منابع و ماخذ پایان نامه كلون، BAC، يابي

دانلود پایان نامه ارشد

د. امكان تهيه نقشه هاي فيزيكي ژنوم يوكاريوت ها به طور عمده با ظهور حاملين كلونينگ يا همان وكتورها كه قابليت حمل و تكثير قطعات بزرگ DNA ژنومي را دارا هستند تحقق يافت. اولين نسل كلون هاي حامل قطعات بزرگ بوسيله كتابخانه هاي YAC فراهم شد (بورک و همکاران، 1987). به دليل اينكه YACها حامل قطعات بزرگ (تا 2 ميليون جفت باز) هستند براي تهيه سريع نقشه هاي با وضوح كم براي نواحي بزرگ كروموزومي مناسب بودند. اما اگرچه كتابخانه هاي YAC به خوبي براي مرتب سازي STSها و اتصال نقشه هاي فيزيكي كوچك عمل مي كنند اما نرخ زياد كيمريسم (تا 50 درصد) و عدم ثبات اين كلون ها امروزه استفاده آن ها را در پروژه هاي توالي يابي و نقشه يابي فيزيكي ژن ها با تکنیک FISH محدود كرده است (روبس و همکاران، 2009).
نسل دوم كلون هاي حاوي قطعات بزرگ ژنومي شامل BACها و PACها مي شود كه هر دوي آن ها به عنوان پلاسميدهاي سلول هاي باكتريايي و كروموزوم هاي مصنوعي يوكاريوت ها عمل مي كنند. نقشههای فیزیکی كلون هاي همپوشان چهارچوب اصلی فعالیتهای كلونينگ موقعيتي ژن ها را فراهم آورده اند. مرتب سازی کلونهای YAC یا BAC (و سپس خواندن Shotgun آن ها) بدون وجود نقشههای ژنتیکی و فیزیکی امكان پذير نيست. اين نقشه ها به عنوان داربست برای مرتب سازی کلونها، جهت دادن به آنها و رفع اشکالات موجود از روی ژنوم عمل میکنند (ویلسون و همکاران، 2001). علت استفاده نکردن از YAC برای تهیه نقشه هاي كلون هاي همپوشان این است که به علت سایز بزرگ قطعه قرار گرفته در YAC این کلونها ناپایدار هستند لذا ممکن است باعث ایجاد باز آرايي در نقشه تولید شده شوند. کلونهای BAC چرخهای اولیه پروژه تعیین توالی ژنوم انسان بودند (کوکت و کل، 2009).

جدول 3-1. مواد استفاده شده در كشت سلول هاي لنفوسيت خون در پژوهش حاضر
مواد
گاو
گاوميش
گوسفند
بز
RPMI1640
ml 8
ml 8
ml 8
ml 8
FCS
ml 1
ml 1
ml 1
ml 1
ConA (15 µg/ml)
ml 2/0
ml 2/0
ml 2/0
ml 2/0
Amphotricine
µl 50
µl 50
µl 50
µl 50
Pen/Step
µl 50
µl 50
µl 50
µl 50
BrdU (15 µg/ml)
µl 150
µl 150
µl 150
µl 150
Hoechst33258 (30 µg/ml)
µl 150
µl 150
µl 150
µl 150
Heparin
1 قطره
1 قطره
1 قطره
1 قطره
Blood
ml 1
ml 1
ml 1
ml 1
Colcemid (10 µg/ml)
µl 30
µl 50
µl 50
µl 30

