منابع پایان نامه درمورد شستشوی، لیتر)، فالکون، ایمیدازول

دانلود پایان نامه ارشد

خارج شده و برای مراحل بعدی آماده می گردد.
3-15- رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلوR-350
این روش رنگ آمیزی ، ساده ،ارزان و نسبتا حساس می باشد و رنگ برای مدت های طولانی ثابت می ماند.در این روش مراحل ثبوت و رنگ آمیزی پروتئین ها به صورت همزمان انجام می شود.
مواد و وسایل مورد نیاز:
قرص کوماسی بلو R-350 (فارماسیا)
متانول(مرک)
اسیداستیک(مرک)
ظرف درب دار شیشه ای
آب مقطر
3-15-1- روش تهیه محلول ها
محلول رنگ آمیزی:
یک قرص کوماسی بلو در 80 میلی لیتر آب مقطر و 120 میلی لیتر متانول حل و به عنوان محلول استوک نگهداری شد. در هنگام استفاده یک حجم محلول استوک با یک حجم محلول اسیداستیک 20 درصد (در آب مقطر) مخلوط گشت. قبل از استفاده با کاغذ واتمن صاف گردید.
محلول رنگ بر:
با ترکیب 200 میلی لیتر متانول ،100 میلی لیتر اسیداستیک گلایسیال و 700 میلی لیتر آب مقطر تهیه گردید.
3-15-2- روش رنگ آمیزی
ژل در ظرف درب دار در حجم100 میلی لیتر محلول رنگ 1-2 ساعت روی شیکر قرار گرفت. سپس محلول تخلیه و ژل با آب مقطر شستشو داده شده و محلول رنگبر اضافه گردید و روی شیکر قرار گرفت.این عمل چند بار انجام شد تا زمینه شفاف و باندها ظاهر گردیدند.
3-16- وسترن بلاتینگ
در این روش باند های پروتئینی از ژل به غشایی مانند نیتروسلولز منتقل می گردد که قابلیت اتصال و تثبیت پروتئین ها را دارد. برای تشخیص پروتئین های متصل شده به غشا از آنتی بادیها استفاده می گردد.امروزه وسترن بلاتینگ به طور گسترده در تحقیقات و تشخیص به کار می رود.انتقال پروتئینها توسط نیروی الکتریکی در تانک الکتروفورز یا به روش نیمه خشک انجام می‌گیرد.
در این پژوهش به منظور تایید ایمونوژیسیته نمونه HPV واکسن کاندید چند اپی توپی از روش وسترن بلات با انتقال در تانک استفاده شد.
3-16-1- انتقال در تانک
روش انتقال در تانک به طور معمول در بافر تریس-گلایسین انجام می گیرد. این بافر برای انتقال انواعی از پروتئین ها که به روش SDS-PAGE جدا شده اند،مناسب است.
مواد و وسایل مورد نیاز:
کاغذ نیتروسلولز
کاغذ واتمن ضخیم
تریس
گلایسین
متانول
آب مقطر
اسفنج
تانک انتقال و ضمائم
منبع نیرو

روش انتقال:
مقداری از بافر انتقال( تریس 25 میلی مولار ،گلایسین 192 میلی مولار و متانول 15 درصد به حجم 2 لیتر در آب مقطر) در ظرفی ریخته شد وژل پس از جدا نمودن بخش متراکم کننده، حداقل 10 دقیقه در آن قرار گرفت . ورقه ای از غشا هم در بافر انتقال قرار گرفت. اسفنجها و کاغذ صافیهای خیس شده روی هم قرار گرفته و ژل هم به آنها اضافه شد. سپس کاغذ نیتروسلولز روی ژل قرار گرفته و کاغذ صافیها و اسفنج به مجموعه اضافه گشت. مجموعه در قالب پلاستیکی محکم شده ، در تانک پر شده با بافر قرار گرفته و در طی شب با ولتاژ 20 ولت الکتروفورز گشت. غشا با روش رنگ آمیزی قابل برگشت پانسو-اس بررسی گردید تا از انتقال اطمینان حاصل گردد.
