منابع پایان نامه ارشد درباره نمونه برداری، فیزیولوژی

دانلود پایان نامه ارشد

آگار پدیدار شد، نمونه ها به یخچال منتقل شده و به عنوان کشت اصلی در دمای 0/4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. باکتری رشد داده شده روی پلیت آگار در تصویر 3-4 نشان داده شده است. تصویر 3-5 رشد باکتری لانگالی را در محیط کشت مایع در مقایسه با محیط کشت تلقیح نشده نشان می دهد.

تصویر ‏34: باکتری لانگالی رشد داده شده روی پلیت آگار

تصویر ‏35: باکتری رشد کرده در محیط کشت مایع (سرم باتل سمت راست) و محیط کشت تازه بدون باکتری (سرم باتل سمت چپ)
3-6 آزمایشهای ناپیوسته242 کشت لانگالی
در آزمایشهای ناپیوسته کشت باکتری لانگالی که در سرم باتل انجام شد تاثیر پارامترهای مختلفی همچون نوع سوبسترای آلی، غلظت سوبسترای آلی، فشار گاز سنتز داخل سرم باتل، نوع و میزان عوامل کاهنده و pH اولیه محیط کشت روی رشد سلول، میزان مصرف سوبسترا و تولید محصول بررسی گردید.

3-6-1 رشد باکتری با سوبسترای آلی
در مطالعات اولیه ای که تنر243 و همکارانش هنگام جداسازی باکتری کلستریدیوم لانگالی از محیطهای طبیعی انجام دادند، امکان رشد باکتری را با حدود 30 سوبسترای آلی بررسی کردند [46]. هرچند، در آن بررسی اولیه تنها امکان رشد و یا عدم رشد باکتری با هر یک از سوبستراهای آلی گزارش گردید و هیچ مطالعه ای روی دانسیته سلولی و یا تولید محصول با هر کدام از سوبستراها انجام نگرفت. به منظور بررسی رفتار باکتری در مواجه با سوبستراهای آلی مختلف در محیط کشت، تاثیر چهار سوبسترای آلی در محیط کشت باکتری مورد بررسی قرار گرفت.

3-6-1-1 تاثیر نوع سوبسترای آلی
به منظور مطالعه تاثیر سوبسترای آلی روی رشد لانگالی، از چهار سوبسترای آلی فروکتوز، گلوکز، استات و اتانول در آزمایشهای جداگانه استفاده گردید. بدین منظور محیطهای کشت (بدون منبع کربنی و عوامل کاهنده) در سرم باتل (50 میلی لیتر محیط کشت در باتل 163 میلی لیتری) تهیه و استریل شد. محلولهای 0/5 گرم بر لیتر فروکتوز، گلوکز، اتانول و استات نیز به صورت جداگانه و با حفظ شرایط بی هوازی در چهار سرم باتل تهیه و استریل گردیدند. پس از آن، سوبسترای آلی و عوامل کاهنده به محیط کشت اصلی اضافه گردیده و pH محیط کشت حدود 9/5 تنظیم شد. برای تنظیم pH محیط کشت در سرم باتل در بسته استریل، مقادیر مشخص و از پیش تعیین شده ای از اسید هیدروکلریک یا هیدروکسید سدیم 0/1 مولار استریل توسط سرنگ به محیطها اضافه گردیدند. برای خواندن pH محیط کشت در سرم باتل، از کاغذ pH متر (Whatman) که برای محدوده 7/6-2/5=pH بود استفاده می شد. به منظور حصول اطمینان از شرایط کاملا بی هوازی، مجددا گاز نیتروژن پس از عبور از فیلتر به درون باتل ها فرستاده شد. سپس همه محیطهای کشت با 5/2 میلی لیتر از سلولهای در حال رشد باکتری لانگالی (باکتری در حال رشد روی فروکتوز) تلقیح شدند. همه باتل ها به صورت افقی در داخل شیکر انکوباتور244 (innova40، انگلستان) در دمای 37 درجه سانتیگراد و دور 150(rpm) قرار داده شدند. در فواصل زمانی مشخص، از باتل ها به وسیله سرنگ استریل 5/2 میلی لیتر نمونه برداشته می شد که برای تعیین دانسیته سلولی، مصرف سوبسترا و غلظت محصول مورد آنالیز قرار می گرفتند. آزمایشهای ناپیوسته در یک دوره 120 ساعته (5 روزه) انجام شد و برای اطمینان از صحت نتایج به دست آمده، آزمایشها 3 بار تکرار گردیدند.