در پژوهش حاضر از كلون هاي BAC كتابخانه ژنوم گاوي موسسه INRA فرانسه به عنوان پروب استفاده شد. كتابخانه اخير از سلول هاي فيبروبلاست جنين گاو هلشتاين نر تهيه شده است. در كتابخانه BAC ژنوم گاوي INRA تعداد 105984 كلون با اندازه متوسط Kb 120-115 وجود دارد كه معادل چهار برابر ژنوم گاو مي باشند. قطعات DNA ژنومي در وكتور pBeloBAC11 و در جايگاه برش آنزيم Hind III و در باكتري اشرشياكولي سويه DH10B قرار گرفته اند. اين سويه از باكتري اشرشياكولي براي تكثير كلون هاي حامل قطعات بزرگ كتابخانه هاي DNA به وسيله چند مرحله نوتركيبي ژنتيكي طراحي شده است. از مزاياي اين سويه مي توان به كارآيي زياد ترانسفورماسيون و نگهداري پلاسميدهاي بزرگ اشاره نمود. ژنوم سويه DH10B داراي bp 607/686/7 و به شكل حلقوي است (دورفی و همکاران، 2008). وكتور pBeloBAC11 يك وكتور كلونينگ براي باكتري اشرشياكولي و داراي طول bp 507/7 است كه براي تهيه كلون هاي BAC طراحي شده است. اين وكتور قابليت نگهداري و حمل قطعات بزرگ DNA ژنومي (تا kb 300) را دارا مي باشد. اين وكتور داراي ماركر انتخابي كلرامفنيكول بوده و در آن جايگاه هاي برش BamHI، SphI و HindIII درون ژن LacZ قرار داده شده اند. اتصال موفقيت آميز DNA ژنومي باعث فعال شدن ژن LacZ و در نتيجه عدم توليد آنزيم بتا- گالاكتوزيداز و عدم كاتاليز ماده Xgal/IPG در محيط كشت مي شود. در صورت دست نخورده بودن LacZ در محيط كشت، از كاتاليز Xgal/IPG رنگ آبي توليد مي شود. بنابراين كلوني هاي سفيد در محيط نشان دهنده وارد شدن موفقيت آميز قطعه DNA ژنومي و ترانسفورماسيون موفق است (شی، 2003).

3-2-1 شناسايي كلون هاي BAC حاوي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9
در پژوهش حاضر از روش نقشه يابي مقايسه اي براي مكان يابي ژن هاي مورد نظر استفاده شد. به دليل در دسترس بودن توالي كامل ژنوم گاو در NCBI ودر دسترس بودن كتابخانه ژنومي BAC گاوي در موسسه INRA فرانسه (CRB- Biological Resources Centre dedicated to livestock genomics –INRA, Jouy-en Josas, France) (جدول 3-2)، از كلون هاي BAC گاوي براي مكان يابي ژن هاي مورد مطالعه در هر چهار نژاد استفاده شد. كلون هاي BAC كه حاوي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9از روي سازه شماره 6.1 (Build 6.1) ژنوم گاوي كه حاصل گردآوري هاي UMD_3.1 (232) و Btau_4.6.1 (السیک و همکاران، 2009) مي باشد در NCBI MapViewer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview) جستجو و شناسايي شدند. در شکل هاي 3-1 تا 3-6 خلاصه مشخصات كلون هاي انتخاب شده نشان داده شده است. در كل تعداد شش BAC براي ژن هاي مورد نظر شناسايي و سفارش داده شدند (هر ژن دو BAC). مشخصات كامل كلون هاي BAC در جدول 3-3 آورده شده است.

جدول 3-2. مشخصات كتابخانه BAC ژنوم گاوي موسسه INRA فرانسه
كتابخانه
وكتور
سايت برشي
نوع سلول
نوع
گونه
نژاد
جنس
BAC گاوي
pBeloBAC11
HindIII
فيبروبلاست
ژنومي
Bos Taurus
هلشتاين
نر

جدول 3-3. مشخصات كامل كلون هاي BAC استفاده شده در پژوهش حاضر
BAC
طول Kb
BES (F)2
BES (R)1
نوع توالي انتهايي
كروموزوم
ژن حمل كننده
BtINRA-152G11
110
877
884
منحصر به فرد
BTA6
BMPR1B
BtINRA-745D07
123
790
707
منحصر به فرد
BTA6
BMPR1B
BtINRA-748C10
110
805
736
منحصر به فرد
BTAX
BMP15
BtINRA-320H10
135
937
876
منحصر به فرد
BTAX
BMP15
BtINRA-544F11
150
865
895
منحصر به فرد
BTA7
GDF9
BtINRA-444D09
106
852
851
منحصر به فرد
BTA7
GDF9

1BSE (R): BAC end sequence (reverse).
2BSE (F): BAC end sequence (forward).

