منابع پایان نامه ارشد درباره نمونه برداری

دانلود پایان نامه ارشد

محیط کشت و در حالی که جریان نیتروژن همچنان وجود داشت، عوامل کاهنده به محیط کشت اضافه شده و pH محیط روی 9/5 تنظیم گردید. سپس، جریان گاز نیتروژن قطع شده و جریان پیوسته محیط کشت به درون بیوراکتور با استفاده از یکی از پمپهای بیوراکتور آغاز گردید. لازم به ذکر است که پیش از این پمپ بیوراکتور برای تنظیم شدت جریان محیط کشت به درون بیوراکتور کالیبره شد. به منظور جلوگیری از ورود اکسیژن و هرگونه آلودگی به درون محیط کشت داخل باتل، کیسه کوچکی موسوم به تدلار بگ250 (Cole-Parmer) از گاز نیتروژن پر شده و به لوله خروجی متصل گردید که نمایی از آن در تصویر 3-6 نشان داده شده است.

تصویر ‏36: محیط کشت استریل همراه با تدلار بگ و جریان ورودی به بیوراکتور

برای جریان خروجی از بیوراکتور نیز از یکی از چهار پمپ بیوراکتور استفاده گردید. جریان خروجی وارد باتلی مشابه باتل حاوی محیط کشت می شد. برای کاهش امکان آلوده شدن محیط کشت در بیوراکتور، باتل و لوله های خروجی نیز هر روز استریل می شدند. تصویر 3-7 نمایی از سیستم پیوسته برای تخمیر گاز سنتز توسط باکتری لانگالی را نشان می دهد.

تصویر ‏37: نمایی از سیسستم پیوسته در فرایند تخمیر گاز سنتز توسط باکتری لانگالی

3-7-1 تاثیر نرخ رقیق سازی251
به منظور بررسی تاثیر نرخ رقیق سازی روی عملکرد باکتری در فرایند تخمیر پیوسته گاز سنتز، شدت جریان فاز مایع (محیط کشت) از 3/0 میلی لیتر بر دقیقه (012/0=D بر ساعت) تا 75/0 میلی لیتر بر دقیقه (030/0=D بر ساعت) تغییر داده شد، در حالی که شدت جریان گاز سنتز و دور همزن ثابت نگه داشته شد. هر 12 ساعت از فاز گاز و مایع نمونه برداری شد و نمونه ها مورد آنالیز قرار گرفتند تا دانسته سلولی، میزان مصرف سوبسترای گازی و اتانول و استات تولید شده در محیط کشت تعیین شود.

3-7-2 تاثیر شدت جریان گاز سنتز و دور همزن
برای مطالعه تاثیر شدت جریان گاز سنتز و دور همزن روی عملکرد سلولها در محیط کشت و ضریب انتقال جرم در فرایند تخمیر گاز سنتز، شدت جریان گاز از 0/4 تا 0/12 میلی لیتر در دقیقه تغییر داده شد و در هر شدت جریان گاز، دور همزن از 500-200 rpm افزایش داده شد. همان طور که قبلا اشاره شد برای تنظیم شدت جریان گاز از دستگاه کنترل کننده شدت جریان گاز استفاده گردید. در بررسی این پارامتر عملیاتی، سایر عوامل همچون شدت جریان مایع (نرخ رقیق سازی) و دور همزن ثابت نگه داشته شدند. هر 12 ساعت از فاز گاز و مایع در بیوراکتور نمونه برداری شد و نمونه ها مورد آنالیز قرار گرفتند تا شدت جریان بهینه تعیین شود.

