منابع و ماخذ پایان نامه مکان یابی

دانلود پایان نامه ارشد

توسعه کیفیت الگوی باندینگ می شود (یانوزی و دی براردینو، 2008).
G- باندينگ با واردسازی زودهنگام BrdU و اکریدین اورنج (GBA- باندينگ): اين روش شبيه QBH- باندينگ است با اين تفاوت كه اکریدین اورنج نواحی DNA حاوي BrdU و و فاقد BrdU را به ترتيب به صورت قرمز و زرد رنگ آمیزی مي كند (یانوزی و دی براردینو، 2008).
G- باندينگ با واردسازی زودهنگام BrdU و گيمسا (GBG- باندينگ): اين روش شبيه QBH- باندينگ است با اين تفاوت كه در اينجا گیمسا نواحی DNA جایگزین شده با BrdU را به صورت رنگ پریده و DNA فاقد BrdU را تیره می کند (یانوزی و دی براردینو، 2008).
C- باندينگ: باریوم هیدروکسید 5 درصد (محلول اشباع شده) باعث دناتوره شدن توالی های تکراری و غیرتکراری DNA می شود. سپس بعد از اینکه DNA در محلول 2 برابر SSC در 60 درجه سانتيگراد قرار داده شود، مجدداً توالي هاي DNA به هم مي چسبند. توالی های تکراری DNA زودتر از توالی های غیر تکراری به هم چسبيده و بنابراین باعث آشکارسازی سانترومرها (يا هر باند C- مثبت تشكيل شده از توالي هاي تكراري) می شوند (سانترومر ها غنی از توالی های تکراری هستند) (یانوزی و دی براردینو، 2008).
R- باندينگ به وسیله فلورسنس با استفاده از اکریدین اورنج (RBA- باندينگ): واردسازی Brdu در نواحی دیر همانندسازی کننده (هتروکروماتین) به شدت ميل تركيبي این نواحی را به اکریدین اورنج کاهش می دهد. بنابراین نواحی هتروكروماتيني رنگ قرمز به خود می گیرند (باندهای R- منفي) و در مقابل نواحی زود همانندسازی کننده (یوکروماتین) که در آن ها DNA دست نخورده یا فاقد BrdU است دارای ميل تركيبي قوی به فلوروکروم بوده و باندهای براق فلورسنس زرد رنگ را (باندهای R- مثبت) نشان می دهند (ISCNDB، 2000 و یانوزی و دی براردینو، 2008).
در روش RBA- باندينگ مي توان BrdU را همراه با Hoechst33258 براي افزايش وضوح باندها و به تاخير انداختن فشردگي كروموزوم استفاده نمود (دی براردینو و همکاران، 2002).
R- باندينگ با استفاده از گيمسا (RBG- باندينگ): واردسازی BrdU در نواحی دیرهمانندسازی کننده (هتروکروماتین) به شدت افینیته این نواحی را به رنگ گیمسا کاهش می دهد بنابراین باعث تولید باندهای R-منفی به رنگ خاکستری در هتروكروماتين مي شود. در مقابل نواحی زود همانندسازی کننده (یوکروماتین) دارای ميل تركيبي قوی به گیسما بوده و لذا باندهای مثبت گیمسا را تولید می کنند (ISCNDB، 2000 و یانوزی و دی براردینو، 2008).
T- باندينگ (تلومر- باندینگ): انکوباسیون DNA در دمای 87 درجه سانتيگراد در حضور گیمسا باعث آشکارسازی باندهای انتهایی می شود که تا حدودی مربوط به باندهای R هستند. باندهای T کمتر در مطالعات مورد توجه قرار گرفته اند و تاکنون گزارش های زیادی از آنها به جز در مورد كروموزوم هاي گاو در دسترس نیست (یانوزی و دی براردینو، 2008).
رنگ آميزي Ag-NOR: نیترات نقره باعث رنگ آمیزی پروتئین های کروموزومی مرتبط با سیسترون های فعال ریبوزومی (18s + 28s) می شود. پیش تیمار کروموزوم ها با بورات در PH بالا سبب سهولت واکنش نقره مخصوصا زمانی که مراحل رنگ آمیزی متوالی استفاده می شوند خواهند شد (یانوزی و دی براردینو، 2008).
تبادل جابجايي هاي كروماتيدهاي خواهري (SCE): جابجایی قطعات ژنومی بین کروماتیدهای خواهری را می توان با استفاده از اکریدین اورنج (شبیه RBA- باندينگ) مشاهده کرد (یانوزی و دی براردینو، 2008).
جايگاه هاي شكست (Fragil sites): آفیدی کولین یک مهار کننده قوی برای DNA پلی مرازهاي آلفا و بتا است. عمل آن سبب تاخیر در فشردگی کروموزوم و مشاهده شکستگي هاي كروماتيدي (در يك يا هر دو رشته) و جایگاه های شكست روي كروموزوم ها می شود. این جايگاه ها را می توان با رنگ آمیزی RBA یا RBG مشاهده کرد (یانوزی و دی براردینو، 2008).