3-6-1-2 تاثیر غلظت سوبسترای آلی
نتایج حاصل از بررسی تاثیر سوبسترای آلی روی فرایند رشد و تولید محصول نشان داد که فروکتوز بهترین سوبسترای آلی بود. برای مطالعه تاثیر غلظت فروکتوز روی فرایند تخمیر، غلظت فروکتوز در محیط کشت از 0/1 تا 0/11 گرم بر لیتر تغییر داده شد و سایر مراحل همانند آزمایش قبل تکرار گردیدند. این آزمایشها نیز در یک بازه زمانی 120 ساعته انجام شد و از محیطهای کشت در فواصل زمانی معین برای بررسی رشد سلول، مصرف فروکتوز و تولید محصول نمونه برداری گردید.

3-6-2 رشد باکتری با گاز سنتز
همان طور که قبلا اشاره شد باکتری لانگالی می تواند COو H2/CO2 را که اجزای اصلی گاز سنتز محسوب می شوند به عنوان منبع کربنی مصرف کرده و محصول تولید کند. به منظور بررسی فرایند تخمیر گاز سنتز به اتانول و استات توسط لانگالی، آزمایشهای ناپیوسته در سرم باتل بدون حضور هرگونه سوبسترای آلی (جامد یا مایع) در محیط کشت انجام شد. برای انجام این آزمایشها، از کپسولی حاوی مخلوطی از گازهای CO، H2، CO2 و Ar با درصد حجمی ثابت 30، 30، 30 و 10% (Wellgas، مالزی) استفاده گردید. گاز آرگون به عنوان استاندارد داخلی245 برای محاسبه تغییرات فشار کل در داخل باتل به کار گرفته شد و استفاده از این گاز بی اثر تاثیری روی توانایی سلولها برای تولید محصول نداشت.
برای انجام آزمایشهای ناپیوسته با گاز سنتز، محیط کشت (بدون عوامل کاهنده) پس از آماده سازی استریل شد. سپس عامل کاهنده استریل شده به محیط کشت اضافه گردیده و pH محیط کشت روی 9/5 تنظیم گردید. گاز سنتز پس از عبور از فیلتر از طریق سوزن (سرسرنگ) وارد باتل گردید و از سوزن دیگری برای خروج گاز از داخل باتل استفاده شد. مرحله افزودن گاز به محیط کشت به دلیل سمیت بالای گاز CO لزوما در محفظه بی هوازی انجام می گرفت. سایر مراحل تلقیح، انکوباسیون و نمونه برداری همانند آزمایشهای قبل انجام می گرفت.