3-2-1-1 ژن BMPR1B
براي اين ژن دو كلون BtINRA-152G11 با اندازه Kb 110 و BtINRA-745D07 با اندازه Kb 123 (شکل 3-1 و 3-2) شناسايي شدند كه به ترتيب بخش اعظم و طول كامل ژن BMPR1B را در بر مي گرفتند (جدول 3-3). هر دو كلون انتخاب شده براي ژن BMPR1B داراي توالي هاي انتهايي منحصر به فرد بودند كه نشان دهنده دقت بسيار زياد در قرار دهي آن ها روي توالي ژنومي گاو مي باشد. علي رقم اينكه هر دو كلون BAC انتخاب شده ژن مورد نظر را مي پوشاندند، براي حصول اطمينان و افزايش صحت مكان يابي، هر دو كلون سفارش داده شده و مكان يابي شدند.

شکل 3-1. اطلاعات كلون BtINRA-152G11استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن BMPR1B. Assembly: نوع گرد آوري توالي ژنومي گاو، Asm. unit: شماره گرد آوري، Chr: كروموزوم، Seq. ID: شماره دسترسي توالي كروموزوم شماره 6 گاو در NCBI، Start: شماره باز شروع، End: شماره باز پايان، Length: طول قطعه كلون شده، Method: روش قرار دهي توالي كلون شده روي توالي ژنومي گاو را نشان مي دهد كه با روش قرار دهي توالي انتهايي (end-seq) صورت پذيرفته است، Conc. (Concordant): تطابق، Confidence: اطمينان از صحت قرار دهي كلون مورد نظر روي توالي ژنومي گاو (سطح اطمينان Unique يا منحصر به فرد نشان دهنده دقت بسيار زياد در قرار دهي كلون مي باشد).

شکل 3-2. اطلاعات كلون BtINRA-745D07 استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن BMPR1B (توضيحات مانند شکل 3-1).

3-2-1-2 ژن BMP15
براي اين ژن هيچ كلون BAC كه به طور كامل ژن مورد نظر را بپوشاند يافت نشد. اما دو كلون BtINRA-748C10 با اندازه Kb 110 و BtINRA-320H10 با اندازه Kb 135 (شکل هاي 3-3 و 3-4) به ترتيب قبل و بعد از ژن مورد نظر شناسايي شدند (جدول 3-3). اين دو كلون روي يك Scaffold قرار گرفته اند. بنابراين اگر همزمان اين دو كلون مكان يابي شوند به اين معني است كه ژن BMP15 بين آن ها مكان يابي شده است. براي مكان يابي ژن BMP15 اين دو BAC با هم مخلوط شده و در يك آزمايش FISH مورد استفاده قرار گرفتند.

شکل 3-3. اطلاعات كلون BtINRA-320H10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن BMP15 (توضيحات مانند شکل 3-1).

3-2-1-3 ژن GDF9
براي اين ژن نيز همانند ژن BMP15 هيچ BAC كه به طور كامل ژن مورد نظر را بپوشاند يافت نشد. اما دو كلون BtINRA-444D9 با طول Kb 106 و BtINRA-544F11 با طول Kb 150 (شکل هاي 3-5 و 3-6) به ترتيب در قبل و بعد از ژن GDF9 شناسايي شدند (جدول 3-3) كه خوشبختانه روي يك كنتيگ (ctg INRA 1486) قرار گرفته اند. بنابراين مكان يابي هر يك از اين كلون ها نشان دهنده موقعيت فيزيكي ژن GDF9 مي باشد. در پژوهش حاضر براي حصول اطمينان كافي هر دو كلون نامبرده در آزمايش FISH استفاده شدند.

شکل 3-4. اطلاعات كلون BtINRA-748C10 استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن BMP15 (توضيحات مانند شکل 3-1).

