منابع پایان نامه ارشد درباره بازدارندگی

دانلود پایان نامه ارشد

تاثیر فشار جزئی CO روی رشد سلول و تولید اتانول و استات در محیط کشت ناپیوسته باکتری کلستریدیوم کربوکسیدیورانز229 انجام دادند. افزایش فشار جزئیCO از 35/0 به 2 اتمسفر، غلظت سلولی را از 2/0 به 08/1 گرم بر لیتر افزایش داد. تولید استات که یک محصول وابسته به رشد سلول است و ATP برای رشد سلول تولید می کند تقریبا در تمام موارد یکسان بود. بررسی نمودارهای مربوط به تولید اتانول بر حسب وزن سلول نشان داد که با افزایش غلظت CO، تولید اتانول از حالت وابسته به عدم رشد به حالت وابسته به رشد جابجا شد و همچنین تولید اتانول از زمانهای اولیه آغاز گردید. یونسی و همکارانش [82, 115] نیز اثر فشار گاز سنتز (8/0 تا 8/1) را در محیط کشت ناپیوسته باکتری لانگالی بررسی کردند. نتایج این بررسی نشان داد که حتی فشارهای بالای گاز (6/1 و 8/1 اتمسفر) اثرات بازدارندگی روی سلولها نداشت، هرچند، غلظت سلولی و استات تقریبا در همه فشارهای به کار گرفته شده یکسان بود. تولید اتانول در فشارهای بالا بهبود یافت. این تولید بیشتر احتمالا به دلیل مصرف CO2/H2 به عنوان سوبسترای گازی در کنار CO و انتقال جرم بهتر در فشارهای بالا بود.

3 فصل سوم: مواد مورد نیاز و روش کار

3-1 مقدمه
در این فصل مواد شیمیائی و بیوشیمیائی مورد استفاده در آزمایشها، دستگاهها و تجهیزات مورد نیاز برای انجام آزمایشها، روشهای انجام آزمایشهای تخمیر گاز سنتز و همچنین نحوه آنالیز نتایج به تفصیل شرح داده می شوند. آزمایشهای انجام شده برای کشت باکتری لانگالی و استفاده از این بیوکاتالیست برای انجام فرایند تخمیر ناپیوسته گاز سنتز در سرم باتل، همراه با تغییر پارامترهای عملیاتی توضیح داده می شوند. نحوه انجام آزمایشهای پیوسته در بیوراکتور شرح داده شده و در پایان روابط مورد استفاده در مطالعه کینتیک فرایند و روش به دست آوردن معادلات ارائه می گردد.
3-2 باکتری کلستریدیوم لانگالی230
باکتری خالص کلستریدیوم لانگالی با شماره ATCC 55383 از کلکسیون محیط کشت امریکا231 خریداری شد. این باکتری به صورت فریز شده در گلیسرول در یک آمپول کوچک از شرکت ATCC دریافت گردید (تصویر 3-1). برای کشت مجدد این باکتری در محیط کشت مایع و جامد، دستورالعمل ATCC به صورت کامل و دقیق اجرا شد.

تصویر ‏31: آمپول حاوی باکتری کلستریدیوم لانگالی ATCC 55383

3-3 محیط کشت باکتری لانگالی
برای رشد باکتری لانگالی از محیط کشتی غنی حاوی نمکهای معدنی، عناصر جزئی، ویتامینها، عصاره مخمر و فروکتوز به عنوان منبع کربنی استفاده گردید. ترکیبات مورد استفاده در محیط کشت در جدول 3-1 ارائه شده اند. تمام مواد شیمیائی و بیوشیمیائی از شرکت مرک232 یا سیگما-آلدریچ233 خریداری شدند.

