2002 ؛ ویرک 43و همکاران، 1995). نشانگرهای DNA همچنین می‌توانند اطلاعات مفیدی را در مورد پراکنش جمعیت‌های مربوط به یک گونه معین، میزان تفاوت‌های ژنتیکی در بین جوامع و میزان تنوع ژنتیکی موجود در بین و داخل توده‌ها و تعیین وجود مهاجرت یا جریان ژن در بین توده‌ها برای حفاظت در رویشگاه طبیعی فراهم نمایند (دجی44 و همکاران، 2000). از نشانگرهای DNA همچنین برای مدیریت نمونه‌های ژرم پلاسم در بانک ژن، ارزیابی روابط خویشاوندی ژنتیکی، انتخاب گیاهان برتر و بررسی شباهت و یا تفاوت بین نمونه‌های مختلف استفاده می‌گردد. بدون تردید ابداع و معرفی واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز45 بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است. PCR یک روش تکثیر آزمایشگاهی قطعه یا قطعات مورد نیاز DNA می‌باشد (قره‌یاضی، 1375 یا فویست46 و همکاران، 1990). نشانگرهای مولکولی DNA را می‌توان از نظر معیار ژنتیکی و مولکولی تقسیم بندی کرد. که از نظر معیار ژنتیکی به دو گروه عمده تقسیم می شوند: گروه اول آنهایی هستند که امکان تشخیص، بین افراد ( به صورت فردی) را (با عنایت به همبارز بودن ) فراهم نموده و از نظر مفاهیم به این دسته از نشانگرها، نشانگرهای ژنتیکی همبارز گفته می‌شود. گروه دوم آنهایی هستند که به نشانگرهای غیر همبارز (غالب) معروف میباشند. این گونه نشانگرها قابلیت تفکیک بین افراد خالص از ناخالص را ندارند. نعمت زاده و کیانی 1383 نشانگرهای مولکولی DNA را در دو گروه مبتنی بر PCR و غیرمبتنی بر PCR طبقه‌بندی نموده‌اند. از جمله نشانگرهای همبارز و مبتنی بر PCR ریزماهواره‌ها هستند که در زیر اشاره‌ای به آنها می‌شود.
2-6-2-3- نشانگرهای ریزماهواره:
ریزماهواره‌ها شامل واحدهای تکی، دوتایی، سه‌تایی، پنج‌تایی یا شش‌تایی واحدهای تکرارشونده‌اند که در ژنوم بیشتر یوکاریوت‌ها پراکنده‌اند. به طوریکه به ازای هر ده کیلو جفت باز از ردیف DNA دست کم یک ردیف ریزماهواره دیده می‌شود. ریزماهواره‌ها به سه گروه عمده تکرارهای کامل، تکرارهای ناکامل (معمولاً توسط بازهای غیرتکرار شونده قطع میشوند) و تکرارهای مرکب (دو یا تعداد بیشتری از واحدهای تکراری مجاور یکدیگر) تقسیم میشوند. تعداد تکرار در هر واحد بسیار متفاوت است. حداقل تعداد واحد تکرار شونده برای ریزماهواره‌های دو نوکلئوتیدی و سه نوکلئوتیدی به ترتیب ده و هفت بار تکرار تعیین شده است (نقوی و همکاران، 1386). ریز ماهواره‌ها یا ردیفهای تکراری ساده 47(SSR) با نام‌های مختلف هم‌چون تفاوت طول ردیفهای ساده48 (SSLPs)، ردیفهای کوتاه تکراری 49 (STRs)، قطعات با ردیفهای ساده50 (SSMs) و نقاط ریزماهواره‌های نشانمند از ردیف 51(STMs) نیز خوانده میشوند (نقوی و همکاران 1386). نشانگرهای ريزماهواره از جمله نشانگرهای DNA هستند كه اختلاف ژنتيكي بين ژنوتيپ‌ها را در سطح مولکول DNA نشان می‌دهند و بدليل چندشکلی بالا، ابزار مناسبی براي ارزيابي تنوع ژنتيكي در گياهان مختلف مي باشند (باربوسا و همکاران52، 1996). وجود جایگاه‌های ریزماهواره در ژنوم‌های یوکاریوتی از سال 1970 به بعد مشخص شد. شناسایی ریز ماهواره‌ها، تعیین ردیف بازی