منابع پایان نامه درمورد تغییر رنگ

دانلود پایان نامه ارشد

مزاحم جدا شده و خارج می گردند.
ه) جداسازی پروتئین از رزین:
5. در نهایت شستشوی ستون با5ml بافر جدا کننده انجام گرفت.در این شرایط قوی ترین باندهای متصله از ستون جدا شده و خارج می گردند.فراکشن ها ترجیحا 0.5ml (تحت نام E)جمع آوری می شوند.
و) جمع آوری رزین:
16. به منظور اطمینان از خروج کامل پروتئین ها ،رزین چندبار با بافر جداکننده شستشو شد.
17. هم حجم رزین آب مقطر افزوده شد و با معلق سازی به کمک آن رزین از ستون خارج گردید و در یک اپندورف ریخته شد.
18. سانتریفوژ رزین به مدت30 ثانیه و 1000rpm انجام گردید،سپس آب مقطر از روی آن برداشته شد.
19. هم حجم رزین اتانول 25 درصد افزوده شد و در یخچال قرار گرفت.
ز)بازیابی ستون از پروتئین های مزاحم:
20. سانتریفوژ رزین به مدت 30 ثانیه و 1000rpm برای خروج الکل انجام شد.
21. رزین 3-2 بار با آب مقطر شسته شد سپس داخل ستون ریخته شد.
22. پس از خروج کامل آب مقطر از انتهای ستون،رزین با عبور مداوم(به مدت30 ثانیه)NaOH (0.5m)کاملا شسته شد.
ح)شارژ رزین:
23. شتشوی رزین با آب مقطر برای حذف کامل مواد نگهدارنده و یا NaOH چندین بار انجام گرفت.
24. پس از سانتریفوژ و خروج کامل آب مقطر محلول 0.5M NiSO4 به رزین خشک افزوده شد و به آرامی شیک شد.این کار تا تغییر رنگ رزین(از سفید به سبز-آبی) ادامه یافت.
25. محلول NiSO4 با سانتریفوژ از رزین خارج گردید سپس برای خروج کامل NiSO4 ،رزین چندین بار با آب مقطر شسته شد.
*محیط کشت باکتری پس از افزودن لیزوزیم می تواند در یخچال نیز انکوبه شود اما از آنجا که لیزوزیم در دمای اتاق بهتر عمل می کند انکوباسیون در اتاق صورت گرفت.
*معمولا برای هر لیتر محیط کشت باکتری یک قرص مهارکننده پروتئاز استفاده می شود. به جای استفاده مستقیم از آن می توان یک قرص را در PBS 1ml حل کرده و به هر فالکون 250µl افزود.
*کلیه محلول های تخلیص اعم از بافر اتصال ،شستشو و بافر شویش دارای pH=8 می باشند.
*کلیه بافرها در هنگام استفاده باید سرد باشند،لذا در یخچال نگهداری می شوند.
*نمونه های برداشته شده در مراحل مختلف توسط روش SDS-PAGE بررسی شدند.
*از رزینNi-NTA می توان چندین بار جهت تخلیص استفاده نمود،چنانچه رزین تنها برای تخلیص یک نوع پروتئین استفاده شود نیازی به فرآیند بازیابی ندارند.
*دشارژ شدن رزین بعد از مدت طولانی و با تغییر رنگ آن(از آبی به سفید تا خاکستری) مشخص می شود، لذا هر بار نیاز به پروسه شارز رزین وجود ندارد.
*چنانچه رزین آلوده شده باشد رنگ آن به قهوه ای روشن متمایل خواهد شد.
3-21- دیالیز و تغلیظ پروتئین HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده
به منظور کاهش غلظت بافر نمکی و حذف ایمیدازول از محیط پروتئین ،جهت نگهداری طولانی مدت ،پروتئین تخلیص شده علیه بافر نمکی با غلظت کم دیالیز و سپس تغلیظ شد.
مواد و وسایل مورد نیاز:
EDTA (5mM)(برای 100 میلی لیتر)
به این منظور 1ml از استوک EDTA با غلظت o.5 M ، با آب مقطر به حجم 100ml رسید.
بافر دیالیز PH=8 (برای 5 لیتر)
PBS(1x)
*این بافر باید کاملا سرد باشد، لذا قبل از استفاده در یخچال قرار می گیرد.
3- کیسه دیالیز (sigma)(برای 10 میلی لیتر محلول)
به این منظور حدود 10 سانتی متر از کیسه (با ابعاد 10×6mm)با احتیاط بریده شد.
*از آنجا که میکروارگانیسم های پوست می توانند باعث سوراخ شدن کیسه گردند لذا در هنگام کار از دستکش استفاده می شود.
