منابع پایان نامه درمورد محدودیت ها

دانلود پایان نامه ارشد

و تکثیر سریع، تراکم بالا در محیط های ساده و ارزان، مصرف کم مواد اولیه، کنترل آسان، میزان بیان بالای پروتئین نوترکیب و قدرت بالای پذیرش ژنهای بیگانه را دارد و از طرف دیگر وجود دانش فراوان در مورد ویژگی های ژنتیکی و بیولوژی مولکولی و در دسترس بودن تعداد زیادی از ناقل‌های تجاری کلون سازی آن را به موجود بسیار کارامدی برای تحقیقات مهندسی ژنتیک تبدیل کرده است (213).
علی رغم مزایای سیستم بیان کننده اشرشیاکلی،هر ژنی قابلیت بیان در این میکروارگانیسم را ندارد و این امر ممکن است به علت تفاوت اصلی بین کدون های ژن بیگانه با کدون های معمول در ژن‌های اشرشیاکلی و همچنین وجود توالی اینترون باشد که سبب مشکل در ترجمه ژن و میزان محصول می گردد. فاز دیگر دلایل ناکارایی این میزبان برای بیان برخی ژن ها می تواند ماهیت ساختاری منحصر به فرد و دقیق ترادف ژنی، پایداری و کارایی ترجمهmRNA، نحوه شکل یابی پروتئین، تجزیه و تخریب پروتئین توسط پروتئاز های سلول میزبان و سمیت بالقوه پروتئین برای میزبان باشد (213).
به طور کلی معایب اصلی اشرشیاکلی به عنوان یک سیستم بیان کننده را می توان در موارد زیر خلاصه نمود:
1- عدم توانایی انجام بسیاری از تغییرات پس از ترجمه (مانند گلیکوزیلاسیون) که در سلول های یوکاریوتی مشاهده می شوند.
2- فقدان مکانیسم ترشحی موثر پروتئین نوترکیب به محیط کشت.
3- قابلیت محدود تشکیل پیوندهای دی سولفیدی.
طراحی مناسب سیستم های بیان کننده، قادر به حذف بسیاری از این محدودیت ها می باشد. امروزه گونه های تجاری اشرشیاکلی در دسترس هستند که این معایب را ندارند.(214).
2-30-وکتورهای بیان کننده
تمام وکتورهای بیان کننده باید دارای ویژگی هایی از قبیل پروموتر مناسب، عوامل تنظیمی برای کنترل نسخه برداری و ترجمه، جایگاه های آنزیمی مناسب برای وارد نمودن DNA ژن مورد نظر، ناحیه پایان نسخه برداری(Terminator)، مارکر شناساگر برای تشخیص سلول های حاوی وکتور(اکثرا ژن مقاومت به آنتی بیوتیک) باشند. بسیاری از وکتورهای بیان کننده دارای عناصری علاوه بر موارد فوق هستند، به طوری که برخی از آنها دارای توالی نشانه به منظور ترشح یا هدایت اجزای اصلی یک پروتئین به فضای خاصی مانند پری پلاسم می باشند و در ساختمان برخی از آنها دنباله یا برچسب های (Tag) خاصی برای سهولت در فرایند تخلیص پروتئین و نیز آشکار سازی پروتئین نوترکیب استفاده می گردد. این برچسب ها گاه باعث افزایش حلالیت پروتئینمی گردند (215).
