منابع مقاله درباره گروه کنترل

دانلود پایان نامه ارشد

استئوژنیک و غیر استئوژنیک ابتدا میزان پروتئین نمونه های بدست آمده از استخراج سلولی، با استفاده از روش لاوری و با استفاده از سرم آلبومین گاوی (BSA) به عنوان استاندارد اندازه گیری شد. سپس برای اندازه گیری فعالیت آنزیمی مقداری از نمونه با غلظت مساوی از پروتئین استفاده شد.

2-8-2-1 تهیه‌ی نمودار استاندارد برای آزمایش لاوری:
1- در 6 لوله‌ی آزمایش به ترتیب 0، 100، 200، 300، 400، 500 میکرولیتر از محلول 91BSA (رجوع شود به 5-12) ریخته شد و حجم نهایی هرکدام با آب دو بار تقطير به 500 میکرولیتر رسید.
2- به هر لوله‌ی آزمایش 5 میلی لیتر ازمحلول کمپلکس (رجوع شود به 5-13) اضافه شد و سپس معرف فولین سیکالتیو که به صورت یک به یک با آب مقطر رقیق شده به آن اضافه گردید و به مدت 15 دقیقه در تاریکی گذاشته شد.
3- بعد از كاليبره کردن اسپکتروفتومتر، جذب هر کدام از نمونه‌ها در طول موج 750 نانومتر خوانده شد و گراف ستاندارد آن تهیه گردید (2-15).

2-15 :نمودار استاندارد لاوری

2-8-2-2 ترانسآمینازها
ترانس آمینازها، آنزیمهایی هستند که عامل آمین اسیدهای آمینه را به اسیدهای آلفا کتونی منتقل میسازند. از جمله این آنزیمها آلانین آمینوترانسآمیناز (ALAT) (شکل2-17) و آسپارتات آمینوترانسآمیناز (ASAT) (شکل2-16) را میتوان نام برد. سیستم سنجش اندازهگیری فعالیت آمینوترانسفرازها دارای دو اسیدآمینه و دو اکسواسید میباشد. به دلیل این که روش راحتی برای سنجش اسیدهای آمینه وجود ندارد، تشکیل یا مصرف اکسواسیدها سنجش میشود. اکسواسیدهای تشکیل شده در این واکنش به طور غیر مستقیم توسط احیای آنزیمی به هیدروکسی اسیدهای مرتبط مورد سنجش قرار میگیرند. تغییر همزمان غلظت NADH از طریق اسپکتوفتومتری نشان داده میشود. بنابراین 2- اکسوگلوتارات (تشکیل شده در واکنش AST) در حضور آنزیم مالات دهیدروژنازها (MD) به مالات احیا می شود (104).

شکل 2-16: واکنش کاتالیز شده توسط آنزیم آسپارتات آمینوترانسآمیناز

شکل2-17 : واکنش کاتالیز شده توسط آنزیم آلانین ترانس آمیناز
مراحل انجام تست آنزیم آسپارتات ترانس آمیناز:
در سنجش آنزیم آسپارتات ترانس آمیناز و آلانین ترانس آمیناز از کیت شرکت پارس آزمون (شکل2-18) استفاده شد. به منظور صفر نمودن دستگاه اسپکتوفتومتر (مدلT80+ ساخت شرکت PG instrument کشور انگلستان) از آب مقطر استفاده شد.
1) 100 میکرولیتر از نمونه سلولی استئوژنیک و غیر استئوژنیک با 1000 میکرولیتر محلول معرف 1 مخلوط نموده و 5 دقیقه در دمای 37 درجه انکوبه شد.
2) سپس 250 میکرولیتر از محلول معرف 2 به کمپلکس قبلی اضافه و بعد از مخلوط نمودن، جذب نوری در طول موج 340 نانومتر اندازه گیری شد.
3) فعالیت آنزیمی نمونه ها با استفاده از فرمول منحنی استاندارد (شکل 2-20) به ازای تبدیل یک میکرومول+H+ NADH به NAD+ در یک دقیقه بر لیتر محاسبه و بصورت IU/L گزارش شد.

