منابع پایان نامه درمورد آزمون و خطا، فیزیولوژی، عدم تقارن

تهيه‌ی اين محلول به ميزان 5/2 ميلي‌گرم از پودر آن در كمي الكل و در حضور گرما حل شده و با آب مقطر به حجم 100 سي سي مي‌رسد. محلول به دست آمده زرد رنگ است و بايستي فويل پيچي شده و در يخچال نگهداري گردد.

3-4-3 كُلشي سين
در اين تحقيق از كلشي سين 1/0 درصد و 5/0 درصد در فاصله‌هاي زماني 5/1 و 5/2 ساعت و در دماي 20 درجه سانتيگراد استفاده شد.
براي تهيه محلول 5/0% به ميزان 25/0 گرم از پودر كلشي سين در 50 ميلي ليتر آب مقطر ريخته مي‌شود. براي انحلال كلشي‌سين لازم است قبل از اضافه كردن آب مقطر، پودر آن را در كمي الكل حل نماييم.

3-5 تثبيت89
پس از اتمام مرحله‌ی پيش تيمار ریشه‌چه‌ها از محلول پیش‌تیمار خارج شده و براي از بين رفتن اثرات شيميايي محلول‌هاي مرحله 3-4 ريشه‌چه‌ها به مدت 10 دقيقه در آب مقطر شست و شو داده شدند. محلول‌هاي تثبيت كننده باعث مرگ بافت‌ها و سلول‌ها مي‌گردند و در نتيجه محتويات هسته با حداقل خسارت، دست نخورده باقي مي‌مانند. براي انجام تثبيت از محلول‌هاي زير استفاده شد.

