(37).
2-9-4-5 محلول لویتسكي
اين تثبيت كننده براي جلوگيري از كوتاه شدن بيش از حد كروموزوم‌ها استفاده مي‌شود. اين ماده مخلوطي از اسيد كروميك يك درصد و فرمالدئيد ده درصد است. اسيد كروميك موجود در محلول از اكسيداسيون اجزاي ساختماني كروموزوم‌ها جلو گیری نموده و فرمالدئيد موجب محكم شدن اجزاء كروموزومی مي‌شود. مدت زمان لازم براي تثبيت 24 تا 48 ساعت است (21 و9 ).
2-9-4-6 محلولهای تثبیت کننده دیگر
یکسری از محلولهای تثبیت وجود دارند که به تثبیتگرهای یکشبه57 نیز موسوماند. وجه تسمیهی این گروه در این مطلب نهفته است که این محلولها قادرند سلولها را در کمتر از 12 ساعت بکشند و باعث تثبیت و عدم تخریب محتویات سلولی و هستهای گردند(47). در جدول زیر شرح درست نمودن برخی از آنها را آوردهایم.
جدول2-3 نحوهی تولید تثبیت کنندههای دیگر در آزمایشگاه
نحوه تولید در آزمایشگاه
نام محلول به لاتین
Formaldehyde (37-40%) ——————10 ml
Distilled water ——————————90 ml
Formalin Solution (10% unbuffered)
Formaldehyde (37-40%) —————– 20 ml
Distilled water —————————– 80 ml
Formalin Solution (20%, unbuffered)
Formaldehyde (37-40%) —————– 100 ml
Distilled water ————————— 900 ml
NaH2PO4 ———————————- 4.0 g
Na2HPO4 (anhydrous) ——————- 6.5 g
Formalin Solution (10%,bufferedneutral)
Formaldehyde (37-40%) ————— 10 ml
Ethanol (80%) ————————– 90 ml
Formalin-Alcoholic Solution
Picric acid (saturated) ——————- 75 ml
Formaldehyde (37-40%) —————— 25 ml
Glacial acetic acid ————————- 5 ml
Bouin Solution
Calcium Acetate ———————- 0.5 g
Zinc Acetate ————————— 5.0 g
Zinc Chloride ————————– 5.0 g
0.1M Tris Buffer made above ——- 1000 ml
Zinc Fixative
2-9-5 نگهداري نمونه‌ها
براي نگهداري طولاني مدت ريشه‌ها و استفاده در فرصت مناسب، مي‌توان آنها را پس از خارج كردن از محلول تثبيت و آبكشي با آب مقطر، در الكل اتيليك 70 درصد در دماي 4 درجه سانتي‌گراد به مدت حداقل 24 ساعت نگهداري نمود و به تدريج جهت تهيه نمونه ميكروسكوپي مورد استفاده قرار داد (43).
2-9-6 هيدروليز
براي تهيه نمونه ميكروسكوپي، بايد بافت‌هاي مذكور به منظور اسكواش و له كردن آماده شوند، يعني نمك‌هاي پكتيني ديواره سلولي حل شود تا امكان دستيابي به سلول‌هاي منفرد و پراكنده از توده سلولي فراهم شود. مرحله هيدروليز مهمترين مرحله قبل از رنگ آميزي مواد ژنتيكي است. به منظور هيدروليز ريشه‌ها، پس از خارج كردن آنها از تثبيت كننده و آبكشي با آب مقطر، نمونه‌ها در ماده هيدروليز كننده از جمله اسيد كلريدريك یا هیدروکسید سدیم يك نرمال در دماي 60 درجه سانتي‌گراد به مدت 10 تا 15 دقيقه قرار داده مي‌شوند (36 و 37 و 39).
اسيد كلريدريك املاح پكتيك ديواره مياني سلولها را حل نموده و به پخش شدن سلولها كمك مي‌كند. (5، 18). مدت زمان لازم و درجه حرارت مناسب در عمل هيدروليز با اسيد كلريدريك بسته به نوع گياه و روش رنگ آميزي متفاوت است (37).