1-2-9- هيبريداسيون در محل فلورسنتي (FISH)
1-2-9-1 تاریخچه
اولین تکنیک هیبریدسازی در محل توسط گال و پاردو (1969) با استفاده از پروب های DNA نشاندار شده با روش رادیواکتیو ارائه شدکه بعداً با هیبریداسیون در محل فلورسنت جایگزین شد (FISH) (لانگر و همکاران، 1981)، که در آن از پروب های نشاندار شده با فرآیند غیرایزوتوپی مثل ردیابی بیوتین با ترکیبات فلورسنت (فلورسین) متصل شده به آویدین که دارای ميل تركيبي زیادی برای بیوتین هستند استفاده می شد (پینکل و همکاران، 1986). پیشرفت های بعدی در مهار DNA ژنومیک (لاندجت و همکاران، 1987) امکان استفاده از پروب های ژنومی بزرگ از قبیل پروب های حاوی کتابخانه های کروموزومی را در FISH فراهم آورد.

1-2-9-2 اصول بنیادی
عموماً نشاندار سازی پروب ها را می توان با روش هایی نظیر Nick translation، پرایمرهای تصادفی یا مستقیما با استفاده از PCR انجام داد. اندازه سیگنال های هیبریداسیون به ماهیت پروب ها بستگی دارد. عموما کلون های BAC و YAC سیگنال های بزرگ هیبریداسیون را نشان می دهند. پروب های cDNA عموما برای ژن های دارای چند کپی استفاده می شوند. همچنین کتابخانه های کروموزومی کامل می توانند به عنوان پروب های painting در زمینه مطالعات تکاملی و کلینیکی استفاده شوند (جان و همکاران، 2006). یک نقشه سیتوژنیک عالی میتواند یک قطعه DNA را در یک ناحيه حدود Mb 10 (سایز تیپیکال یک باند کروموزومی انسان) مکان یابی کند (کوکت و کل، 2009). FISH متافازي استاندارد، وضوح نقشه اي در حدود Mb 2 را فراهم مي آورد. استفاده از كروموزوم هاي كمتر فشرده شده پرو متافاز يا پاكي تن مي تواند وضوح را تا حد Mb 2-1 افزايش دهد. كروموزوم هاي طويل شده به روش مكانيكي (MSC) تهيه نقشه هاي با وضوح 20-10 برابر را نسبت به كروموزوم هاي معمولي فراهم مي آورند. همچنين FISH مي تواند روي هسته هاي اينترفازي براي وضوح كمتر از Kb 100 انجام شود. بيشترين وضوح (در حد Kb 1) توسط FISH روي رشته هاي توسعه يافته DNA تك رشته اي حاصل مي شود كه اصطلاحاً Fibre-FISH ناميده مي شود (فرایز و رووینسکی، 1999). این روش برای مشخص سازی ترتیب ژن ها و سازماندهی