3-5-1 لویتسكي
اين محلول از نسبت حجمي 1:1، فرمالين 10 درصد و اسيد كروميك 1 درصد ساخته مي‌شود. ريشه چه‌ها به مدت 36 ساعت در دماي 4 درجه‌ي سانتيگراد درون اين محلول قرار گرفتند.
3-5-2 محلول FAA
اين محلول يك تثبيت كننده از نوع overnight ها است، به اين معني كه در 24-12 ساعت تمامي سلول‌ها را مي‌كشد. محلول FAA از تركيب 10 ميلي‌ليتر فرمالين 37 درصد، 5 ميلي‌ليتر اسيد استيك گلايسيال، 50 ميلي‌متر اتانول و 35 ميلي‌ليتر آب مقطر توليد مي‌گردد.
ريشه‌چه‌هاي بريده شده به مدت 18 ساعت در اين محلول قرار داده شده و در يخچال نگهداري شدند.
3-5-3 محلول فارمر
اين محلول overnight است و از تركيب 30 ميلي‌ليتر اتانول 95 درصد با 10 ميلي‌ليتر اسيد استيك گلايسيال حاصل مي‌شود. مدت زمان نگهداري ريشه چه‌ها در اين محلول طی این تحقیق، 18 ساعت بود.
2-6 نگهداري90
براي اينكه بتوان نمونه‌هاي تثبيت شده را براي مدتي نگهداري نموده و بعداً سر فرصت مناسب آنها را مورد مطالعه قرار دهيم ريشه‌ها را پس از استخراج از محلول تثبيت كننده به مدت 15 دقيقه با آب مقطر شستشو مي‌دهيم و پس از خشك كردن آنها با كاغذ صافي آنها را در محلول اتانول 70 درصد قرار داده و در يخچال با دماي 4 درجه سانتيگراد قرار مي‌دهيم.
در صورتي‌كه به نگهداري نمونه‌ها نياز نباشد مي‌توان اين مرحله را حذف و بلافاصله بعد از مرحله تثبيت به مرحله هيدروليز رفت.
3-7 هيدروليز91
ريشه‌چه‌ها پس از خروج از تثبيت كننده يا نگهدارنده به مدت 15 دقيقه شست و شو داده شدند. به منظور هيدروليز ديواره‌ سلولی، ريشه‌چه‌ها در شيشه‌هاي حاوي محلول NaoH يك نرمال ريخته شده و به مدت 8 دقيقه در حمام آبگرم 60 درجه سانتي‌گراد قرار داده شدند.
3-8 رنگآميزي92
نمونه‌هاي هيدروليز شده به طور مختصر با آب مقطر شست و شو داده شدند و سپس در محلول استوفريك‌ هماتوكسيلن 4 درصد، به مدت 5 ساعت در حمام آبگرم با دماي 30 درجه سانتيگراد رنگ‌آميزي شدند. در يك مورد خاص نمونه‌ها در محلول رنگ فوق به مدت 5/0 ساعت و در دماي 50 درجه پيش رنگ آميزي شده و سپس در محلول رنگ استوكارمن 5/0 درصد، به مدت 4 روز در دماي اتاق (حدود 15 درجه در زمستان) قرار گرفتند.
3-9 اسكواش
به ميزان نيم ميلي‌متر از انتهاي هر ريشه‌چه‌‌ي رنگ آميزي شده روي يك لام قرار گرفته و به آن 1 قطره استيك اسيد 45 درصد اضافه شد. يك لامل روي مجموعه فوق قرار گرفته و در روي حرارت شعله براي له شدن بهتر، به لام حاوي نمونه كمي حرارت داده شد. لام حاوي نمونه و لامل روي سطح صاف ميز‌كار قرار گرفته و با ته خودكار به آرامي چند ضربه روي لامل وارد آمد تا سلول‌هاي برش نيم ميلي‌متري، در زير لامل به شكل گرد و غبار درآيند.
3-10 بررسي ميكروسكوپي93
در نهايت سلول‌هاي متافازي را در زير ميكروسكوپ نوري Olympus قرار داده و به كمك روغن امرسيون و عدسي با بزرگنمايي 100، كروموزوم‌هاي متافازي مشاهده شدند. پس از يافتن 8 سلول متافازي مناسب، با استفاده از دوربين ديجيتال كانون94 از هر اسلايد 8 عكس تهيه شد.
3-11 تجزيه و تحليل اطلاعات كاريوتيپي
عكس‌هاي گرفته شده از كاريوتيپ هر جمعیت، با استفاده از نرم افزار ميكروميژر3.395 مورد آناليز تصويري قرار گرفت. اين نرم افزار شاخص‌هاي كاريوتيپي همچون طول بازوي بزرگ و كوچك، طول كل كروموزوم، نسبت بازوي بزرگ به كوچك، ميانگين طول كروموزوم‌ها و … را محاسبه مي‌كند. اين داده‌ها وارد نرم افزار اكسل 2007 شده و پارامترهاي كاريوتيپي ديگر همچون درصد شكل كلي كاريوتيپ، شاخص تقارن، اختلاف دامنه‌ي نسبي، ضريب تغييرات و … محاسبه شدند. ايديوگرام هر جمعيت توسط نرم افزاراکسل96 2007 رسم گرديد.
براي تجزيه داده‌ها و استفاده از روش‌هاي چند متغيره آماري از نرم افزارهاي Minitab 16 و SPSS 18 استفاده شد. تجزيه‌هاي آماري چند متغيره شامل تجزيه به مولفه‌هاي اصلي، تجزيه عاملي و تجزيه خوشه‌اي بود.