3-8 آنالیز نتایج
3-8-1 اندازه گیری دانسیته سلولی
برای اندازه گیری دانسیته سلول در محیط کشت، از منحنی کالیبراسیون دانسیته سلولی بر حسب شدت جذب نور استفاده می شود. برای به دست آوردن این منحنی، محیط کشتی حاوی 0/5 گرم در لیتر فروکتوز تهیه گردید. همانند قبل، محلول فروکتوز و عوامل کاهنده در باتل های جداگانه تهیه و استریل شدند و سپس به محیط کشت اصلی اضافه گردیدند. پس از آن، pH محیط کشت با استفاده از محلول اسید کلریدریک یا هیدروکسید سدیم 0/1 مولار روی 9/5 تنظیم شد. این محیط کشت (50 میلی لیتر) با 0/5% حجمی از کشت بذر252 (5/2 میلی لیتر) تلقیح گردید. محیط کشت تلقیح شده در شیکر انکوباتور که در دمای 37 درجه سانتیگراد و دور150(rpm) تنظیم شده بود، قرار داده شد. پس از گذشت زمان حدود 20 ساعت که محیط کشت در اثر رشد باکتری کدر شده بود، 10 نمونه محلول از محیط کشت تهیه گردید. بدین ترتیب که در 10 لوله آزمایش، از حجم 0/1 تا 10 میلی لیتر محیط کشتی که باکتری در آن رشد کرده بود ریخته شد. حجم محلول تمام لوله های آزمایش با افزودن 0/9 تا صفر (لوله دهم حاوی محیط کشت خالص بود) میلی لیتر آب مقطر به 10 میلی لیتر رسانده شد. بدین ترتیب، ده غلظت مختلف از محیط کشت باکتری لانگالی حاصل گردید.
برای محاسبه وزن خشک سلول، از فیلتر غشایی 45/0 میکرون ((Sartorius Nylon membrane با قطر 13 میلی متر استفاده گردید. ابتدا، ده فیلتر غشایی در آون (Memmert، آلمان) در دمای 80 درجه سانتیگراد برای مدت 16 ساعت خشک شدند. سپس فیلترها با ترازوی دیجیتالی (Mettler Toledo، سوئیس) دقیق با دقت پنج رقم بعد از اعشار وزن گردیده و وزن هر فیلتر یادداشت شد. سپس فیلتر غشایی در داخل نگهدارنده فیلتر253((Advantec, MFS, Inc. قرار داده شد. از هر لوله آزمایش یک میلی لیتر محلول توسط سرنگ برداشته شد و به درون نگهدارنده فیلتر تزریق گردید. بدین ترتیب، از ده فیلتر برای فیلتر کردن ده محلول محیط کشت استفاده گردید. سپس، فیلترها مجددا در داخل آون خشک شدند و وزن نهایی آنها اندازه گیری شد. از تفاضل وزن نهایی و اولیه فیلتر و با در نظر گرفتن حجم 0/1 میلی لیتر محلولی که فیلتر شده بود دانسیته سلولی این ده نمونه بر حسب گرم بر لیتر محاسبه گردید.
برای به دست آوردن شدت جذب این ده نمونه از محیط کشت، مقداری از هر نمونه داخل سل254 دستگاه اسپکتروفتومتر (Agilent technology, Cary 60 UV-Vis، امریکا) ریخته شد و جذب هر نمونه در دستگاه در طول موج 580 نانومترخوانده شد. از یک نمونه محیط کشت بدون باکتری به عنوان نمونه شاهد برای صفر کردن شدت جذب استفاده گردید. سپس منحنی دانسیته سلولی بر حسب شدت جذب ترسیم گردیده و به عنوان منحنی کالیبراسیون برای اندازه گیری دانسیته سلولی در آزمایشها مورد استفاده قرار گرفت. منحنی کالیبراسیون به دست آمده در شکل 3-2 نشان داده شده است.