جدول ‏31: ترکیبات شیمیائی و بیوشیمیائی مورد استفاده در محیط کشت باکتری لانگالی
ترکیبات محیط کشت
نمکهای معدنی

شرکت تجاری

کلرید آمونیوم (Ammonium chloride)
مرک

کلرید پتاسیم (Potassium chloride)
مرک

سولفات منیزیم (Magnesium sulfate)
مرک

کلرید سدیم (Sodium chloride)
مرک

پتاسیم دی هیدروژن فسفات ((Potassium dihydrogen phosphate
مرک

کلرید کلسیم (Calcium chloride)
مرک

عناصر جزئی

نیتریلوتری استیک اسید (Nitrilotriacetic acid)
مرک

سولفات منگنز (Mangan sulfate)
مرک

آمونیوم فروس سولفات (Ammonium ferrous sulfate)
مرک

کلرید کبالت (Cobalt chloride)
مرک

سولفات روی (Zinc sulfate)
مرک

کلرید مس (Copper chloride)
مرک

کلرید نیکل (Nickel chloride)
مرک

سدیم مولیبدات (Sodium molibdate)
مرک

سدیم سلنات (Sodium selenate)
مرک

سدیم تنگستات (Sodium tungstate)
مرک

ویتامینها

بیوتین (Biotin)
سیگما-آلدریچ

فولیک اسید (Folic acid)
سیگما-آلدریچ

پیریدوکسین هیدروکلراید (Pyridoxine-HCl)
سیگما-آلدریچ

تیامین (Thiamine-HCl)
سیگما-آلدریچ

ریبوفلاوین (Riboflavin)
سیگما-آلدریچ

نیکوتینیک اسید (Nicotinic acid)
سیگما-آلدریچ

کلسیم پنتوتنات (Calcium D-(+)-pantothenate)
سیگما-آلدریچ

ویتامین B12 (Cyanocobalamin)
سیگما-آلدریچ

آمینوبنزوئیک اسید (p-Aminobenzoic acid)
سیگما-آلدریچ

تیوکتیک اسید (Thioctic acid)
سیگما-آلدریچ

عوامل کاهنده

سیستئین اسیدی (HCl-Cysteine)
سیگما-آلدریچ

سدیم سولفید (Sodium sulfide)
سیگما-آلدریچ

عصاره مخمر

مرک

فروکتوز

مرک
3-3-1 ترکیبات محیط کشت مایع
برای تهیه محیط کشت مایع NH4Cl (0/1 گرم)، KCl (1/0 گرم)، MgSO4.7H2O (2/0 گرم)، NaCl (8/0 گرم)، KH2PO4 (1/0 گرم)، CaCl2.2H2O (0/20 میلی گرم)، عصاره مخمر (0/1گرم)، عناصر جزئی (10 میلی لیتر) و محلول ویتامین ولف234 (10 میلی لیتر) در 980 میلی لیتر آب مقطر حل شد.

3-3-1-1 محلول عناصر جزئی
برای تهیه محلول عناصر جزئی مقدار 0/2 گرم نیتریلواستیک اسید در یک لیتر آب مقطر حل گردید و pH محلول با استفاده از محلول هیدروکسید پتاسیم روی 0/6 تنظیم شد. سپس MnSO4.H2O (0/1 گرم)، Fe(SO4)2(NH4)2.6H2O (8/0 گرم)، CoCl2.6H2O (2/0 گرم)، ZnSO4.7H2O (2/0 گرم)،CuCl2.2H2O (20 میلی گرم)، NiCl2.6H2O (20 میلی گرم)، Na2MoO4.2H2O (20 میلی گرم)، Na2SeO4 (20 میلی گرم) و Na2WO4 (20 میلی گرم) به محلول اضافه گردیدند.