3-16-2- مسدودسازی غشا
مناطق آزاد غشا پس از بلاتینگ باید مسدود شوند تا آنتی بادی نشان دار به صورت غیر اختصاصی به آن متصل نگردند و در تشخیص اختلال ایجاد کنند. به این منظور از BSA 1.5 درصد و TWEEN 20 0.05 درصد در بافر TBS استفاده شد. غشا 1 ساعت در دمای اتاق روی شیکر در این محلول مسدود گردید.
3-16-3- تشخیص با آنتی بادی
پس از مسدودسازی غشا با آنتی بادی ها و اتصال اختصاصی آنها می توان باند مورد نظر را تشخیص داد. ابتدا آنتی بادی اولیه و سپس به آن آنتی بادی ثانویه کونژوگه با آنزیم متصل می‌شود و محل باند پس از اضافه کردن سوبسترا رنگی و مشخص می گردد.

مواد و وسایل مورد نیاز:
بافر TBS (تریس 20 میلی مولار وکلریدسدیم 15 مولار در آب مقطر)
بافر TBS-T (Tween20 0.05 درصد در TBS)
آنتی بادی اولیه (anti-Histag)
آنتی بادی ثانویه (آنتی موشی کونژوگه با پراکسیداز سیگما)
DAB (Sigma)

روش آزمایش:
پس از مسدود سازی ، غشا سه بار با TBS-T شسته شده و 1 ساعت در آنتی بادی اولیه رقت (1 به 1000) قرار گرفت.
در ادامه غشا 4 بار شستشو گشته و 1 ساعت در آنتی بادی ثانویه
(رقت 1 به 5000( قرار داده شد. سپس 4 بار شستشو داده شد و به مدت 15 دقیقه در معرض TMB-Blotting قرار گرفت. بعد از ظهور باندها ، غشا با آب مقطر شستشو و پس از خشک شدن در محلی تاریک نگهداری شد.
3-17-تخلیص پروتئین با یون های نیکل متصل به ماتریکس NTA نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی روی ماتریکس Ni-NTA
از آنجا که پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی با دنباله هیستیدینی بیان شده است،تخلیص پروتئین به روش کروماتوگرافی تمایلی انجام می شود.این روند براساس میل ترکیبی بخشی از پروتئین (در اینجا دنباله هیستیدینی) به یون های نیکل متصل به ماتریکس NTA طراحی شده است. در یک pH بهینه بهترین اتصال بین این دو اتفاق می افتدو بقیه پروتئین ها از ستون خارج می شوند. با شستشوی رزین با ماده ای که بتواند برای اتصال به ماتریکس با پروتئین مورد نظر رقابت کند اتصال پروتئین –ماتریکی سست شده و در نهایت پروتئین مذکور از ستون خارج می شود.شرایط کشت و القاء بیان ، بر روند تولید پروتئین نوترکیب موثر است و از این طریق مستقیما استراتژی به کار گرفته شده برای تخلیص پروتئین را تحت تاثیر قرار می دهد. از طرف دیگر مواردی همچون قدرت یونی pH و حضور یک ماده برای حذف پیوندهای غیر اختصاصی ، در برقراری اتصال بهینه پروتئین-رزین موثر است،لذا توصیه می شود قبل از تلخیص در مقیاس انبوه و جهت کسب شرایط بهینه ،ابتدا تخلیص در مقیاس اندک و به صورت تجربی انجام گیرد.
3-18-بهینه سازی تخلیص
همان گونه که اشاره شد جهت بهینه سازی تخلیص پروتئین HPV غلظت های مختلف ایمیدازول (در بافر لیز کننده)و pHهای مختلف بافرهای تخلیص ودر مقیاس اندک (روشbatch)بررسی گردید و بهترین شرایط برای به دست آوردن بیشترین میزان پروتئین نوترکیب محلول انتخاب شد.