2-30-1- وکتورهای بیان کننده سیستمpET
سیستم pET از قوی ترین سیستم هایی است که تا کنون برای کلونینگ و بیان پروتئین های نوترکیب در E.coli توسعه یافته است.ژن های کلون شده در سیستم pET تحت کنترل شدید پروموتر T7 باکتریوفاژ نسخه برداری و ترجمه می شوندو بیان آنها با فراهم آمدن یک منبع از RNA T7 پلیمراز در سلول میزبان تحریک می شود.پروتئین تولید شده در عرض کمتر از دو ساعت بعد از تحریک به بیش از 50 درصد کل پروتئین های سلول می رسد. با وجود اینکه این سیستم فوق العاده قوی است اما امکان کاهش سطح بیان ژن با کاهش غلظت محرک بسادگی میسر است. کاهش سطح بیان ژن ممکن است بازده حلالیت تعدادی از پروتئین های مورد نظر را افزایش دهد (209). از جمله فواید دیگر این سیستم توانایی نگهداری ژن های مورد نظر به صورت نسخه های خاموش در مرحله عدم تحریک است. هم اکنون بیش از 42 نوع وکتور pET وجود دارد که هرکدام از آنها دارای ویژگی های خاصی می باشند. به جز سری pET-5 بقیه وکتورهای pET دارای کدون توقف در انتهای ناحیه کلونینگ و مناطق دنباله دار و T7 ترمیناتور هستند. شناساگرهای انتخابی این سری وکتورها آمپی سیلین و کانامایسین می باشد. وکتورهای هر سری با حروف از یکدیگر متمایز شده اند. به عنوان مثال pET-28a(+) که bp 5369 (جفت باز) طول دارد، دارای پروتئین اتصالی His می باشدکه در خالص سازی تمایلی کاربرد دارد. این دنباله فعالیت بیولوژیکی پروتئین را بوسیله تاثیر روی حلالیت آن در سیتوپلاسم یا صدور پروتئین به پری پلاسم افزایش می‌دهد و استفاده آن برای پروتئین هایی می باشد که ابتدا به صورت اجسام توده ای بیان می‌شوند. در طی خالص سازی در اثر شرایط کاملا دناتوره کننده، پروتئین به صورت محلول در می آید. تشکیل اجسام توده ای مزیتی برای خالص سازی محسوب می شود، به این دلیل که این اجسام به آسانی در اثر سانتریفوژ جدا می شوندو پروتئین در غلظت بالا به دست می آید. همچنین باعث محافظت پروتئین در برابر هضم پروتئولیتیک می شوند و اگر پروتئین سمی باشد، در حالتی که به صورت توده ای هستند، قادر به محدود کردن رشد سلولی نمی باشد. سیستمpET همچنین دارای دو نوع پروموتر است:T7 پروموتر و T7Lac پروموتر.T7Lac پروموتر محتوی 25 جفت باز توالی Lac اپراتور است که بلافاصله در قسمت پایین دست منطقه 17 جفت باز پروموتر قرار گرفته است. اتصال Lac رپرسور در این محل بطور موثری نسخه برداری از ژن توسط RNA T7 پلیمراز را کاهش می‌دهد (209).
2-31-وکتورهای پلاسمیدی
پلاسمیدها، مولکول های DNA حلقوی دو رشته ای هستند که قادر به همانندسازی می باشند و در باکتری ها به صورت بخش های خارج کروموزومی مستقل حفظ می شوند. پلاسمیدها به عنوان عناصر ژنتیکی قابل همانندسازی و مستقل دارای خصوصیاتی هستند که آنها را وکتورهای بالقوه ای برای حمل DNA کلون شده ساخته است (208). یک ناقل پلاسمیدی مطلوب برای کلونینگ دارای خصوصیات زیر می باشد:
– وزن مولکولی پایین
– توانایی ایجاد فنوتیپ مورد نظر در سلول میزبان
– جایگاه منحصر به فرد برای تعداد زیادی از آنزیم های محدودالاثر(208)
– مارکر انتخابی(غالبا ژن مقاومت به یک آنتی بیوتیک است)
از طریق این مارکر، با افزودن آنتی بیوتیک به محیط کشت می توان سلول های فاقد ژن نوترکیب را از بین برد که این امر همچنین غربالگری کلنی های حاوی پلاسمید نوترکیب را نیز آسان می کند.
– مبدا همانندسازی(Origin)
مبدا همانندسازی پلاسمید عامل همانندسازی خود به خود و مستقل از کروموزوم می باشد.
