منابع پایان نامه درمورد عرضه کننده، بیوتکنولوژی

دانلود پایان نامه ارشد

ساكاریدی كه در ایجاد ایمنی بواسطه سلول T حائز اهمیت هستند قابل بررسی نیستند چون سكانس ژنومی برای پلی ساكاریدها وجود ندارد، درثانی همیشه مدل حیوانی مناسب برای بررسی ایمنی زائی از معضلات این روش بوده است (202).
2-23-ادجوانت ها
به دلیل پائین بودن قدرت ایمنی زایی واکسن های طراحی شده، کاربرد ادجوانت ها ضروری به نظر می‌رسد. ایده کاربرد ادجوانت ها در تقویت ایمنی زایی واکسن ها به دهه‌های ابتدائی قرن بیستم بر می‌گردد.
در تحقیقات صورت گرفته در دهه 1920 در زمینه تولید سرم حیوانی جهت درمان انسان مشخص شد که اگر مواد خاصی بخصوص نمک های آلومینیوم به آنتی ژن اضافه گردند یا با آنتی ژن به حالت محلول درآیند به شدت تولید آنتی بادی را افزایش می دهد، به عبارت دیگر همچون ادجوانت عمل می کنند. هیدروکسید آلومینیوم ( آلوم ) هنوز ماده ای است که به طور وسیع همراه با توکسوئید های دیفتری و کزاز مورد استفاده قرار می گیرد و قابل اعتماد ترین ادجوانت جهت مصارف انسانی می باشد. این ادجوانت جزء ادجوانت های غیر ارگانیک است. نمک های آلومینیوم جزء نمک های رایج در واکسن ها هستند که در ایالت متحده امریکا به فروش می رسند و بیش از 70 سال به عنوان ادجوانت کاربرد داشته اند. در ایمونولوژی ادجوانت ها به عنوان ماده‌ای هستند که سیستم ایمنی را تحریک کرده و بدون هیچگونه اثر آنتی ژنیک اختصاصی پاسخ واکسن را افزایش می دهند (203).
لفظ ادجوانت از لفظ لاتین adiuvant به معنای کمک (helporaid) گرفته شده است. در اصل ادجوانت تسریع کننده پاسخ های ایمنی اختصاصی آنتی ژن و به تقویت بخشیدن به آن و یا دوام مدت زمان آن می شود، که در ترکیب (combination) با آنتی ژن‌های اختصاصی واکسن مورد استفاده قرار می گیرد. ادجوانت ها عمل خودشان را توسط تقلید از مولکول هایی که تحت عنوان evolutionarily conserved molecules در میکروب ها که PAMP نامیده می شوند، نظیر میکروزوم ها، لیپوپلی ساکارید و ترکیباتی در دیواره باکتری و dsRNA وssRNA وDNA محتوی CpG غیر متیله، انجام می دهند (203). از آنجایی که سیستم ایمنی به شکلی تکامل یافته است که آنتی ژن های اختصاصی را شناسایی کند مخلوط یک ادجوانت با واکسن ها، پاسخ های ایمنی ذاتی به آنتی ژن را توسط تقویت عملکرد سلول های دندریتیک (DC)، لنفوسیت ها و ماکروفاژها به صورت تقلید از عفونت طبیعی، تقویت می کند . ادجوانت ها به چند گروه تقسیم می شوند:1- ادجوانت های In organic نظیر نمک های آلومینیوم،2- ادجوانت های ارگانیک نظیر ترکیب squalene که بیشتر در واکسن های حیوانی رایج هستند.3- Oil-based، نظیر CFA و IF.4- Virosomes که شامل یک هم آگلوتینین متصل به غشا و نورآمینیداز مشتق از ویروس آنفلوآنزا می باشد.5- لیگاندهای Toll-like receptor (204).