از آنزيم پكتیناز هم مي‌توان براي هيدروليز استفاده كرد. پكتيناز در نرم كردن نوك ريشه‌ها خيلي موثر است و در غلظت و تركيبات متفاوتي بسته به نوع مواد، مورد استفاده قرار مي‌گيرد.
2-9-7 رنگ‌آميزي كروموزوم‌ها58
یک مادهی رنگ کننده با کیفیت خوب موجب رنگ آمیزی کروموزوم‌ها به طور خاص، متمایز شدن یوکروماتین و هتروکروماتین از همدیگر و به دست آمدن سیتوپلاسم شفاف با هستک‌های مشخص می‌شود(37). روش‌های زیر در رنگ‌آمیزی کروموزوم‌های گیاهی به صورت وسیعی کاربرد دارند (39).
2-9-7-1 رنگ آميزي با استو اورسئين59
اين رنگ توسط لاكور براي رنگ‌آميزي كروموزوم پيشنهاد شد. اين رنگ نسبت به كارمن انتخابي عمل مي‌كند و در بسياري از اورگانيسم‌ها، براي تهيه نمونه‌هاي كروموزومي ماندگار و شفاف مورد استفاده قرار گرفته است (37). اين ماده به صورت 1% و 2% تهيه و مورد استفاده قرار مي‌گيرد. نحوه تهيه آن مانند استوكارمن است فقط بجاي پودر كارمن از اورسين استفاده مي‌شود.
2-9-7-2 رنگ آميزي با فولگن
روش رنگ آميزي با فولگن توسط هيتز (1936)، دارلينگتون و لاكور (1938)، هيلاري (1940) و باتاگليا (1957) پيشنهاد و تكميل شد. اين رنگ به طور انتخابي DNA را رنگ‌آميزي مي‌كند و براي بيشتر مواد گياهي قابل استفاده استفاده است (5 و 37). از مشخصات اين رنگ اين است كه كاملاً بي‌رنگ بوده و در تماس با ريشه‌ها بدون استفاده از حرارت حتي در دماي محيط رنگ آن به صورتي مايل به بنفش تغيير پيدا مي‌كند. همچنين در اثر رنگ‌آميزي با اين ماده ناحيه نوك ريشه رنگ آميزي مي‌شود. اين امر سبب مي‌گردد تا بتوان به راحتي قسمت مريستم نوك ريشه را از بقيه ريشه جدا نمود و مورد مطالعه قرار داد. براي محو كردن يا خنثي نمودن رنگ اضافي از روي لام‌ها، قبل از دائمي كردن لام‌ها مي‌توان از محلول آب حاوي SO2 كه يك محلول سفيد كننده است استفاده كرد (13). بنابر گزارش سينگ و تولين (1971) از روش رنگ‌آميزي فولگن براي كروموزوم‌هاي جو استفاده كردند. پالمر و هيتز در سال 1973 بعد از مقايسه چند روش مختلف مراحل سيتولوژيكي خاصي را با استفاده از رنگ فولگن براي مطالعه كروموزوم‌هاي سويا ارائه دادند (13).
2-9-7-3 كارمن اسيدي هيدروكلريك الكلي
براي رنگ آميزي با كارمن، 4 گرم كارمن را به 15 ميلي ليتر آب مقطر اضافه كرد و سپس 1 ميلي ليتر HCI غليظ نيز به آن اضافه مي‌گردد. اين محلول به مدت 10 دقيقه جوشانده مي‌شود و پس از سرد شدن 95 ميلي‌ليتر اتانول 85 درصد به آن اضافه مي‌شود و فيلتر مي‌شود. نمونه‌ها بايد به مدت 24 ساعت در اين محلول باشند (13).