3-19-ارزیابی پروتئین تخلیص شده با روش SDS-PAGE
برای ارزیابی پروتئین تخلیص شده از روشSDS-PAGE وتست برادفورد و اسپکتروفوتومتری بهره گرفته شد. پروتئین‌ها در طول موج 280 نانومتر جذب دارند بنایراین جذب نوری با این طول موج برای محلول پروتئین ما خوانده شد.
3-20-تخلیص انبوه پروتئین نوترکیبHPV واکسن کاندید چند اپی توپی
پس از به دست آمدن شرایط بهینه تخلیص، بیان پروتئین در مقیاس بالا انجام شد، سپس خروج پروتئین از سلول به کمک بافر لیزکننده (بافر اتصال حاوی لیزوزیم) و سونیکاتور انجام شد. پروتئین HPV که دارای دنباله هیستیدینی است با روش کروماتوگرافی تمایلی توسط رزین Ni-NTA تخلیص شد.
مواد و وسایل مورد نیاز:
رسوب جمع آوری شده از پروتئین بیان شده در مقیاس بالا
قرص مهارکننده پروتئاز (Protease inhibitor) بدون EDTA (Roche)
لیزوزیم استوک(10mg/ml)
به این منظور 10mg پودر لیزوزیم در 1ml آب مقطر تزریقی حل و در 20- درجه سانتی گراد نگهداری می شود.
*غلظت محلول کاری 0.5-1mg/ml استفاده می شود ،لذا بسته به میزان غلظت به کار رفته باید رقیق سازی محلول استوک در محیط واکنش را در نظر گرفت.
4. بافر اتصال یا بافر تعادل pH=8 (برای 50 میلی لیتر)
Tris-HCl (Merck) (20mM) 0.158 گرم
NaCl (0.5M)1.46 گرم
Immidazole (20mM)0.068 گرم
Triton-X100 (0.1V/Vدرصد)0.05 میلی لیتر
مواد فوق در 40ml آب مقطر حل شده و پس از تنظیم pH به حجم50ml می رسد.
6. بافر شستشوی شماره دو(برای 50 میلی لیتر)
مشابه بافر شستشوی شماره یک که حاوی ایمیدازول 70 میلی مولار (0.238 گرم) می‌باشد.
7. بافر شستشوی شماره سه(برای 50 میلی لیتر)
مشابه بافر شستشوی شماره یک که حاوی ایمیدازول 150 میلی مولار (0.511 گرم) می باشد.
8. بافر شستشوی شماره چهار (برای 50 میلی لیتر)
مشابه بافر شستشوی شماره یک که حاوی ایمیدازول 300 میلی مولار (1.021 گرم) می باشد.
9. بافر شویش برای(50 میلی لیتر)
مشابه بافر شستشوی شماره یک که حاوی ایمیدازول 500 میلی مولار (1.702 گرم) می‌باشد.
10. رزین Ni-NTA
*این رزین به صورت تجاری به نسبت 1:1 در محلول نگهدارنده (حاوی الکل اتانول) می باشد و در یخچال نگهداری می شود.
11. محلول NiSO4 (0.1M)(برای 50 میلی لیتر)
به این منظور 1.41g پودر NiSO4.6H2O در 50ml آب مقطر حل شد و در یخچال نگهداری شد.
12. NaOH (0.5M)(برای 50 میلی لیتر)
به این منظور NaOH 1g در 50ml آب مقطر حل شد.
13. الکل اتانول (25 V/V درصد) برای 100 میلی لیتر)
به این منظور 25ml100ml رسید.
14. فیلتر0.4mm
15. ستون کروماتوگرافی
16. سونیکاتور
17. سانتریفوژ یخچال دار
18. ورتکس
19. سر سمپلرفاپندورفو فالکون استریل
20. ظرف یخ
روش کار:
تخلیص پروتئین شامل چند مرحله است:
الف) آماده سازی نمونه:
رسوب باکتریایی هر فالکون (جمع آوری شده از 250ml کشت باکتریایی بیانی)در 10ml بافر اتصال پخش گردید.این کار به کمک ورتکس انجام شد.(معمولا به ازای هر100ml محیط کشت،4ml بافر اتصال افزوده می شود.)