3-12 شرح بهترين دستورالعمل97
از طريق روش آزمون و خطا و نيز با استفاده از آزمون آماري t- استيودنت بهترين روش براي كشت، پيش تيمار، تثبيت، هيدروليز و رنگ‌آميزي به شرح زير حاصل شد.
بعد از كشت بيست بذر در هر پتری دیش به مدت 48- 36 ساعت، زماني كه طول ريشه‌چه‌ها كمتر از 5/0 سانتيمتر بود، ريشه چه‌ها رادر ساعات اوليه‌ي صبح (حدود 8:30 – 8 صبح) برش داده و در محلول كلشي‌سين 5/0 درصد به مدت 5/2 ساعت قرار گرفتند (در دماي اتاق).
پس از مرحله پيش تيمار بذرها شست و شو داده شده و در محلول FAA به مدت 1 شب قرار گرفتند، تا سلولها تثبيت گردند. بعد از گذشت اين زمان نمونه‌ها به خوبي شسته شده و در محلول هيدركسيدسديم يك نرمال به مدت 8 دقيقه در حمام آبگرم 60 درجه هيدروليز شدند. پس از هيدروليز، شست و شو بايد مختصر باشد تا آب در بافت‌هاي متلاشي شده نفوذ پيدا نكند و محتويات هسته‌هاي هيدروليز شده را به هم نريزد. رعايت اين نكته بسيار حائز اهميت است.
عمل رنگآميزي توسط استوفريك هماتوكسيلن 4 درصد در دماي 30 درجه‌ي حمام آبگرم و به مدت 5 ساعت انجام گرديد. هماتوكسيلن باعث رنگ آميزي خوب كروموزوم‌ها مي‌شود، اما گاهاً موجب تيره شدن سيتوپلاسم مي‌گردد.
در اين حالت ساير رنگ‌ها بر هماتوكسين ارجحيت دارند. محقق ضمن آزمايش دريافت كه اگر ريشه چه‌ها در زمان مناسب اول صبح برش داده شوند و طول آن‌ها نيز زياد طويل نشده باشد بدون انجام مراحل 3-4 تا 3-7 نيز میتوان موفق به تهيه كاريوتيپ در اين دو گونه گیاهی شد.

فصل چهارم

نتایج وبحث

4-1 نتایج تجزیه و تحلیل کاریوتیپ
برای نمونههای هرگونه طول کل کروموزوم (T.C.L) ، میانگین طول (C.R.V)، دامنه ی طولی کروموزومی(V)، ضریب تغییرات طول کروموزومها (C.V)، درصد شکلکلی کاریوتیپ (T.F)، میانگین نسبت بازوها (R)، شاخص تقارن کاریوتیپ، شاخص عدم تقارن درون کاریوتیپیِ رومرو- زارکو(2 A) و تعداد کروموزومها اندازهگیری شدند (جداول 4-1و4-2 و 4-3).
میانگین طولکل در گونهی بوئتیکوم 5/151 میکرومتر و در گونه ی اورارتو 5/136 میکرومتر بود. درصد شکلکلی کاریوتیپ سایر مشخصههای این دو گونه در جدول 4-1 آمدهاند.

جدول 4-1 خلاصه شاخص های سیتوژنتیکی ارزیابی شده
شاخص
T. boeotieum
T. urartu
میانگین طول کل کروماتین (TCL)
5/151
5/136
بزرگترین طول کل کروموزومی
سفید دشت (9)
سنقر (24)
کوچکترین طول کل کروموزومی
قره تپه (20)
ناشناخته (32)
فرمول کاریوتیپی لوان
Sm1+m6
Sm1+m6
دستهبندی استبینز
1A
A1
تعداد کروموزوم
14
14
میانگین نسبت بازوها (L/S)
3/1
2/1
میانگین طول نسبی کوتاهترین کروموزوم
49/0
5/0
نوع تقارن کاریوتیپ گونه
متقارن (A1)
متقارن (A1)