3-6-2-1 تاثیر همزمان عوامل کاهنده و pH اولیه محیط کشت
سیستئین اسیدی و سدیم سولفید دو عامل کاهنده ای هستند که عموما برای محیط رشد باکتریهای استوژنیک توسط ATCC و DSMZ246 توصیه می شوند [14]. تعیین غلظت بهینه این عوامل کاهنده برای اطمینان از اینکه سطح مطلوبی از پتانسیل کاهشی در محیط رشد ایجاد شده است اهمیت زیادی دارد. علاوه بر عوامل کاهنده، pH محیط کشت نیز پارامتر مهمی در تنظیم جریان کربن و الکترون در داخل دیواره سلولی است. pH محیط کشت می تواند متابولیزم سوبسترا را تنظیم کرده و پارامترهای فیزیولوژیکی نظیر pH درون سلولی، پتانسیل غشاء و نیروی محرکه پرتونی247 را تغییر دهد [98]. به منظور بررسی تاثیر همزمان عوامل کاهنده و pH محیط کشت روی عملکرد سلولها و بازده تولید محصول، آزمایشهای تخمیر ناپیوسته گاز سنتز با تغییر عوامل کاهنده و به طور همزمان pH محیط کشت انجام گرفت.
محیط کشت (بدون عوامل کاهنده) در چند سرم باتل تهیه و استریل شد. سپس غلظتهای مختلفی از محلولهای کاهنده مطابق جدول 3-2 به محیطهای کشت اضافه گردید و pH محیط کشت در 9/5 یا 8/6 تنظیم شد. سپس گاز سنتز پس از عبور از فیلتر برای مدت 0/1 دقیقه وارد باتل شده و از خروجی خارج شد و در نهایت با برداشتن سوزن خروجی، فشار گاز سنتز در داخل باتل ها به 200 کیلوپاسکال رسانده شد. برای تلقیح محیطهای کشت، از سلولهایی استفاده گردید که از بیوراکتور گرفته شدند. برای داشتن سلولهایی که از نظر متابولیکی بسیار فعال بوده، به گاز سنتز عادت کرده و بتوانند آن را به سرعت مصرف کنند، فرایند تخمیر گاز سنتز در بیوراکتور انجام گرفت. ترکیب محیط کشت در بیوراکتور عینا مشابه سرم باتل بود و از جریان مداوم گاز سنتز با ترکیب ذکر شده به عنوان سوبسترا استفاده گردید که در ادامه توضیح داده خواهد شد. پس از تلقیح محیطهای کشت، باتل ها در شیکر انکوباتور قرار داده شدند. همانند آزمایشهای قبل، نمونه گیری از محیطهای کشت جهت انجام آنالیزهای مربوطه در فواصل زمانی معین انجام گرفت. طول مدت این سری از آزمایشهای ناپیوسته 36 ساعت بود. برای اطمینان از صحت نتایج به دست آمده، آزمایشها 3 بار تکرار گردیدند.

جدول ‏32: محیطهای کشت مختلف برای بررسی تاثیر همزمان عوامل کاهنده و pH محیط کشت
شماره محیط کشت
عامل کاهنده (مول بر لیتر)
عنوان عامل کاهنده
pH اولیه محیط کشت
1
سیستئین اسیدی (07/5)
RAI
9/5
2
سیستئین اسیدی (82/3) و سدیم سولفید (83/0)
RAII
9/5
3
سیستئین اسیدی (53/2) و سدیم سولفید (67/1)
RAIII
9/5
4
سیستئین اسیدی (07/5)
RAI
8/6
5
سیستئین اسیدی (82/3) و سدیم سولفید (83/0)
RAII
8/6
6
سیستئین اسیدی (53/2) و سدیم سولفید (67/1)
RAIII
8/6

3-6-2-2 تاثیر فشار اولیه گاز سنتز در بیوراکتورهای ناپیوسته
رشد سلول میکروبی و تولید محصول توسط میکروارگانیزم در فرایند تخمیرگاز سنتز می تواند به شدت تحت تاثیر فشار جزئی اجزای گاز باشد زیرا آنزیمهایی که در مسیر متابولیکی ارگانیزم دخالت دارند به میزان قرار گرفتن در معرض سوبسترا حساس هستند [113]. برای بررسی این پارامتر مهم، یک سری آزمایش با تغییر فشار گاز سنتز داخل سرم باتل انجام گرفت. بدین منظور، پس از آماده سازی 6 محیط کشت در سرم باتل، فشار گاز سنتز در داخل سرم باتل ها از 2/0 تا 5/1 اتمسفر (فشار نسبی) تغییر داده شد. بدین ترتیب که پس از عبور گاز سنتز از داخل سرم باتل به مدت 0/1 دقیقه، سوزن خروجی برداشته شده و فشار گاز داخل باتل از روی فشار سنج رگلاتور تا حد مطلوب تنظیم گردید. سپس تمام باتل ها با سلولهای فعالی که از بیوراکتور گرفته شده بودند تلقیح گردیدند. فرایند انکوباسیون و نمونه برداری از باتل ها در مدت زمان 36 ساعت انجام شد.