به سوسپانسیون ایجاد شده از استوک لیزوزیم و با غلظت نهایی 0.5mg/ml (500µl برای هر فالکون)افزوده شد و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق به آرامی شیک شد.
پس از طی زمان مذکور یک چهارم قرص مهارکننده پروتئاز به هر فالکون افزوده شد.آنگاه فالکون ها جهت سرد شدن به مدت 10-5 دقیقه در یخچال قرار گرفت.
نمونه های باکتریایی طی سونیکه روی یخ کاملا لیز شدند.این روند تا روان شدن کامل سوسپانسیون ادامه یافت.سپس محتویات هر فالکون با هم مخلوط شد.
سانتریفوژ باکتری ها در دمای 4 درجه سانتی گراد، به مدت 20 دقیقه و در 9000rpm توسط سانتریفوژ یخچال دارانجام شد.به این ترتیب پروتئین های محلول از اجزای غیر محلول باکتری جدا گردید.
محلول رویی جهت خروج کامل مواد نامحلول از فیلتر 0.4mm عبور داده شد.
ب) آماده سازی و به تعادل رساندن رزین:
7. پس از تکان دادن آرام محلول رزین، مقدار2ml رزین تازه (که حاوی یک میلی لیتر رزین خشک در 1ml محلول نگهدارنده است)برداشته شدو در یک اپندورف قرار گرفت.این مقدار رزین برای تخلیص 1 لیتر محیط کشت حاوی پروتئین کافی است.
8. رزین فوق به آرامی به مدت 30 ثانیه ودر 1000rpm سانتریفوژ شد.
9. محلول رویی دور ریخته شد و هم حجم آن آب دیونیزه اضافه گردید،سپس به آرامی پی پتاژ صورت گرفت و مجددا سانتریفوژ مطابق مرحله 8 انجام گرفت.
10. برای اطمینان از خروج کامل ماده نگهدارنده می توان مرحله 9 را تکرار کرد ،سپس رزین به ستون کروماتوگرافی منتقل شد.
11. پس از خروج کامل آب مقطر از انتهای ستون، مقدار10ml (10 برابر حجم رزین خشک) بافر تعادل(اتصال)به رزین افزوده شد و پس از پی پتاژ آرام برای درگیر کردن همه بیدهای رزین، اجازه داده شد تا این محلول به آرامی از انتهای ستون خارج شود.این امر باعث کاهش پیوندهای غیراختصاصی می شود.
ج) مجاورت نمونه و رزین:
12. رزین پس از به تعادل رسانی از ستون خارج شده و به آرامی به محتویات فالکون ها از مرحله 6 افزوده شد.سپس به مدت 1 ساعت روی یخ و به آرامی شیک شد. با این کار به پروتئین مورد نظر فرصت کافی برای اتصال به بیدهای رزین داده می شود.
13. محتویات فالکون ها که حاوی کشت باکتری و رزین می باشد پس از 1 ساعت به آرامی داخل ستون ریخته شد، به این ترتیب پروتئین های متصل نشده به رزین از ستون خارج شدند. محلول زیری خارج شده (FT)(Flow-through) جمع آوری شد.
د) شستشوی رزین:
14. ستون به طور متناوب با 5ml (5برابر حجم رزین خشک)از هر یک از بافرهای چهارگانه شستشو، شسته می شود و محلول عبوری زیری از هرکدام از محلول ها(تحت عنوان W1-W4)در فراکش های 0.5-1ml جمع آوری می شود.در این حالت با زیادشدن غلظت ایمیدازول ،به تدریج اتصالات سست یا غیر اختصاصی پروتئین های

پایان نامه
Previous Entries پایان نامه با واژگان کلیدی ناخودآگاه، تصویرسازی Next Entries پایان نامه با واژگان کلیدی تصویرپردازی، آرامش خاطر، رومانتیسم، امرؤالقیس