ادجوانت کامل فروند (CFA) یک محلول از آنتی ژن است که در روغن معدنی emulsifed شده و به عنوان یک عامل تقویتی استفاده می‌شود. این ادجوانت مایکوباکتریوم غیرفعال یا کشته شده است (معمولاً مایکوباکتریوم توبرکلوزیس)، در حالی که فرم ناکامل آن یا IFA اجزای مایکوباکتریوم را ندارد و صرفا امولوسیون آب در روغن معدنی است که نام این ادجوانت ازJules T.Freund گرفته شده است.CFA در تحریک ایمنی سلولی موثر است وممکن است که به تقویت تولید ایمونوگلوبولین های خاصی منجر شود ولی این تاثیر بستگی به مدل حیوانی دارد که مورد استفاده قرار می گیرد. استفاده از این ادجوانت به علت توکسیسیتی در انسان مجاز نمی باشد. حتی استفاده از این ادجوانت در حیوانات نیز بسته به نوع استفاده از آن مقررات و قوانینی دارد و دلیل آن این است که واکنش این ادجوانت در بدن دردناک است و می تواند منجر به تخریب بافتی گردد. تزریق CFA بایستی به صورت زیرپوستی (SC) و یا داخل صفاقی (IP) باشد. به دلیل اینکه تزریقات داخل پوستی (ID) ممکن است موجب ایجاد اولسر و نکروز شود و تزریق داخل عضلانی (IM) آن می تواند منجر به زخم عضلانی موقت یا دائم گردد و در حالت تزریق داخل وریدی ،ممکن است باعث ایجاد آمبولیسم لیپیدی ریوی (pulmonary lipid embolism)شود.CFA منجر به تحریک فاکتور نکروز دهنده تومور نوکروزیس (TNF) نیز می شود (205).
با درک جدید از فرآیندهایی که منجر به تحریک لنفوسیت‌ها و ایجاد سلول های خاطره‌ای می‌گردند تلاش قابل ملاحظه ای جهت تولید ادجوانت های بهتر مخصوصا برای پاسخ های با واسطه سلول T صورت گرفته است. اما باید تاکید کرد که هنوز هیچکدام از ادجوانت‌های جدید جهت استفاده معمول در انسان مورد پذیرش قرار نگرفته اند. ادجوانت ها در مکانسیم، رفتار و هم چنین از نظر ماهیت بسیار متنوع هستند و از این رو از لحاظ طبقه بندی گروه هتروژن و بزرگی را تشکیل می دهند (205) .
مثلا در برخی طبقه بندی ها ادجوانت ها را بر اساس عملکرد به سه دسته 1) ادجوانت های محرک سیستم ایمنی 2 ) ادجوانت های حامل 3 ) ادجوانت های سیستم تحویل دهی واکسن تقسیم می نمایند . در برخی موارد ادجوانت ها به دو دسته 1 ) پلاریزان 2 ) غیر پلاریزان تقسیم می نمایند. که این تقسیم بندی مرتبط با اثرات ایمونو مودلاتوری ادجوانت ها می باشد. مثلا اگر ادجوانتی قادر به القای پاسخ های Th1 و یا Th2 باشد در گروه ادجوانت های پلاریزه کننده پاسخ های ایمنی قرار می گیرد. اما اگر یک ادجوانت نتواند الگوی پاسخ ایمنی را تغییر دهد از نوع ادجوانت ها ی غیر پلاریزان تقسیم بندی می گردد (205).
امروزه با پیدایش نانو ذرات و هم چنین ژن های محرک سیستم ایمنی که به ادجوانت های ژنتیکی معروف می باشند گسترده ادجوانت ها هم چنان رو به فزونی می باشد و در واقع با پیدایش ادجوانت های نسل جدید دیگر یک تقسیم بندی منسجم و فراگیر نمی توان برای ادجوانت ها قائل شد ( 206).
