتری ها در مرحله بین رشد لگاریتمی و فاز ثابت به طور خود به خود مستعد دریافت ژن می‌شوند، اما باکتری E.coli را می‌توان طی مراحلی به طور مصنوعی به سلول مستعد تبدیل کرد. به این منظور طی یک سری فرایندهای متوالی ، غشای باکتری دارای سوراخ‌های بسیار ریزی می‌شود که پذیرش DNA را آسان می کند. در این پروتوکل از کلرید کلسیم 0.1 مولار استفاده می شود.
مواد و وسایل مورد نیاز:
سلول باکتری (در اینجا E.coli سویه BL21 )
محیط کشت LB مایع (برای یک لیتر)
Trypton یا Bactopepton 10 گرم
Yeast Extract 5 گرم
NaCl 10 گرم
در آب دیونیزه به کمک مگنت حل و پس از به حجم رساندن با اتوکلاو استریل گردید.
محلول کاری CaCl2 0.1M است لذا در هنگام تهیه سلول های مستعد باید به نسبت 1:10 با آب دیونیزه رقیق شود.این کا ردر شرایط کاملا استریل انجام گردید.
اسپکتروفوتومتر
سانتریفوژ 4 درجه سانتی گراد و انکوباتور 37 درجه سانتی گراد شیکردار
سمپلر،سر سمپلر و لوله اپندورف استریل
ظرف یخ
روش کار:
تک کلونی باکتری پس از انتخاب از روی محیط LB آگار دار و انتقال به 5ml محیط LB مایع به مدت یک شب در 37 درجه سانتی گراد انکوبه گردید.
به 50ml محیط LB موجود در یک بالن استریل Mg2+ با غلظت 10 میلی مولار اضافه شده و جهت اطمینان از عدم آلودگی یک شب در 37 درجه سانتی گراد انکوبه می گردد.
از محیط کشت داده شده به نسبت 1 به 100(0.5ml) به 50ml محیط حاوی Mg2+ تلقیح شده و تا زمانی که جذب نوری محیط در طول موج 550 نانومتر (OD550) به میزان 0.5-0.3 برسد(حدود 3 ساعت)، بالن حاوی محیط کشت در اتوشیکردار، در دمای 37 درجه سانتی گراد و با دور 160rpm انکوبه گردید. توجه به این نکته ضروری است که اگر OD بیش از 0.65 شود کارائی ترانسفورماسیون کاهش خواهد یافت.
سپس محتوای بالن به یک لوله پلی پروپیلن (فالکون) استریل که از قبل سرد شده باشد منتقل شده و به مدت 1 ساعت در یخ

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه با واژگان کلیدی تصویرپردازی، عاشق و معشوق، جامعه بشری، اغراض شعری Next Entries پایان نامه با واژگان کلیدی مشرق زمین، تصویرپردازی، ادبیات عرب، برون گرایی