آنها و همچنین ساختار فیزیکی نواحی ژنومی خاص استفاده مي شود. درجه وضوح در Fibre-FISH از یک مقدار اندك تا kb 300 می باشد. اندازه گيري سیگنال هاي Fibre-FISH انسان با استفاده از كاسميدهاي با طول مشخص، فشردگي متوسط 03/0 ± 33/0 (µm/Kb) را نشان داد كه بسيار به عدد µm/Kb 33/0 واتسون و كريك نزديك است (گلدامر و همکاران، a2009). بنابراين FISH مي تواند نقشه يابي در سطوح با وضوح متفاوتي را انجام دهد و در نتيجه مي تواند اكثر نيازها را در زمينه كلونينگ موقعيتي در حيوانات اهلي فراهم آورد (فرایز و رووینسکی، 1999). سیگنال های فلورسنت با استفاده از یک میکروسکوپ فلورسنس تجهیز شده با یک دوربین با قابلیت بالای CCD (Charge coupled device) ردیابی مي شوند. می توان از چندین فلوروکروم همزمان در یک آزمایش نيز استفاده کرد. انواع مختلفی از پروب های DNA را می توان در آزمایشات هیبریداسیون در محل از قبیل پروب های مخصوص سانترومر، پروب هاي مخصوص جایگاه های ژنی، پروب های هيبريداسيون قطعات کروموزومی برای تمام یا قسمتی از کروموزوم، پروب های تلومری و پروب هاي ساب تلومری را به كار برد. نوع پروب را هدف ما در آزمایش تعیین می کند (روبس و همکاران، 2009).
FISH تاکنون کاربردهای زیر را داشته است:
1- تعیین و شناسایی نواقص عددی یا ساختاری کروموزوم ها در سندرم های ارثی.
2- مکان یابی دقیق ژن ها یا توالی های DNA.
3- مشاهده حذف ها یا الحاق های کروموزومی وتعیین گستردگی آن ها.
4- شناسایی همولوژی های کروموزومی بین گونه های مختلف.
5- FISH همچنین برای اتصال بهتر نقشه های لینکاژی و RH در نواحی اختصاصی کروموزوم بسيار مفید است.
اتصال سيتوژنتيكي گروه هاي لينكاژي بر اساس مكان يابي مستقيم با كمك تكنيك FISH يا مكان يابي غير مستقيم به كمك نقشه يابي قطعات سينتنيك يك يا چند جايگاه موجود در يك گروه لينكاژي انجام مي شود.
کاربرد هاي تکنیک FISH در حیوانات اهلی و انسان بسیار شبیه است. اگرچه تفاوت بزرگی درمورد در دسترس بودن پروب ها برای حیوانات اهلی نسبت به انسان وجود دارد. بر خلاف انسان، وجود پروب های تجاری در حیوانات اهلی بسیار کم و گران قیمت است (روبس و همکاران، 2009).