ادجوانت‌ها با مکانیسم های متنوعی پاسخ های ایمنی ضد واکسن ها را بهبود می بخشند ازجمله (206):
• تحریک سلول های سیستم ایمنی و افزایش ترافیک سلولی به منطقه
• تحریک و بلوغ سلول های عرضه کننده آنتی ژن و افزایش بیان مولکول های کمک تحریکی و سایتو کاین های التهابی در آن ها
• رسوب دهی آنتی ژن و افزایش مدت زمان مجاورت سیستم ایمنی با آنتی ژن
• افزایش تکثیر غیر اختصاصی لنفوسیت ها ی سیستم ایمنی
• افزایش بقای لنفوسیت های اختصاصی واکسن ( سلول های خاطره ای )
• افزایش ورود آنتی ژن به سلول های سیستم ایمنی ، خصوصا سلول های عرضه کننده آنتی ژن
• القای شیفت سایتو کاینی مناسب (Th 1/Th2 ) برای واکسن
• تحریک اختصاصی زیر جمعیت های لنفوسیتی
• تمایز سلول های پیش ساز به سلول های عرضه کننده توانمند در موضع
• تحویل دهی کارا و موثر آنتی ژن به سلول های سیستم ایمنی
• کاهش مقدار آنتی ژن مورد نیاز
• افزایش پاسخ های سیستم ایمنی به واکسن (206) .
2-24-به دست آوردن قطعه DNA یاژن مورد نظر
قطعه DNA یا ژن مورد نظر را می توان از ژنوم کامل یک موجود با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده تهیه کرد. همچنین اگر توالی DNA مورد نظر مشخص باشد، می توان از طریق PCR آن را تکثیر کرد (207).
2-25-کلونینگ ژن
کلونینگ ژن یعنی تولید مقادیر کافی از آن ژن خاص به صورت خالص. با کلون کردن ژن مورد نظر را از داخل یک ژنوم بزرگ به داخل یک حامل ساده و کوچک منتقل می کنیم. کلونینگ از طریق آنزیم های محدودکننده و لیگاز انجام می گیرد (207).
2-25-1- مراحل کلون کردن ژن
1- جدا کردن قطعه ای از یک منبع DNA حامل ژنی که باید کلون شود.
2- اتصال قطعه مورد نظر به حامل یا وکتو، تا یک مولکول نوترکیب DNA یا یک کایمر ایجاد شود.
3- ترانسفورماسیون DNA نوترکیب به باکتری یا میزبان مورد نظرکه حامل درون سلول میزبان تکثیر یافته وهم از خود و هم ژنی که حمل می کند نسخه های متعدد تولید می کند.
4- شناسایی و جداسازی کلونی های حاصل از باکتری که حامل ژن مورد نظر می باشند(غربالگری) (208).
2-25-2- میزبان کلونینگ
از جمله میزبان ها می توان به pET، سویه های E.coli k12،JM109وDH5α اشاره کرد.این میزبان ها دارای recA- و recA+ می باشند(فاقد ژن سازنده آنزیم اندونوکلئاز A و ژن سازنده آنزیم نوترکیبی). از طرفی این میزبان ها فاقد ژن RNA T7 پلیمراز(RNA پلیمرازی که به پروموتورT7 متصل و نسخه برداری نماید)هستند.این میزبان ها کارایی زیادی در انتقال پلاسمید دارند (209).
2-26- آنزیم های محدود کننده
اغلب این آنزیم ها توالی های 4 یا 6 نوکلئوتیدی قرینه که اصطلاحا پالیندروم نامیده می شوند را شناسایی می کنند.
برای کلونینگ ژن، باید وکتور و DNA مورد نظر که توالی هدف را دارد به قطعات مجزا بریده شوند. که اندونوکلئازهای محدودکننده جهت برش در ناحیه خاصی از DNA در بیوتکنولوژی مولکولی کاربرد دارند که دو نوع برش را می‌توانند ایجاد کنند:
1- برش با ایجاد انتهای چسبنده
2- برش با ایجاد انتهای صاف (210).
2-26-1-آنزیم لیگاز
این آنزیم باعث اتصال قطعات DNA و پلاسمید مکمل می شود. این آنزیم برای اولین بار از باکتریوفاژ T4 جداشد. این آنزیم یک باند شیمیایی جدید بین گروه هیدروکسی کربن 3 یک مولکول داکسی ریبوز با گروه فسفات کربن 5 مولکول داکسی ریبوز بعدی برقرار می کندکه به نام باند فسفودی استری معروف است. این آنزیم همچنین دو انتهای صاف را هنگامی که در مجاورت آنزیم در تماس با هم قرار می گیرندبه هم متصل می کند (211).