3-7 آزمایشهای پیوسته248 تخمیر گاز سنتز
آزمایشهای پیوسته تخمیر گاز سنتز که با کنترل پارامترهای عملیاتی همراه بود در بیوراکتور 2 لیتری (Infors، سوئیس) انجام گرفت. شکل 3-1 شماتیکی از سیستم مورد استفاده برای انجام آزمایشهای پیوسته تخمیر گاز سنتز را نشان می دهد.

شکل ‏31: نمایی شماتیک از سیستم پیوسته در فرایند تخمیر گاز سنتز

ترکیب محیط کشت مورد استفاده در بیوراکتور عینا همانند آزمایشهای ناپیوسته و مطابق جدول 3-1 بود. در اولین مرحله استفاده از بیوراکتور، 5/1 لیتر محیط کشت (بدون عوامل کاهنده) تهیه و در داخل بیوراکتور ریخته شد. سپس بیوراکتور حاوی محیط کشت به همراه تمام تجهیزات، لوله ها و پمپ های مربوطه اتوکلاو شدند. پس از استریلیزاسیون، از جریان گاز نیتروژنی (پس از عبور از فیلتر) که از طریق اسپارجر وارد بیوراکتور می شد برای خنک کردن محیط کشت و ایجاد شرایط بی هوازی استفاده گردید. پس از آنکه دمای محیط کشت تا حدود 45 درجه سانتیگراد کاهش یافت، عوامل کاهنده که همانند قبل در سرم باتل تهیه و استریل شده بود به محیط کشت اضافه گردید. دمای بیوراکتور در 37 درجه سانتیگراد، pH محیط کشت در 9/5 و دور همزن در 350 (rpm) تنظیم شد. برای تنظیم pH محیط کشت، از محلول اسید کلریدریک و هیدروکسید سدیم 0/1 مولار استریل شده استفاده گردید. پس از تنظیم کنترل کننده ها، جریان گاز نیتروژن قطع شده و گاز سنتز پس از عبور از دستگاه کنترل کننده جریان249 5850E) model Brooks,، امریکا) با شدت جریان معین از طریق اسپارجر وارد محیط کشت شد. شدت جریان گاز ورودی به بیوراکتور توسط ماژولی 0152E) model Brooks,) که دستگاه کنترل کننده جریان به آن متصل بود تنظیم شد. جریان گاز خروجی از بیوراکتور از طریق لوله کشیهای انجام شده برای این منظور به خارج از محیط آزمایشگاه فرستاده شد.
برای تلقیح محیط کشت، از باکتریهای در حال رشد روی فروکتوز که در سرم باتل رشد داده شده بودند استفاده گردید و محیط کشت با 10% حجمی از این سلولها تلقیح شد. در چند روز اول آزمایش برای رسیدن به دانسیته سلولی قابل قبول، بیوراکتور در حالت نیمه پیوسته مورد بهره برداری قرار گرفت بدین ترتیب که فاز مایع (محیط کشت) ثابت بوده و فاز گاز به صورت پیوسته در جریان بود. همچنین، pH محیط کشت روی 9/5 ثابت نگه داشته شد تا سلولها در فاز رشد باقی بمانند.
پس از گذشت 4 روز که دانسیته سلولی در محیط کشت به حد مطلوبی رسید، سیستم از حالت نیمه پیوسته به پیوسته تبدیل شد. برای این منظور، حجم 0/1 لیتر محیط کشت (بدون عوامل کاهنده) در باتل پیرکس (Schott) در بسته تهیه و استریل شد. در روی درب باتل یک ورودی و یک خروجی وجود داشت که از طریق آنها نیتروژن پس از عبور از فیلتر وارد محیط کشت شده و آن را خنک می کرد. پس از خنک شدن

پایان نامه
Previous Entries منابع پایان نامه ارشد درباره بازدارندگی Next Entries منابع پایان نامه ارشد درباره نمونه برداری