2-9-7-4 رنگ آميزي با لاكتوپروپيونيك – اورسين
ديِر (1963) از اين رنگ براي گياهان زراعي زيادي استفاده كرد. اين ماده براي رنگ آميزي گياهاني كه داراي تعداد زيادي كروموزوم و يا داراي كروموزوم بسيار كوچك هستند بسيار مناسب است. در اين رنگ‌آميزي كروموزوم‌ها به طور آني رنگ مي‌شوند، در حالي كه سيتوپلاسم شفاف باقي مي‌ماند. براي رنگ آميزي كروموزوم‌هاي دو گونه از تيره گل گاوزبان60 از اين ماده به مدت يك شب در دماي اتاق استفاده شده است (7).
2-9-7-5 رنگ‌آمیزی با استو‌کارمن
كارمن رنگي قلیایی است و از نوعي شپشك نرم تن61 تهيه مي‌شود. اين رنگ در سال 1921 توسط بلينگ براي رنگ‌آميزي كروموزوم معرفي شد (2). از استوكارمن يك و يا دو درصد (W/V) براي رنگ‌آميزي استفاده مي‌شود. به منظور رنگ‌آميزي با استوكارمن ابتدا مقداري رنگ در يك شيشه ساعت ريخته مي‌شود و چند عدد از ريشه‌هاي هيدروليز شده در داخل رنگ قرار داده مي‌شوند، سپس شيشه ساعت حاوي نمونه‌ها و رنگ به آرامي روي چراغ الكلي حرارت داده مي‌شود. حرارت دادن سبب مي‌شود تا رنگ‌آميزي بهتر و سريع‌تر صورت گيرد. قبل از جوشيدن، شيشه ساعت از روي شعه كنار برده مي‌شود و به مدت 20 دقيقه در دماي اتاق نگهداري مي‌گردد. بعد از اين مدت نمونه‌ها آماده بررسي هستند (42). استوكارمن براي رنگ‌آميزي كروموزوم‌هاي سوماتيكي جو بسيار موثر بوده است (14). اين رنگ شبيه يك تثبيت‌كننده عمل مي‌كند.
2-9-8 له كردن62
پخش كردن سلولها در يك لايه به طوريكه كروموزوم‌ها در سطح سلولي پراكنده شوند جهت بررسي كاريوتيپ بسيار موثر است. در له كردن به تيمار خاصي نياز است تا نمك‌هاي پكتيكي موجود در دیواره‌ی سلول حل گردند و سلول‌هاي منفرد و پراكنده بتوانند از توده سلولي بدست آيند (14). بعد از مرحله رنگ آميزي نوك ريشه‌ها را با تيغ جدا كرده و به منظور بهتر نرم كردن بافت، رنگ‌آميزي بهتر، تورم سلولها و خنثي كردن اثرات اتانول، يك قطره استوكارمن يا اسيداستيك 45 درصد به نمونه واقع روي لام اضافه مي‌شود و براي له كردن لامل را روي آن قرار داده و توسط شیئی مانند انتهاي خودكار، چند ضربه آهسته به لامل وارد می‌کنیم كه اين كار سبب جدا شدن سلولها از يكديگر مي‌شود (2).
2-9-9 دائمي نمودن اسلايدها
لام‌های حاوي نمونه‌هاي خوب و مناسب را مي‌توان براي مدت طولاني نگهداري نمود و در صورت لزوم مجدداً مورد بررسي قرار داد. نگهداري موقت سلولها در مراحل ميتوز و ميوز كه در آن لام با استفاده از محلول رزين يا لاك چسبيده باشند تنها به مدت چند روز امكان‌پذير است. به منظور دائمي نمودن اسلايدها بايستي لامل را حذف نمود و پس از آبگيري مواد روي اسلايد، نسبت به قاب‌گيري دائمي اقدام كرد.
مراحل دائمي كردن اسلايد به شرح زير است (37):
الف) حذف لامل: روش ايده‌آل براي حذف لامل يخ زدن كل اسلايد در ازت مايع و سپس جدا نمودن لامل است. بدين منظور اسلايد با استفاده از يك پنس پايه بلند به مدت 15 ثانيه در داخل كانتينر ازت فرو برده مي‌شود و سپس بدون تغيير با استفاده از يك تيغ، لامل برداشته می‌شود.