2-27- حامل های کلونینگ
یک حامل کلونینگ باید دارای یک منطقه همانندسازی باشد، تا قادر به تولید تعداد نسخه های زیاد از ملکول DNA نوترکیب درسلول میزبان باشد. همچنین بایدیک یا چند ژن شناساگرداشته باشد. این زن ها که باعث ایجاد مقاومت به بعضی از آنتی بیوتیک ها در سلول میزبان می شوند یک عامل شناسایی برای ملکول های نوترکیب به حساب می ایند. حامل کلونینگ محل های برش منفرد برای این آنزیم ها را دارد که به آن محل کلونینگ یا پلی لینکر گویند. حامل باید نسبتا کوچک باشد، چون ملکول های بزرگ در حین خالص سازی شکسته می شوند و از طرفی ملکول‌های کوچکتر راحت تر توسط میزبان جذب می شوند. از انواع حامل ها می توان به پلاسمیدها باکتریوفاژها، کاسمیدها، حامل های یوکاریوتی و کروموزوم های مصنوعی اشاره کرد(208). هر ترادفی از DNA را می توان با درج آن در ناقلی مانند پلاسمید یا فاژ که توانایی تکثیر در باکتری ها را داشته باشد، کلون نمود. که در نتیجه کلون کردن مقادیر زیادی از یک ملکول اولیه تولید می شود. اگر ناقل بیانی باشد، علاوه بر تکثیر ژن مورد نظر قادر به بیان ژن موردنظر نیز می باشد (208).
2-28-غربالگری وجود ژن
پس از مرحله ترانسفورماسیون ضروری است که با ساده ترین روش ممکن سلول هایی که ساختار صحیح را دریافت کرده اند شناسایی شوند. این شناسایی در دو مرحله انجام می شود. ابتدا سلول های حاصل از ترانسفورماسیون بر روی محیط کشت حاوی آمپی سیلین کشت داده می‌شوند. فقط سلول‌هایی که حاوی پلاسمید هستند در این شرایط رشد خواهند کرد. سلول‌های ترانسفورم نشده به آمپی سیلین حساس بوده از بین خواهند رفت. در مرحله بعدی سلول‌های رشد یافته جهت وجود ژن مورد نظر ارزیابی می شوند (208).
2-29-انواع سیستم های بیانی و مزیت اشرشیاکلی
مهمترین نکته در تولید پروتئین نوترکیب انتخاب میزبان می باشد که این انتخاب در تولیدوتخلیص پروتئین نوترکیب وکیفیت محصول اثر دارد. برای انتخاب سیستم بیان کننده مناسب برای تولید یک پروتئین نوترکیب، باید عواملی مانند نوع میزبان، شرایط رشد سلول، میزان سطح بیان و همچنین لزوم استفاده از یک سیستم دقیق کنترل کننده بیان را مورد توجه قرار داد (212).
امروزه از سیستم های بیان کننده متعددی برای تولید پروتئین های نوترکیب استفاده می شود که در دو گروه عمده سیستم های پروکاریوت نظیر اشرشیاکلی،باسیلوس سوبتلیس و…وسیستم های یوکاریوتی مانند مخمرها، قارچ ها، حشرات وسلول های پستانداران تقسیم می شوند(213).
سیستم بیان کننده اشرشیاکلی متداول ترین میزبانی است که برای بیان پروتئین های نوترکیب مورد استفاده قرار می‌گیرد چرا که از طرفی شاخص های مثبت یک باکتری از جمله توانایی رشد

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه با واژگان کلیدی عصر جاهلی، نشاط و پویایی، اختلافات سیاسی، اجتماعی و فرهنگی Next Entries پایان نامه با واژگان کلیدی تصویرپردازی، عاشق و معشوق، جامعه بشری، اغراض شعری