3-3 كشت باكتري هاي حاوي كلون هاي BAC و استخراج DNA
كلون هاي BAC انتخاب شده از موسسه INRA فرانسه سفارش داده شدند. كلون هاي BAC حاوي ژن هاي BMPR1B، BMP15 و GDF9 به صورت كلوني هايي روي محيط كشت LB- آگار- كلرامفنيكول (Luria Broth-Agar-Chloramphenicol) در پتري ديش دريافت شدند. در كتابخانه BAC موسسه INRA قطعات DNA در وكتور pBeloBAC11 باكتري اشرشياكولي سويه DH10B قرار داده شده اند. وكتور pBeloBAC11 قابليت حمل قطعات تا يك ميليون جفت باز را دارد (شی، 2003). اين سويه براي تكثير كلون هاي كتابخانه هاي حاوي قطعات بزرگ DNA طراحي شده است كه از مزيت هاي آن مي توان به كارآيي زياد ترانسفورماسيون، توانايي جذب و نگهداري پلاسميدهاي بزرگ و غربالگري كلوني ها با استفاده از LacZ اشاره نمود (دورفی و همکاران، 2008). كشت باكتري ها با توجه به دستورالعمل موسسه CHORI (Children’s Hospital Oakland Research Institute) و با اندكي تغييرات انجام شد. ابتدا از هر كلوني يك كشت مايع LB به عنوان استوك تهيه شد كه حاوي ml 3 محيط LB و µg/ml 25 كلرامفنيكول بود. اين محيط بعد از 4-3 ساعت از رنگ روشن به سمت كدر تغيير مي يابد و در اين حالت مي توان از آن براي تهيه محيط هاي جديد براي استخراج DNA استفاده نمود.

شکل 3-5. اطلاعات كلون BtINRA-544F11 استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن GDF9 (توضيحات مانند شکل 3-1).

كشت مايع استوك را مي توان در يخچال معمولي تا 15 روز و در دماي 80- درجه سانتيگراد تا سال ها نگهداري و استفاده كرد يك روز قبل از استخراج DNA، كشت ها با تركيب ml 5 محيط LB، µg/ml 25 كلرامفنيكول و lµ 200-150 از محيط اوليه (استوك) تهيه شده و به مدت يك شب در دماي 37 درجه سانتيگراد در انكوباتور شيكر دار (Shacker) كشت داده شدند. در هر كشت از يك لوله حاوي محيط كشت ولي فاقد BAC به عنوان كنترل استفاده شد. كلرامفنيكول براي وكتور pBeloBAC11 به صورت نشانگر انتخابي عمل مي كند و بنابراين مشاهده سلول هاي كشت شده (محيط بعد از يك شب از رنگ روشن به كدر تغيير مي يابد) نشان دهنده تكثير خوب باكتري هاست. محيط كشت LB يك محيط مايع و مناسب براي تكثير باكتري E.coli است كه با اهداف كلونينگ، تكثير پلاسميد و بيان پروتئين ها استفاده مي شود.

شکل 3-6. اطلاعات كلون BtINRA-444D9 استفاده شده به عنوان پروب در مكان يابي ژن GDF9 (توضيحات مانند شکل 3-1).

استخراج DNA از كلون هاي BAC نيز طبق دستورالعمل پيشنهادي موسسه CHORI با اندكي تغييرات انجام شد. در اين دستورالعمل DNA به روش Alkaline Lysis و با استفاده از سه محلول P1، P2 و P3 استخراج مي شود (جدول 3-4). در پژوهش حاضر RNase را برخلاف دستورالعمل به محلول P3 اضافه نكرده و در انتهاي مراحل استخراج، DNA را با RNase تيمار نموديم. DNA استخراج شده در محلول يك برابر TE حل شده و تا زمان استفاده در فريزر نگهداري شدند. پس از استخراج براي اطمينان از روند

پایان نامه
Previous Entries منابع و ماخذ پایان نامه ایمن سازی، گروه کنترل Next Entries منابع و ماخذ پایان نامه كروموزوم، تهيه، باندينگ