3-3-1-2 محلول ویتامین ولف
برای تهیه محلول ویتامین، بیوتین (0/2 میلی گرم)، فولیک اسید (0/2 میلی گرم)، پیریدوکسین هیدروکلراید (0/10 میلی گرم)، تیامین (0/5 میلی گرم)، ریبوفلاوین (0/5 میلی گرم)، نیکوتینیک اسید (0/5 میلی گرم)، کلسیم پنتوتنات (0/5 میلی گرم)، ویتامین B12 (1/0 میلی گرم)، آمینوبنزوئیک اسید (0/5 میلی گرم) و تیوکتیک اسید (0/5 میلی گرم) در یک لیتر آب مقطر حل شدند.
3-3-1-3 محلول عوامل کاهنده235
برای تهیه محلول عوامل کاهنده، هیدروکسید سدیم (9/0 گرم) در 100میلی لیتر آب مقطر حل گردیده و در محیط نیتروژن جوشانده شد. سپس سیستئین (0/4 گرم) و بعد از آن سدیم سولفید (0/4 گرم) به محلول اضافه گردید. این محلول در شرایط کاملا بی هوازی در سرم باتل236 Fischer Scientific)، انگلستان) ریخته شد و اتوکلاو گردید.

3-4 روش تهیه محیط کشت مایع
محیط کشت مایع بر اساس دستورالعمل شرح داده شده بدون فروکتوز و عوامل کاهنده تهیه شد. به منظور حذف اکسیژن، محلول جوشانده شد. محیط کشت جوشانده شده با وارد کردن جریانی از گاز نیتروژن به درون مایع تا دمای حدود 45 درجه سانتیگراد خنک گردید. محیط کشت (50 میلی لیتر) سپس در داخل چند سرم باتل (163 میلی لیتر) توزیع گردید. مجددا گاز نیتروژن برای مدت 2-1 دقیقه به داخل سرم باتل فرستاده شد و در باتل ها یکی پس از دیگری بسته شدند. برای بستن سرم باتل ها، ابتدا یک درپوش لاستیکی و سپس یک روکش آلومینیومی روی باتل قرار داده شد و پس از آن توسط وسیله ای موسوم به کریمپر237 (Wheaton) بسته شدند. طراحی سرم باتل ها به گونه ای است که پس از بستن در آنها، امکان ورود و خروج هوا و یا گاز دیگری وجود ندارد و این مساله برای کشت دادن ارگانیزمهای بی هوازی بسیار مهم است.
محلول فروکتوز به صورت جداگانه با غلظت 0/5 گرم در لیتر تهیه گردید. در تهیه این محلول نیز مراحل جوشاندن و خنک کردن با نیتروژن انجام شده و سپس سرم باتل بسته شد. محلول عوامل کاهنده نیز جداگانه به صورتی که شرح داده شد (بخش 3-3-1-3) تهیه گردید. تمامی باتل های محیط کشت، فروکتوز و عوامل کاهنده در اتوکلاو 75 لیتری (Selecta، اسپانیا) در دمای 121 درجه سانتیگراد برای مدت زمان 15 دقیقه استریل شدند.
برای آماده سازی محیط کشت، محلول فروکتوز و سپس محلول عوامل کاهنده به محیطهای کشت اصلی اضافه شدند. به منظور حصول اطمینان مجدد از ایجاد شرایط بی هوازی در داخل سرم باتل ها، گاز نیتروژن پس از عبور از فیلتر 45/0 میکرون (Sartorius) از طریق سوزن (سرسرنگ) وارد باتل گردید و از سوزن دیگری برای خروج گاز از داخل باتل استفاده گردید (تصویر 3-2). بدین ترتیب، گاز نیتروژن وارد باتل شده و سپس از خروجی به بیرون می رفت. پس از گذشت 30 ثانیه، هر دو سوزن ورودی و خروجی برداشته شد. این مراحل در تمام آزمایشهایی که در سرم باتل انجام می گرفت، اجرا می شد.