آنها، طراحی و ساخت آغازگرها و تهیه نقشه ژنتیکی ریزماهواره‌ها که مقدمه کاربرد این نشانگرها است، بسیار پیچیده و مستلزم صرف وقت و هزینه‌ی زیاد است. تنوع بیش از حد ریز ماهواره‌ها، کاربرد آنها را در رده بندی و تعیین قرابت گیاهان مورد سؤال قرار داده است. به نظر می‌رسد استفاده از ریز ماهواره‌ها به همین دلیل فقط به شناسایی ارقام و رده بندی گونه محدود خواهد شد و در تعیین قرابت بین گونه‌های دورتر کاربردی نخواهد داشت. البته در صورت شناسایی و تعیین جایگاه ژنی تعداد بیشتر می‌توان از آنها برای انگشت نگاری ارقام و بویژه در امور مربوط به تشخیص ارقام و غیره استفاده کرد. کمبود تعداد ریز ماهواره‌های شناخته شده در برخی از موجودات استفاده از آنها را در مکان‌یابی ژن‌ها محدود کرده است (نقوی و همکاران، 1386). ریز ماهواره‌ها با توجه به سیستم چندآللی و چندشکلی بسیار زیادی که دارند از نشانگرهای امید بخش برای آینده محسوب میشوند. از جمله معایب ریزماهواره‌ها به شرح زیر می‌باشد.
شناسایی ریزماهواره، تعیین ردیف بازی آنها، طراحی و ساخت آغازگرها و تهیه نقشه ژنتیکی ریزماهواره‌ها که مقدمه کاربرد این نشانگرها است، مستلزم صرف وقت و هزینه زیاد هست.
در صورت توزیع نامناسب ریزماهواره‌ها در طول ژنوم، کاربرد مؤثر آنها در مکان‌یابی ژن‌ها محدود است.
کمبود تعداد ریزماهواره‌های شناخته شده در برخی از موجودات استفاده از آنها را در مکان‌یابی ژن‌ها محدود کرده است.
هزینه اولیه برای طراحی آغازگرها و سنتز الیگونوکلئوتیدها زیاد است (نقوی و همکاران، 1386).
2-10- شاخص‌های مهم درمطالعه تنوع ژنتیکی مولکولی
مطالعه چندشکلی در میان ژرمپلاسم، فرصت گزینش والدین مناسب جهت تلاقی را فراهم می آورد. انتظار می‌رود این والدین در تلاقی با هم نتاج برتر تولید کرده و میانگین صفت را در جمعيت بالا ببرند. همچنين بررسي تنوع ژنتيكي و تعيين فاصله ژنتيكي نسبي موجود بين افراد یا جمعیت‌ها در برنامه‌های اصلاحی اهمیت ویژه‌ای دارد، زیرا سازماندهی ژرمپلاسم و گزینش بطور موثری انجام می‌شود. در آغاز یک برنامه اصلاحی، آگاهی از روابط خویشاوندی و فیلوژنی در میان ژنوتیپ‌ها، تکمیل‌کننده اطلاعات فنوتیپی در پیشبرد اصلاح جمعیت‌ها است. بنابراین، شناسایی سریع و قابل اطمینان ژنوتیپ‌ها برای انجام برنامه‌های اصلاحی و همچنین پروژه‌های تولید بذر در محصولات زراعی ضروری است ( اصیلی، 1386). شاخص‌هاي مربوط به تنوع ژنتیکی شامل تعداد آلل‌هاي مشاهده شده، تعداد آلل‌هاي موثر، محتوای اطلاعات چند شکلی و شاخص اطلاعاتی شانون53 می‌باشد. شاخص شانون نشان‌دهنده میزان چندشکلی مجموع آغازگرها در ارقام است. محتوای اطلاعات چند شکلی معادل تنوع ژنتيكي بوده و قدرت تفكيك يك نشانگر را به واسطه تعداد آلل‌هاي مکان ژنی نشانگر و فراواني نسبي اين آلل‌ها در جمعيت نشان می‌دهد. همچنین شاخصي براي بيان قدرت تمايز نشانگرها می‌باشد و مقدار بالاي اين شاخص بيانگر چندشكلي بالا و وجود آلل‌هاي نادر در يك جايگاه ژنی می‌باشد. تعداد آلل موثر، بیانگر میزان تنوع ژنتیکی در جمعیت است و براي مقایسه جمعیت‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند.