4- PEG (polyethylene glycol)
5-گلیسرول 99درصد (sigma)
ارلن
گیره
انکوباتور با دمای 6-4 درجه سانتی گراد
روش کار:
– محلول EDTA (5mM) در یک ارلن متوسط ریخته شد و به منظور جوشاندن حرارت دید.
پس از رسیدن محلول فوق به حالت جوش ، کیسه دیالیز بریده شده به آرامی داخل ارلن قرار گرفت و به مدت 5 دقیقه در این محلول جوشانده شد.
کیسه دیالیز از محلول خارج گردید و چند ین بار با PBS(1x) شسته شد.
فراکشن های حاصل از مرحله تخلیص مورد هدف برای دیالیز در داخل کیسه دیالیز ریخته شد، سپس دو انتهای آن را با گیره مسدود کردیم و به صورت آویخته در ارلن حاوی دو لیتر بافر PBS(1x) به مدت 24 ساعت در انکوباتور 4-6 درجه سانتی گراد با شیک بسیار آرام غوطه ور گردید. نکته مهم در این مرحله یکسانی PH بافر دیالیز با بافرهای تخلیص (در اینجاPH=8 ) است. در این مرحله تبادل بافری صورت می گیرد.
جهت تغلیظ، کیسه دیالیز از بافر خارج شد و در PEG جامد مدفون گردید، سپس در یخچال قرار گرفت. در این حال سرد بودن محیط جهت حفظ ساختار پروتئین الزامی است. از آنجا که در این مرحله جذب آب و برخی نمکها صورت می گیرد ، لذا جهت جلوگیری از تغلیظ بیش از حد، میزان حجم هر 30 دقیقه کنترل شد.
پس از آنکه حجم بافر حاوی پروتئین به حدود یک دهم حجم اولیه کاهش یافت، نمونه از کیسه خارج شد و پس از افزودن 50 درصد گلیسرول در 20- درجه سانتی گراد نگهداری گردید.
*مجاورت با بافر دیالیز باعث کاهش غلظت نمکها (برای مثال ایمیدازول 500mM) می گردد.
*مجاورت با PEG باعث حذف آب و تغلیظ پروتئین می گردد. در این حال مقداری از نمک ها نیز خارج می گردد.
*جهت موثر بودن تبادل بافری می توان مرحله 4 را مجددا تکرار کرد و حتی زمان آن را به یک شب افزایش داد.
3-22- ارزیابی پروتئین تخلیص شده
برای ارزیابی پروتئین تخلیص شده از روشSDS-PAGE وتست برادفورد و اسپکتروفوتومتری بهره گرفته شد. پروتئین‌ها در طول موج 280 نانومتر جذب دارند بنایراین جذب نوری با این طول موج برای محلول پروتئین ما خوانده شد.
3-23- روش برادفورد
این روش نسبت به روش های دیگر حساس تر ،سریع تر ، ساده تر و دقیق تر است و برای اندازه گیری پروتئین تا حد میکروگرم به کار می رود.از مزایای دیگر این روش آن است که عوامل مداخله کننده در این روش کمتر از روش های دیگر است. در حالی که در روش بیوره مقادیر کم تریس، آمونیاک و گلیسرول و در روش لوری پتاسیم، منیزیم،EDTA، تریس، تیول دار و کربوهیدرات مزاحمت نشان می دهند. این روش براساس اندازه گیری پروتئین و پپتید به کمک ماده رنگ زای کوماسی بریلیانت جی 250 صورت می گیرد که با کمک دستگاه اسپکتروفوتومتر با نور مرئی قابل خواندن است. ماکزیمم جذب نوری معرف رنگی از 465nm قبل از ترکیب پروتئین به 595nm بعد از ترکیب تغییر می کند.
3-23-1- طرز تهیه محلول های مورد نیاز
3-23-2- طرز تهیه محلول برادفورد
50mg کوماسی بریلیانت بلو G-250(Sigma) در 25ml اتانول مطلق (Merk آلمان) حل شد، 50ml اسید فسفریک 85 درصد (MerK آلمان) به آن اضافه شد و حجم نهایی با آب با آب دو بار تقطیر شده به 500ML رسانده شد. سپس محلول از کاغذ واتمن عبور داده شد( این محلول در دمای 5-0 درجه تا یک ماه پایدار است).تا زمان استفاده در فریزر 20-درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
3-23-3- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین ذخیره با غلظت 1000mg/ml