تصویر ‏32: نحوه وارد کردن گاز به داخل سرم باتل

3-4-1 روش تهیه محیط کشت جامد
برای تهیه محیط کشت جامد، 5/1% آگار (مرک) به محیط کشت مایع اضافه گردید. محیط کشت پس از جوشاندن در داخل لوله کشت238 (Scott) ریخته شد. گاز نیتروژن به داخل لوله فرستاده شد و سپس درِ لوله های کشت بسته شد. محلول فروکتوز و عوامل کاهنده نیز به ترتیبی که توضیح داده شد تهیه گردیدند و سپس همه محلولها استریل شدند. پس از استریل شدن، تمامی محلولها به داخل محفظه بی هوازی منتقل شده و در آنجا تحت جریان گاز نیتروژن، فروکتوز و محلول عوامل کاهنده به محلول لوله کشت که هنوز داغ بود اضافه شدند. سپس در لوله ها بسته شد و در حالت شیب داری قرار داده شدند تا خنک شده و محیط کشت جامد حاصل شود. مقداری از محیط کشت نیز در پتری دیش استریل ریخته شد و در حالی که درِ آن نیمه باز بود برای مدتی در جریان گاز نیتروژن (داخل محفظه بی هوازی) قرار داده شد تا جامد شود.

3-5 نحوه تکثیر باکتری لانگالی
باکتری لانگالی از جمله باکتریهای به شدت بی هوازی است و تکثیر آن بنا به دستورالعمل ATCC باید در محیط به شدت بی هوازی صورت گیرد. بنابراین، ایجاد شرایط کاملا بی هوازی برای رشد و تکثیر از اصول اولیه کار با این باکتری بود. بدین منظور، از یک محفظه بی هوازی موسوم به گلاو باکس239 استفاده گردید که نمایی از آن در تصویر 3-3 نشان داده شده است. قبل از استفاده از این محفظه، محلول 2-پروپانول 70% در داخل آن اسپری گردید تا آلودگیها را تا حد ممکن کاهش دهد.

تصویر ‏33: محفظه بی هوازی همراه با کپسول نیتروژن برای ایجاد شرایط بی هوازی

آمپول حاوی باکتری فریز شده که پیش از این در فریزری با دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری می شد، مدتی قبل از تلقیح در داخل محفظه بی هوازی و در دمای محیط قرار داده شده تا آب شود. تمام محیطهای کشت استریل شده (جامد و مایع) نیز در داخل محفظه بی هوازی قرار داده شد. سپس گاز نیتروژن پس از عبور از فیلتر به درون محفظه باز گردید، جریان گاز نیتروژن در ابتدا زیاد بود تا موجب بیرون راندن اکسیژن موجود در محفظه شود. پس از گذشت چند دقیقه و خاموش شدن شمعی که برای حصول اطمینان از شرایط بدون اکسیژن در داخل محفظه روشن شده بود، جریان نیتروژن کاهش داده شد اما تا انتهای فرایند تلقیح، جریان مداوم نیتروژن به درون محفظه بی هوازی وجود داشت.
حدود 6-5 میلی لیتر از محیط کشت توسط سرنگ در داخل یک لوله استریل ریخته شد و سپس تمام محتویات آمپول به این محیط کشت اضافه شد. بدین ترتیب، سوسپانسونی از سلولها حاصل گردید که به عنوان مایه تلقیح برای تلقیح کردن محیطهای کشت مورد استفاده قرار گرفت. برای تلقیح کردن محیط کشت جامد، چند قطره از سوسپانسیون سلولی توسط لوپ240 روی محیط کشت آگار قرار داده شد و سپس درِ لوله های کشت بسته شد. برای تلقیح محیط کشت مایع، مقداری از سوسپانسون سلولی توسط سرنگ استریل کشیده شد و از طریق درپوش لاستیکی سرم باتل، داخل محیط کشت مایع ریخته شد. تمامی لوله های کشت و سرم باتل ها در داخل انکوباتور (Stuart، انگلستان) در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پیش از آن، درِ لوله های کشت و اطراف پتری دیش با پارافیلم پیچیده شد تا مانع از نفوذ هوا به داخل لوله ها شود. پس از آنکه کدورت کافی در محیطهای کشت مشاهده گردید و رشد برفکی241 روی پلیت

پایان نامه
Previous Entries منابع پایان نامه ارشد درباره بازدارندگی، تجاری سازی، جاری سازی Next Entries منابع پایان نامه ارشد درباره نمونه برداری، فیزیولوژی