تعدادی از دانشمندان بر این باور هستند که بین بزرگی محتویات ژنتیکی هسته98 و سازگاری با آبوهوای خشک رابطهی مستقیم وجود دارد (1 و 9 و 18). همچنین مقدار پایهی DNA در هسته باعث بهبود تواناییهای فیزیولوژیک گیاه در مقابله با تنشهای زیستی رابطه مستقیم دارد. به طوریکه اندازهی ژنوم همبستگی مثبتی با سردترین ماه سال دارد(57).
درصد شکلکلی کاریوتیپ در این جمعیتها بیشتر از 40 درصد میباشد. از آنجا که براساس مطالعات هوزیوارا (1962)، درصد TF شاخصی برای بیان وضعیت تقارن است و هرچه این مقدار به 50 نزدیکتر باشد دلیلی بر قرار گرفتن سانترومر در وسط کروموزومها است، می توان ادعا نمود دو گونه ی T. boeoticum و T. urartu دارای کاریوتیپی متقارن‌اند و کروموزومهایی با سانترومر میانی دارند.
مقادیر دو ستون آخر جدول 4-2 شاخص تقارن کاریوتیپ جمعیتها را نمایش می دهد که هرچه این مقادیر اعداد بزرگی را به خود اختصاص دهند درجه ی تقارن کل کاریوتیپ بیشتر می گردد و این بدان معنا است که تفاوت بین طول کروموزوم ها در کاریوتیپ موردنظر کم است یا به عبارت دیگر کروموزومها هم طول هستند. دامنه ی طولی کروموزومهای گونه از تفاضل طول بزرگترین و کوچکترین کروموزوم درون هر کاریوتیپ حاصل میگردد. بدیهی است هرچه مقدار این مشخصه کمتر باشد طول کروموزوم های درون آن کاریوتیپ هم اندازهتر است و تقارن بیشتر میگردد. جمعیت های هردو گونه مورد مطالعه دارای تعداد کروموزومهای یکسان 14=x2=n2 بودند که با نتایج به دست آمده از تحقیقات قبلی مربوط به جنس تریتیکوم مطابقت دارد (14 و 104).
در تحقیق حاضر در بین جمعیتهای گونه ی بوئتیکوم بزرگترین طول کل کروموزوم متعلق به جمعیت شماره ی 9 (جمعیت برداشت شده از سفید دشت) و کوتاهترین آن متعلق به جمعیت شماره ی 120 (جمعیت مربوط به قره تپّه) بود. از بین جمعیتهای گونهی اورارتو این مقادیر به ترتیب متعلق به جمعیت های سنقر و ناشناخته بود. طول کروموزوم در گونهی بوئتیکوم از گونهی اورارتو بیشتر است. جمعیتهای بوئتیکوم مربوط به پاوه (شماره ی 8) و سفید دشت (شماره ی 13) دارای دامنه ی تغییرات کاریوتیپی بیشتری نسبت به سایرین هستند و این نشان می دهد در بین 23 جمعیت از گونه ی بوئتیکوم این دو کاریوتیپی نامتقارنتر از سایرین دارند. مقادیر بزرگ ضریب تغییرات برای این دو جمعیت دلیل دیگری بر اثبات این مدعا می باشد
جدول 4-2 شاخصهای سیتوژنتیکی مورد ارزیابی در جمعیتهای بوئتیکوم
شماره
نام علمی گونه
محل جمع آوری
شاخصهای کاریوتیپی ارزیابی شده
No99
Sp. name
Location
T.C.L
C
V
C.F
T.F
R
SI
2A
1
T. boeoticum
سردشت
132.91
9.49
5.94
0.22
0.46
1.18
0.50
0.15
2
T. boeoticum
کوزران
164.30
11.74
7.20
0.22
0.42
1.37
0.54
0.25
3
T. boeoticum
سقز
165.67
11.83
10.29
0.29
0.45
1.26
0.37
0.18
4
T. boeoticum
تمرگ
129.13
9.22
8.04
0.23
0.45
1.22
0.45
0.17
5
T. boeoticum
جوانرود
143.42
10.24
7.21
0.20
0.43
1.33
0.46
0.24
6
T. boeoticum
چغلوند
161.95
11.57
6.04
0.16
0.43
1.34
0.59
0.24
7
T. boeoticum
کامیاران
134.45
9.60
7.31
0.23
0.45
1.22
0.48
0.17
8
T. boeoticum
پاوه
161.67
11.55
9.29
0.27
0.44
1.31
0.40
0.22
9
T. boeoticum
سفید دشت
178.82
12.77
7.18
0.19
0.44
1.26
0.57
0.18
10
T. boeoticum
نورآباد
167.12
11.94
7.82
0.22
0.46
1.18
0.50
0.15
11
T. boeoticum
اسدآباد
162.63
11.62
6.07
0.16
0.43
1.34
0.59
0.24
12
T. boeoticum
هرسین
160.69
11.48
6.27
0.17
0.44
1.34
0.57
0.23
13
T. boeoticum
سپید دشت
141.57
10.11
9.08
0.27
0.45
1.25
0.41
0.17
14
T. boeoticum
سپید دشت
165.93
11.85
4.82
0.14
0.48
1.19
0.66
0.15
15
T. boeoticum
فرخ شهر
165.68
11.83
6.18
0.16
0.43
1.34
0.59
0.24
16
T.