– پروموتر
اصلی ترین عامل در بیان انبوه پروتئین نوترکیب، توالی پروموتر است که شرایط مناسب را برای رونویسی کارامد از ژن پایین دست خود و در صورت نیاز کنترل دقیق بیان را نیز در سطح نسخه برداری انجام پذیر می نماید پروموتر آغاز کننده رونویسی می باشد و 100-10 نوکلئوتید فرادست جایگاه اتصال ریبوزوم قرار دارد (208).
2-32-توالی شاین دلگارنو(SD)(Shine-delgarno)
این توالی برای آغاز ترجمه و مکمل شدن با انتهای 3` از RNA 16S ریبوزوم ضروری است و کارایی سیستم ترجمه بستگی به توالی صحیح آن یعنی5’-TAAGGAGG-3’ دارد .
2-33-استراتژی بیان در سیستمpET
همان گونه که اشاره شد ناقل های pET یک خانواده از ناقل های بیانی هستند که پروموترهای فاژ T7 را برای تنظیم سنتز محصول ژن کلون شده بکار می برند. برای تامین RNA پلیمراز فاژT7، سویه هایی از باکتریE.coli ساخته شده اند که دارای ژن 1 فاژ1 واقع در فرودست پروموتر Lac می باشند. در نتیجهRNA پلیمراز فاژ فقط با القاء IPTG سنتز می شود. سپس RNA T7 پلی مراز تازه سنتز شده، ژن بیگانه کلون شده در ناقل pET را رونویسی خواهد کرد (215).
2-34-نقشه و مشخصات وکتورpET28a(+)

شکل 2-6. ساختار شماتیک و توالی ژنی ناحیه بیانی pET-28a(+) (209)
2-35-تولید پروتئین نوترکیب
برخی کاربردهای پروتئین نوترکیب عبارتند از: ایمنی زایی، مطالعات بیوشیمیایی، بررسی سه بعدی پروتئین‌ها و استفاده های درمانی و تشخیصی. تولید پروتئین نوترکیب نیاز به یک استراتژی هوشمندانه برای انتخاب سیستم بیانی، ناقل پلاسمیدی و پروتکل کلونینگ، بیان و تخلیص دارد (216).
2-36-مراحل تهیه یک پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی
استراتژی بیان ژن در اشرشیاکلی:
– به دست آوردن قطعه DNA یا ژن مورد نظر
– وارد کردن آن به یک ناقل و ایجاد پلاسمید نوترکیب
– ترانسفورم کردن باکتری با پلاسمید نوترکیب جهت کلونینگ
– شناسایی کلون حامل ژن مورد نظر
– تکثیر سویه اشرشیاکلی دارای پلاسمید نوترکیب به میزان زیاد
– تخلیص پلاسمید نوترکیب و ترانسفورم آن به باکتری بیانی
– بیان پروتئین نوترکیب به وسیله القاء پروموتر
– تخلیص پروتئین (215)
2-37-بیان ژن و تولید پروتئین نوترکیب در E.coli
وکتور باید دارای پروموتر و ترمیناتور و یک توالی بازی برای اتصال به ریبوزوم داشته باشد تا مولکول های mRNA که توسط ژن کد می شود بتواند به ریبوزوم متصل شود. مرحله بعد از بیان ژن، جمع آوری محصول ژن است. به دلیل اینکه محصول ژن توسط پروتئاز باکتری تجزیه می‌شود، می توان محصول ژن را به پروتئین های طبیعی سلول متصل کرد. راه دیگر برای رفع این مشکل استفاده از سویه هایی از باکتری است که مقدار پروتئاز کمی دارند. راه آخر به کارگیری استراتژی است که پروتئین های خارجی در سیتوپلاسم سلول تشکیل توده دهندو بدین ترتیب مانع فعالیت پروتئازها می شوند. محصولات ژنی می توانند داخل سیتوپلاسم تجمع کنند یا به محیط خارج انتقال یابند. صدور محصول ژن به خارج سلول مزیت هایی از جمله افزایش بازده،سهولت استخراج و خالص سازی پروتئین را به همراه دارد (215).