10 mg سرم گاوی BSA (Sigma) فراکشن پنج در 10 میلی لیتر آب مقطر حل شد و استاندارد ذخیره 1mg/ml ساخته شد. این محلول تا زمان استفاده در فریزر 20- درجه سانتی گراد نگهداری شد.
3-23-4- طرز تهیه محلول استاندارد پروتئین با غلظت 10,100mg/ml
مقدار یک میلی لیتر از استاندارد ذخیره شده برداشته شده و به حجم 10 میلی لیتر رسانده شد.این محلول به صورت روزانه و تازه تهیه شد.
روش کار:
از پلیت 96 تایی برای برادفورد استفاده شد.
مقدار 200µl بافر برادفورد در همه خانه ها ریخته شد.
10 لاندا از نمونه ها و استانداردها به خانه ها اضافه شد و به صورت کامل با بافر برادفورد مخلوط شد.
اندازه گیری پروتئین در محلول هاای با غلظت پروتئین 1 mg/ml تا 0.01
نمونه های استاندارد در محلول های مجهول به صورت دوتایی باشد
10µl از نمونه ضافه گردید.
بعد از گذشت 15 دقیقه از روشن کردن دستگاه اسپکتروفوتومتر جذب نمونه ها در 595nm خوانده شد
منحنی استاندارد با استفاده از OD های به دست آمده از استانداردها رسم شد.
در صورت غلیظ بودن نمونه فرآیند برادفورد برای نمونه های غلیظ با رقیق کردن نمونه تکرار شد.
3-24- بررسی خلوص پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با روش SDS-PAGE
کلیه فراکشن های حاصل از مراحل مختلف تخلیص و بهینه سازی تخلیص پروتئین HPV مطابق دستور کار قسمت قبلی بر روی ژل SDS-PAGE بررسی شد.پس از رنگ آمیزی با کوماسی بلو و نیترات نقره، تایید پروتئین مورد نظر از روی تطابق باندها شاخص وزن ملکولی صورت گرفت.
3-25-بررسی پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی تخلیص شده با وسترن بلات
پس از SDS-PAGE کلیه فراکشن های تخلیصی و رنگ آمیزی ژل فراکشن تاییدی حاوی باند مورد نظر انتخاب شد و وسترن بلات برای تایید نهایی بر روی نمونه مذکور انجام گرفت.به این منظور وجود باند پروتئینی HPV از طریق بلاتینگ با آنتی بادی علیه اپی توپ های HPV و دنباله هیستیدینی تایید شد و هویت آنتی ژنی آن با بلاتینگ با آنتی بادی ضد هیستیدین در برابر نمونه های کنترل بررسی شد.انتخاب غلظت آنتی بادی های به کار رفته با تغییر شرایط بلاتینگ و ایجاد شرایط بهینه جهت کسب نتایج بهتر صورت گرفت.
3-26-پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی
واکسن کاندیدی که برای این پژوهش در نظر گرفته شده است شامل اپی توپ های ایمونوژن L1,L2 ویروس HPV می باشد.
3-27- حیوان آزمایشگاهی
تعداد 12 سر موش Balb/c ماده Inbread از انستیتو پاستور کرج خریداری شد . سن این موش ها 8 -6 هفته بوده و در بخش اتاق حیوانات انستیتو پاستور تهران در دمای 22-20 درجه سانتی گراد و دارای تهویه مناسب نگه داری شدند .
3-28-ادجوانت‌ فروند ناقص
آماده‌سازی واکسن
مواد و وسایل لازم :
– واکسن کاندید یونیورسال 6و11و16و18و31و45HPV-
– ادجوانت‌ فروند ناقص
– PBS استریل
– سرنگ cc 5 و سرنگ انسولین
– اپندورف 5cc
– سمپلر 100 و 1000
– نوک سمپلر زرد و آبی استریل
روش کار :
جهت آماده‌سازی واکسن کاندید، پروتئین نوترکیب کاندید یونیورسال 6و11و16و18و31و45 HPVبا ادجوانت‌ فروند ناقص مخلوط شد که در این حالت به ازای هر 200 میکرو لیتر از مخلوط به دست آمده مقدار 10 میکروگرم واکسن کاندید وجود داشت. میزان تزریق واکسن برای هر موش 20 گرمی معادل gµ 10 / Lµ200 بوده است .
3-29-گروه‌های تجربی و واکسیناسیون موش‌ها
مواد مورد نیاز:
واکسن
سرنگ انسولین
موش مورد آزمایش
پنبه
الکل