شکل ‏32: منحنی کالیبراسیون برای محاسبه دانسیته سلولی باکتری لانگالی

3-8-2 آنالیز فروکتوز و گلوکز در محیط کشت
برای اندازه گیری غلظت فروکتوز و گلوکز در محیط کشت از روش رنگ سنجی استفاده گردید. در این روش که برای تشخیص قندهای کاهنده255 متداول است، از معرف DNS استفاده می شود. برای تهیه این معرف، مقدار 10 گرم دی نیتروسالیسیلیک اسید256 (DNS) در 200 میلی لیتر محلول هیدروکسید سدیم 2 مولار حل گردیده و جوشانده شد. به صورت همزمان، محلول دیگری با حل کردن 300 گرم تاراتارات سدیم پتاسیم257 در 500 میلی لیتر آب مقطر تهیه گردیده و جوشانده شد. بلافاصله، این محلول به محلول در حال جوش DNS اضافه گردید و حجم محلول با افزودن آب مقطر به 1000 میلی لیتر رسانده شد. از محلول حاصل به عنوان معرف در تشخیص غلظت فروکتوز و گلوکز در محیط کشت بر اساس منحنی کالیبراسیون استفاده شد.
برای به دست آوردن منحنی کالیبراسیون برای فروکتوز، محیط کشتی (medium) با غلظت 0/1 گرم بر لیتر فروکتوز تهیه گردید. در ده لوله آزمایش مقدار 0/1 تا 10 میلی لیتر از محیط کشت ریخته شد و سپس 0/9 تا صفر میلی لیتر آب مقطر به لوله های آزمایش اضافه گردید تا حجم نهایی در هر لوله 0/10 میلی لیتر شود. بدین ترتیب محلولهایی با غلظت 1/0 تا 0/1 گرم بر لیتر فروکتوز حاصل گردید. از هر محلول، 0/1 میلی لیتر نمونه برداشته شد و در ده لوله آزمایش جدید ریخته شد. سپس، به هر لوله 0/1 میلی لیتر معرف DNS اضافه گردید. لوله ها در بشری حاوی آب جوش قرار داده شده و به مدت 15 دقیقه جوشانده شدند تا واکنش بین قند و معرف تکمیل شده و رنگ نارنجی پر رنگ (بر اساس میزان قند) حاصل گردد. پس از آن به منظور متوقف کردن واکنش، لوله های آزمایش در داخل آب و یخ قرار داده شدند. به هر لوله آزمایش 8 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد تا حجم نهایی 10 میلی لیتر شود. برای به دست آوردن شدت جذب نور این ده نمونه محلول قندی، مقداری از هر نمونه داخل سل دستگاه اسپکتروفتومتر (Agilent technology, Cary 60 UV-Vis، امریکا) ریخته شد و جذب هر نمونه در دستگاه در طول موج 540 نانومترخوانده شد. برای تهیه نمونه شاهد، از محیط کشت بدون قند استفاده گردید و سایر مراحل آزمایش همانند نمونه های حاوی قند بود. منحنی کالیبراسیون حاصل شده برای فروکتوز در شکل 3-3 نشان داده شده است.

شکل ‏33: منحنی کالیبراسیون برای فروکتوز

برای به دست آوردن منحنی کالیبراسیون برای گلوکز، محیط کشتی حاوی 0/1 گرم بر لیتر گلوکز تهیه گردیده و سایر مراحل همانند آزمایش فروکتوز عینا تکرار گردید. شکل 3-4 منحنی کالیبراسیون به دست آمده برای گلوکز را نشان می دهد.