تولید پروتئین نوترکیب در E.coli به سه صورت می تواند صورت بگیرد:
1. ترشحی که علی رغم افزودن توالی نشانه ترشح کننده، به صورت ناقص صورت می گیرد.
2. پری پلاسمی که نیاز به افزودن توالی نشانه دارد.
3. سیتوپلاسمی که تولید سیتوپلاسمی پروتئین نوترکیب خود می تواند به دو صورت انجام گیرد (215):
الف) اجسام نامحلولی به نام اجسام توده ای یا انکلوژن بادی،که پروتئین به صورت تانخورده در می‌آید وگاه برای رسیدن به محصولی با تاخوردگی صحیح باید مراحل زیاد و هزینه بری طراحی شود ..
ب) تولید پروتئین به صورت محلول در سیتوپلاسم
یک پروتئین نوترکیب وقتی در مقیاس زیاد تولید می شود، به فرم نامحلول در می آید.مکانیسم ایجاد انکلوژن بادی ها به خوبی شناخته نشده است ولی احتمالا مربوط به تجمع پلی پپتیدهایی است که بصورت ناکافی تاخوردگی یافته اند. ایجاد اجسام توده ای نه تنها به ساختار شیمیایی پلی پپتیدی بلکه به عوامل متنوعی از جمله محیط کشت،دمای رشد، وکتورهای بیانی و یا توالی ژن بستگی دارد و در این شرایط گاهی می توان از تولید این اجسام جلوگیری کرده و پروتئین مورد نظر را محلول نمود (215).
2-38-راهکارهای افزایش تولید پروتئین نوترکیب در اشرشیاکلی
برخی از این راهکارها از قبیل افزایش تعداد نسخه های وکتور بیان کننده، پایداری پلاسمید، جایگاه اتصال mRNA به ریبوزوم، تنظیم بیان ژنوم…می باشند. تغییر در پارامترهایی مانند سویه میزبان،نوع محیط کشت، غلظت ماده القاء کننده، مدت زمان القاءمی توانند اثر چشمگیری بر روی میزان بیان پروتئین نوترکیب داشته باشد. یکی از عوامل مهم در فرایند تولید پروتئین، انتخاب کدون های مناسب و معمول در E.coli می باشد. برخی از کدون ها خصوصا کدون های AGG وAGA که اسید آمینه آرژنین را کد می کنند، جزو کدون های کمیاب در E.coli هستند. با تغییر دادن کدون ها به روش جهش زایی هدایت شده یا استفاده از سویه هایی کهtRNA کافی برای این کدون ها دارند، می توان بر این مشکل غلیه کرد (217).
2-39-تخلیص پروتئین نوترکیب
با استفاده از دنباله های اتصالی تسهیل کننده تخلیص پروتئین های نوترکیب می توان فرآیند تخلیص را به وسیله کروماتوگرافی تمایلی در یک فرآیند یک مرحله ای با خلوص و بازده نسبتا بالا انجام داد. تخلیص با استفاده از دنباله ها بسیار ساده‌تر از تکنیک های قدیمی می باشد.دنباله هیستیدینی(His-tag) و گلوتاتیونs-ترانسفراز(GST) متداول ترین دنباله‌های تخلیص می‌باشند و تخلیص پروتئین های متصل به آن‌ها با روش کروماتوگرافی تمایلی انجام می‌گیرد. ماتریکس کروماتوگرافی تمایلی برای گلوتاتیون s-ترانسفراز گلوتاتیون و برای دنباله هیستیدینی، رزینNi2+-NTA (Ni(II)-nitrilotriacetic acid) می باشد. در دنباله هیستیدینی مزایای کوچک بودن دنباله و تمایل زیاد به یک ماتریکس کروماتوگرافی نسبتا ارزان با ظرفیت

پایان نامه
Previous Entries منابع پایان نامه درمورد عرضه کننده، بیوتکنولوژی Next Entries منابع پایان نامه درمورد مدل سازی، انفورماتیک، پایگاه اطلاعات، توزیع فراوانی