1-2-9-3 استفاده از FISH در پژوهش های ستوژنتیک حیوانات اهلی
اولین استفاده از FISH در حیوانات اهلی توسط گالاقر (1992) برای شناسایی دقیق ترانسلوکاسیون تركيب پشت سر هم (Tandem Fusion Translocation) در کروموزوم شماره 23 گاو گزارش شد. در اين مطالعه یک پروب cDNA حاوی کمپلکس MHC (BOLA) برای نقشه یابی روی کروموزوم 23 استفاده شد. پس از آن اولین مکان یابی اختصاصی ژن ها در گاوسانان با استفاده از تکنیک FISH گزارش شدند (گالاقر و همکاران، 1993؛ هییز و همکاران، 1993 و یانوزی و همکاران، 1993). اخیرا مطالعات زیادی برای تهیه نقشه های سیتوژنتیک صدها ژن در حیوانات اهلی توسط FISH انجام شده است که منجر به توسعه نقشه سیتوژنتیکی حیوانات مزرعه ای شده است. هم چنین تکنیک FISH برای مطالعه نواقص پیچیده کروموزومی (دیمئو و همکاران، 2006)، برای مقایسه گونه های غیر مرتبط با استفاده ZOO-FISH، برای مقایسه گونه های فامیل و غیر فامیل با استفاده از نقشه یابی های دقیق مقایسه ای و برای تعیین ترتیب ژن ها روی کروموزوم های همولوگ (یا نواحی همولوگ کروموزومی) استفاده شده است (شیبلر و همکاران، 1998). FISH هم چنین کاربردهای عملی در مطالعه سازماندهی ژنومی یا شناسایی مضاعف شدگی ژن ها روی فیبرهای گسترده کروماتینی (FISH Fiber-) پیدا کرده است (برونر و همکاران، 1998). روش های هیبریداسیون در محل در سیتوژنتیک بر اساس توانایی اتصال یک رشته نوکلئیک اسید به ناحیه مکمل خود در DNA هدف ثابت شده روی یک اسلاید میکروسکوپی انجام مي گيرد. DNA کاوشگر می تواند به صورت رادیواکتیو و یا با برخی از فلوروکروم ها نشاندار شود. ترجیحاً امروزه DNA نشاندارشده با روش غیر رادیواکتیو به عنوان کاوشگر برای هیبریداسیون در محل استفاده می شود. سپس مکان یابی پروب با روش ایمونوفلورسنس مستقیم یا غیرمستقیم انجام می شود.

1-2-9-4 استفاده از مكان يابي فيزيكي ژن ها با تكنيك FISH براي تاييد صحت گردآوري هاي ژنوم موجودات
پس از گرد آوری و در دسترس بودن ژنوم کامل برخی حیوانات اهلی مانند گاو و همچنین در دسترس بودن نقشه های لینکاژی گاو و گوسفند شاید مکان یابی فیزیکی ژن ها با روش FISH امروزه کاری غیر متداول و غیر ضروری تلقی شود. اما حقیقت این است که حتی هنوز هم حدود 7/9 درصد از ژن ها در ژنوم گاو در آخرین گرد آوری ژنوم گاوی (Btau_4.0) نقشه یابی نشده اند (دی لورنزی و همکاران، 2010). بنابراين اگر تعداد ژنها را 22000 در نظر بگیریم هنوز 2134 جايگاه ژني مشخص نیست (السیک و همکاران، 2009). زيميني و همكاران در گردآوري UMD_3.1 كه ما در پژوهش حاضر از آن استفاده كرديم تعداد 35 ميليون توالي خوانده شده را مورد استفاده قرار دادند. ولي به هر حال تنها 91 درصد يعني Mb 86/2 از توالي ژنوم گاو روي كروموزوم هاي اين حيوان قرار داده شد. بنابراين در گردآوري UMD_3.1 نيز حدود نه درصد ژنوم گاو نامفهوم و نامعلوم است. همچنین، وجود برخی توالی ها در ژنوم که اصطلاحاً به آن ها توالی های دشوار برای کلون گفته می شود باعث ایجاد شکاف هایی در گردآوری های ژنومی حیوانات می شوند (هاتوری و همکاران، 2000). صحت نقشه های ژنومی در صورت ترکیب اطلاعات منابع مختلف برای تهیه نقشه های کامل بیشتر خواهد شد. به عنوان مثال سازه های ژنوم حیوانات مثل سازه Btau_2.0 گاوی فقط بر اساس داده های توالی یابی کل ژنوم با روش shotgun و داده های حاصل از نقشه یابی های محدود تهیه شده اند و قطعاً مستعد بروز خطاهای نقشه یابی هستند. رفع اشتباهات گردآوری های توالی های ژنومی نیازمند کسب اطلاعات از نقشه یابی های وسیع تر و دقیق تر از جمله مکان یابی فیزیکی ژن ها با تكنيك FISH و RH است تا باعث افزایش اعتبار این گرد آوری ها شود (جان و

پایان نامه
Previous Entries منابع و ماخذ پایان نامه انتقال اطلاعات، استاندارد سازی، همزمان سازی Next Entries منابع و ماخذ پایان نامه مکان یابی، انفورماتیک، محدودیت ها