شکل ‏34 : منحنی کالیبراسیون برای گلوکز
3-8-3 آنالیز نمونه های مایع برای اتانول و استات
برای تعیین غلظت اتانول و استات و گاهی استون در فاز مایع از آنالیز کروماتوگرافی گازی استفاده گردید. دستگاه کروماتوگراف گازی (Agilent, 5890 series II) مجهز به آشکارساز258FID بوده و به همین دلیل استفاده از کپسولهای گاز هیدروژن و هوا برای تولید شعله ضروری بود. از یک ستون کروماتوگرافی پرشده259 (Carbopack B-DA/4% Carbowax 20M, mesh 80/120) Supelco)، امریکا) برای تشخیص محصولات فرایند تخمیر گاز سنتز استفاده گردید. گاز حامل260 GC، هلیم با شدت جریان 30 میلی لیتر در دقیقه بود. دمای آون برای مدت 2 دقیقه در 100 درجه سانتیگراد نگه داشته شده و سپس با نرخ 10 درجه سانتیگراد در دقیقه تا 175درجه سانتیگراد افزایش داده شد و مدت 1 دقیقه نیز در این دما نگه داشته شد. دمای محل تزریق261 و آشکارساز 225 درجه سانتیگراد بود.
برای آماده سازی نمونه های مایع، 5/1 میلی لیتر از محیط کشت نمونه برداری شده در ویالهای پلاستیکی262 کوچک ریخته شده و در میکروسانتریفیوژ (Profuge 6K، کره) به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ گردید. پس از جداسازی سلولها، 5/0 میلی لیتر از مایع شفاف بالایی برداشته شد. سپس، نمونه ها با افزودن 15 میکرولیتر اسید فرمیک 98% (مرک) به وسیله میکروپیپت (Favorit) اسیدی شدند. همچنین 15 میکرولیتر از محلول 5/0% حجمی 2-پنتانون263 (فیشر264) که به عنوان استاندارد داخلی استفاده می شد به نمونه ها اضافه گردید. بدین ترتیب نمونه ها برای تزریق به GC آماده شدند. 0/2 میکرولیتر از نمونه توسط سرنگ 10 میکرولیتری (SGE، استرالیا) برداشته شده و به GC تزریق گردید. از مقایسه مونوگرام حاصل شده برای هر نمونه با مونوگرام مربوط به نمونه استاندارد و انجام محاسبات مربوطه، غلظت اتانول و استات در نمونه تعیین گردید. نمونه استاندارد محلولی حاوی اتانول، استات و استون با غلظتهای 0/1 گرم در لیتر بود که همانند سایر نمونه ها اسیدی شده و استاندارد داخلی به آن اضافه شده بود. نمونه هایی از مونوگرامهای حاصله و محاسبات مربوطه در پیوست الف ارائه شده است.

3-8-4 آنالیز نمونه های گاز
برای تعیین میزان گاز مصرف شده در فرایند تخمیر گاز سنتز از آنالیز کروماتوگرافی گازی استفاده گردید. بدین منظور از دستگاه کروماتوگراف گازی (Perkin Elmer, Autosystem XL) با آشکارساز TCD استفاده شد. ستون کروماتوگرافی مورد استفاده یک ستون پرشده15 ft × 1/8 in., mesh 100/120) Carboxene 1000,) Supelco)، امریکا) و گاز حامل GC، هلیم با شدت جریان 30 میلی لیتر در دقیقه بود. دمای آون برای مدت 3 دقیقه در 50 درجه سانتیگراد نگه داشته شد و سپس با نرخ 20 درجه سانتیگراد در دقیقه تا 180 درجه سانتیگراد افزایش داده شد و در این دما به مدت 5/2 دقیقه ثابت نگه داشته شد. دمای محل تزریق و آشکارساز به ترتیب 150 و 220 درجه سانتیگراد بود.
برای آنالیز نمونه های گاز 3/0 میلی لیتر از نمونه گازی (از فضای بالای سرم باتل یا بیوراکتور) توسط سرنگ 0/1 میلی لیتری (Hamilton، امریکا) کشیده شده و به GC تزریق گردید. محاسبات مربوط به تعیین درصد اجزای گاز توسط نرم افزار TotalChrom Workstation Version 6.3.1 (Perkin Elmer، امریکا) انجام شد. محاسبات مربوط به تعیین درصد اجزای گاز سنتز با توجه به نمونه استاندارد به همراه چند مونوگرام در پیوست ب آورده شده است.

3-9 مدلهای کینتیکی و روش به دست آوردن آنها
3-9-1 کینتیک رشد سلول
ساده ترین مدلی که برای توصیف رشد سلول در محیط کشت ناپیوسته ارائه شده است مدل

پایان نامه
Previous Entries منابع پایان نامه ارشد درباره نمونه برداری، فیزیولوژی Next Entries منابع پایان نامه ارشد درباره بازدارندگی، مواد غذایی، تغییرات جمعیت، تغییرات جمعیتی