2-11- مروری بر پژوهشهای انجام شده در نشانگر SSR
از نشانگرهایی نظیر SSR، RFLP و RAPD به منظور بررسی تنوع ژنتیکی در سورگوم استفاده شده است (دین54 و همکاران، 1999). به عنوان مثال جی55 و همکاران (2011) از نشانگرهای SSR جهت تجزیه ژنتیکی ژنوتیپ‌های سورگوم و مکان‌یابی بعضی از صفات خاص در این گیاه استفاده نمودند. دجی و همکاران (2000) در مطالعه‌ای از نشانگرهای ریزماهواره به منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی درون و بین ژنوتیپ‌های سورگوم استفاده نمودند. و تنوع قابل ملاحظه‌ای در 5 مکان ریزماهواره‌ای پیدا کردند. میانگین تعداد آلل‌ها درون ژنوتیپ‌ها 4/2 و در کل نمونهها 2/19 گزارش شد. نتایج این تحقیق مفید بودن نشانگرهای ریزماهواره‌ای را در تعیین تنوع ژنتیکی ثابت نمود. نتايج حاصل از آزمایشات دهقان نیری و همکاران (1384) به منظور تعیین روابط ژنتيكي در اينبرد لاين‌هاي ذرت با استفاده از نشانگر ريزماهواره نشان داد که نشانگرهای ريزماهواره قادرند چندشکلی بالايي را بين لاين ها نشان دهند و از اين‌رو ابزار مفيدي برای انگشت‌نگاري ژنوتيپ‌ها و دسته‌بندي آنها در گروه‌هاي مختلف بشمار مي‌روند. سنيور 56و همكاران (1998) گزارش كردند كه نشانگرهای ريزماهواره سطح بالايي از چندشکلی را در ذرت نشان مي‌دهند و از آنها مي توان برای بررسي تنوع ژنتيكي در اين گياه استفاده نمود. (ماتوس و هايز57، 2002) به منظور تعيين تنوع ژنتيكي ژرم پلاسم جو از نشانگرهاي SSR استفاده کردند. مانگو58 و همكاران (2001) نشان دادند كه به علت قابليت تغيير در تعداد واحدهاي تكراري، ريزماهواره ها بسيار چند شكل بوده و به همين دليل به عنوان نشانگر مهمي در نقشه‌يابي ژنتيكي و مطالعات جمعيتي براي بسياري از موجودات مورد توجیه هستند.
فصل سوم
مواد وروشها
3-1- زمان و موقعیت آزمایش
به منظور بررسی تحمل به شوری در ارقام مختلف سورگوم و نیز مطالعه تنوع ژنتیکی آنها دو آزمایش در سال1392 در دانشکده کشاورزی دانشگاه یاسوج اجرا شد.
3-2- آزمایش اول: بررسی تحمل به شوری در مرحله گیاهچه‌ای
3-2- 1- مشخصات تیمارهای آزمایشی و ژنوتیپ‌های مورد بررسی
آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی در 3 تکرار انجام شد. فاکتور اول، تنش شوری در 4 سطح (5، 10 و 20 دسی‌زیمنس بر متر و شاهد) و فاکتور دوم شامل 10 رقم سورگوم دانه‌اي طبق جدول 3-1 بود.