روش کار :
گروه بندی موش های مورد مطالعه بدین صورت بود که در این مطالعه موش ها به 2 گروه مجزا تقسیم شدند ;هر گروه 1و2 شامل 6 سر موش و وزن همگی تقریبا یکسان بوده است. ( حدود 20 گرم )که در قفس مجزا قرار گرفتند. حجم نهایی تزریق به هر گروه میزان 200 میکرو لیتر بوده و دوز واکسن 10 میکرو گرم بوده و تزریقات در دو نوبت در روز های 0 ، 14 به صورت زیر پوستی انجام گردید.
جدول3-2: گروه بندی موش های مورد مطالعه
تعداد موش‌ها
دوز تزریق
گروه بندی
واکسن
گروه ها
6
10 میکروگرم
تست
واکسن به همراه ادجوانت فروند
گروه 1
6

کنترل
PBS
گروه 2

3-30- بررسي پاسخ هاي همورال
پس از پایان دوره ی ایمن زایی گروه های تجربی جهت بررسی پاسخ های هومورال از گروه های تجربی خون گیری به عمل آمد . نمونه های خون در دور rpm 12000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند و سپس سرم‌ جمع آوري شد و در -20 درجه سلسیوس نگهداري شدند و پس از اتمام جمع آوري سرم‌ها در اين مطالعه‌، از نظر پاسخ‌هاي آنتي بادي مورد بررسي قرار گرفتند .

3-30-1- بررسي سطح آنتي بادي توتال در رقت های مختلف سرمی
مواد مورد نياز :
پليت الايزاي Maxisorb (Nunc)
بافر بلاک (شير خشک 5 در صد در بافر PBS)
بافر شستشو(PBS-T20, PBS-Tween 20 0.05%)
نوک سمپلر زرد و آبي
مولتي چانل
سوبستراي TMB (رازي طب)
PBS
آنتي ژن
Anti mouse HRP conjugate (رازي طب)
اپندورف 5/1 سي سي
دستگاه الايزا ريدر (Lab System)
انکوباتور 37 درجه (Memmert)
بافر رقيق کننده (PBS-BSA 1%)
روش

پایان نامه
Previous Entries منابع پایان نامه درمورد شستشوی، لیتر)، فالکون، ایمیدازول Next Entries منابع پایان نامه درمورد مدل سازی