ب) آبگيري: اسلايد را بلافاصله به داخل الكل اتيليك 95% به مدت يك دقيقه فرو برده و بعد از آن در داخل الكل خالص قرار مي‌دهند.
ج) قاب كردن: اسلايد را به مدت يك دقيقه در محلول 1:1 روغن اوكاليپتوس- الكل اتيليك خالص قرار داده و پس از آن براي چند دقيقه در روغن اكاليپتوس 10% قرار مي‌دهند و پس از خارج نمودن و خشك كردن اسلايد، با يك قطره كوچك اوپارال63 و يا صمغ كانادابالزام لامل جدیدی را روي مواد چسبانده و با فشار ملايمي آن را صاف نموده و به مدت چند روز خشك گردد.
2-9-10 بررسي ميكروسكوپي
بعد از مشخص نمودن سلول‌هايي كه در مرحله متافاز ميتوز قرار دارند با دوربين عكاسي قابل نصب روي ميكروسكوپ و با عدسي شيئي X100 ، با استفاده از روغن امرسيون عكس‌هاي مناسب جهت آناليز كاريوتيپ گرفته مي‌شود. پس از آن با استفاده از نرم‌افزارهاي متفاوتي از قبيل Photoshop و micromeasure صفات مورفولوژيكي كروموزوم‌ها اندازه‌گيري مي‌شوند و مورد تجزيه و تحليل قرار مي‌گيرند (27 و 30 و 32).
2-10 تجزيه و تحليل‌هاي سيتوژنتيكي
با استفاده از ويژگي‌هاي زير كاريوتيپ‌ها مورد تجزيه و تحليل قرار مي‌گيرند:
2-10-1 نسبت طول بازوي بلند به كوتاه64
اين خصوصيت كاريوتيپي از نسبت اندازه طول بازوي بلند به طول بازوي كوتاه كروموزوم‌ها كه براساس ميكرومتر اندازه‌گيري مي‌شود، به دست مي‌آيد. با استفاده از اين ويژگي، كاريوتيپ گونه‌هاي مختلف مورد ارزيابي قرار مي‌گيرد. هرچند اين نسبت در كاريوتيپ بيشتر باشد، نشان دهنده وجود اختلاف بيشتري بين اندازه كروموزم‌هاي كاريوتيپ است. اين نسبت در كاريوتيپ براي هر كروموزوم بطور جداگانه محاسبه مي‌شود.
2-10-2 نسبت طول بازوي كوتاه به بلند65
با استفاده از اين صفت، اختلاف مورفولوژيكي كروموزوم‌ها براساس تغيير محل سانترومر مورد بررسي قرار مي‌گيرد (37). اين نسبت نيز براي هر كروموزوم بطور جداگانه محاسبه مي‌شود.
2-10-3 طول نسبي كوتاه‌ترين كروموزوم يا شاخص تقارن66
از اين شاخص براي بررسي وضعيت تقارن كاريوتيپ استفاده مي‌شود و از نسبت طول كوتاه‌ترين‌كروموزوم به بلندترين‌كروموزوم كاريوتيپ بدست مي‌آيد. هرچه اين نسبت بيشتر باشد كاريوتيپ متقارن‌تر است. اين شاخص هرچه نزديك به 100 باشد، نشان دهنده اين است كه‌كروموزوم‌ها از لحاظ طول كاملاً مشابه هستند، گرچه ممكن است در ساير خصوصيات كاريوتيپي با هم متفاوت باشند. هرچه مقدار شاخص تقارن كمتر از 100 باشد، نشان دهنده اختلاف بيشتر كروموزوم‌ها از لحاظ طول مي‌باشند (22 و39).
2-10-4 درصد شكل كلي كاريوتيپ67
تعيين درصد شكل كلي كاريوتيپ يكي از روش‌هاي بررسي تقارن كاريوتيپ است كه توسط هوزايوارا (1962) پيشنهاد شده است. وي از اين