جدول 3-1 مشخصات ژنوتیبهای سورگوم مورد مطالعه
ردیف
ژنوتیپ
نام واریته
منشأ
محل جمع آوری
1
SOR 808
ايتاليا
Ipk
2
SOR 834
ايتاليا
Ipk
3
SOR 857
ايتاليا
Ipk
4
SOR 1003
Odesskaja25
اتحاديه‌ي شوروي سابق
Ipk
5
SOR 1006
JantarKrasnyi
اتحاديه‌ي شوروي سابق
Ipk
6
SOR 1009
Jubilejnyi
اتحاديه‌ي شوروي سابق
Ipk
7
SOR 1011
Kamysinskoje5
اتحاديه‌ي شوروي سابق
Ipk
8
MTS
ایران
9
HTS
ایران
10
LTS
ایران
3-3- روش اجرای آزمایش
12 عدد بذر سالم از هر رقم سورگوم پس از ضدعفونی سطحی با هیپوکلریت سدیم 1% به مدت یک دقیقه، در گلدان‌هایی که با ماسه شسته‌شده پر شده بودند، کشت شدند. سپس تا رسیدن به مرحله دو برگی تمام گلدانها با یک چهارم محلول هوگلند (هوگلند و آرنون59، 1950) آبیاری شدند. پس از رسیدن گیاهچه‌ها به مرحله دو برگی، تنش شوری با استفاده از کلرید سدیم به مدت 20 روز اعمال گردید. مقدار کلرید سدیم مصرفی برای تیمار 5 دسی زیمنس بر متر به ازاء 1 لیتر 3 گرم، برای تیمار 10 دسی زیمنس بر متر به ازاء 1 لیتر 5/6 گرم و و برای تیمار 20 دسی زیمنس بر متر 5/13 گرم بود. که جهت ایجاد زهکشی مناسب و جلوگیری از تجمع نمک در گلدانها، در زیر تمامی گلدانها سوراخهای مناسبی تعبیه شد. همچنین هر هفته یکبار تمامی گلدانها به وسیله آب معمولی آبیاری شدند. پس از اعمال تنش، صفاتی نظیر وزن خشک برگ، وزن خشک ریشه، ارتفاع ساقه، سطح برگ، مقدار پرولین، قندهای محلول و مواد معدنی مثل سدیم، پتاسیم، کلسیم و منیزیم اندازهگیری شدند.
3-4- فرمول غذایی هوگلند:
این فرمول غذایی توسط هوگلند و آرنون (1950) ارائه شده است. با توجه به اینکه در ابتدای رشد از یک چهارم محلول هوگلند استفاده شد، پس کلیه مقادیر جدول (3-2) که برای نیمهوگلند بودند، به نصف کاهش یافت (4 ماده اول که مواد غذایی ماکرو هستند نصف میزان ذکر شده برای 60 لیتر آب استفاده شد). محلول‌ها با همان نسبت تهیه شدند ولی حجم مورد استفاده در 60 لیتر محلول نیمهوگلند 500 سیسی بود.
جدول 3-2- طرز تهیه محلول نیم هوگلند
حجم مورد استفاده (میلیلیتر) در 60 لیتر نیم هوگلند
میزان ترکیب (گرم) در یک لیتر
مواد
75
202
نیترات کلسیم*
75
472
نیترات پتاسیم*
30
493
سولفات منیزیم*
30
80
نیترات آمونیوم*
45
86/2
سولفات آهن II
15
81/1
کلرید منگنز
15
22/0
سولفات روی
15
051/0
سولفات مس
15
09/0
اسید مولیبدیک
15
15
اسید بوریک
15
136
پتاسیم دیهیدروژن فسفات
*عناصر ماکرو میباشند
ترکیبات شماره 1 و 2 به سختی حل میشوند و باید به طور کامل در آب حل شوند.
3-5- روشهای نمونه برداری و اندازهگیری صفات مورد بررسی
20 روز بعد از اعمال شوری، از هر گلدان سه بوته که دارای برگ سبز بودند، انتخاب گردید و نمونهگیری از گلدانها در ساعت 8 صبح انجام شد. به منظور جلوگیری از تغییر میزان پرولین و قندهای محلول، نمونهها در طی انتقال به آزمایشگاه، در ظرف حاوی یخ خشک قرار داده شدند و تا زمان استفاده در دمای 40- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. پس از 20 روز که