شکل2-18 :کیت های آنزیمی ALT، AST و ALP

2-8-2-3 آنزیم لاکتات دهیدروژناز
در سنجش آنزیم لاکتات دهیدروژناز از کیت تجاری شرکت پارس آزمون استفاده شد.آنزیم لاکتات دهیدروژناز (LDH) دارای پنج ایزوآنزیم مختلف است و عمل آن تسریع واکنش های تبدیل L- لاکتات و پیروات به یگدیگر است (شکل 2-19).

شکل2-19: واکنش کاتالیز شده توسط آنزیم لاکتات دهیدروژناز
مراحل انجام تست آنزیم لاکتات دهیدروژناز:
1) به منظور صفر نمودن دستگاه اسپکتوفتومتر (مدلT80+ ساخت شرکت PG instrument کشور انگلستان) از آب مقطر استفاده شد.
2) 10 میکرولیتر از نمونه سلولی استئوژنیک و غیر استئوژنیک با 1000 میکرولیتر محلول معرف 1 مخلوط نموده و 5 دقیقه در دمای 37 درجه انکوبه شد.
3) سپس 250 میکرولیتر از محلول معرف 2 به کمپلکس قبلی اضافه و بعد از مخلوط نمودن جذب نوری در طول موج 340 نانومتر قرائت شد.
4) غلظت نمونه ها پس از محاسبه بصورت IU/L گزارش شد.
رسم منحنی استاندارد برای تست های آنزیمی اکسیدوردوکتاز
جهت رسم منحنی استاندارد از محلول شماره 2 کیت آنزیمی آسپارتات ترانس آمیناز (شرکت پارس آزمون) که حاوی سوبسترا NADH+H+ استفاده شد. غلظت های مختلف 12/3، 25/6، 5/12، 25، 50، 100، 200 و 400 میکرولیتر این محلول با آب مقطر به حجم 1000 میکرولیتر رسانده شد و سپس در طول موج 340 نانومتر خوانده و منحنی استاندارد با فرمول خطی Y=0/0039X+ 0/0019 و R2=0/0999 رسم گردید.

شکل 2-20: منحنی استاندارد آنزیم های اکسیدوردوکتاز
2-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز
آلكالين فسفاتاز آنزيمي از دسته هيدرولازها ميباشد و اين آنزيم به اين دليل آلكالين نام گرفته است كه در محيط قليايي فعاليتش زياد ميشود . اين آنزيم قليايي در بافتهاي مختلف بدن به نسبتهاي متفاوت منتشر ميشود ولي در بافتهاي استخوان، كبد، روده و كليهها، ميزان فعاليت اين آنزيم بسيار بالا است و آلكالين فسفاتاز يك ماركر براي فعاليت استئوژنيك ميباشد كه براي استخواني شدن لازم میباشد. از انواع مختلف استرهاي فسفريك به عنوان سوبستراي آنزيم استفاده میشود، ولي در اندازه گیریهای حاضر از پارانيتروفنل به عنوان سوبستراي آنزيم استفاده شد. پارانيتروفنل فسفات بيرنگ در حضور آلكالين فسفاتاز و در pH قليايي به پارانيتروفنوكسايد زرد رنگ تبديل شد كه شدت رنگ حاصل با فعاليت آنزيم نسبت مستقيم دارد (شکل 2-21) (8).

P-Nitrophenylphosphate+ H_2 O□(→┴ALP ) Phosphate + P-Nitrophenol

شکل 2-21: واکنش کاتالیز شده توسط آلکالین فسفاتاز
مراحل انجام اندازهگیری آنزیم آلکالین فسفاتاز
جهت اندازه گیری آنزیم آلکالین فسفاتاز از کیت 2 محلولهی پارس آزمون استفاده و بر اساس دستورالعمل کیت تجاری بصورت زیر عمل گردید.
1) جهت صفر نمودن دستگاه اسپکتوفتومتر (مدلT80+ ساخت شرکت PG instrument کشور انگلستان) از آب مقطر استفاده شد.
2) 20 میکرولیتر از نمونه سلولی استئوژنیک و غیر استئوژنیک با 1000 میکرولیتر محلول معرف 1 مخلوط و 1 دقیقه در 37 درجه انکوبه شد.
3) سپس 250 میکرولیتر از محلول معرف 2 به 250 میکرولیتر از کمپلکس قبلی اضافه و مقدار جذب نوری با دستگاه اسپکتوفتومتر در طول موج 405 نانومتر قرائت شد.
4) غلظت نمونه ها پس از محاسبه بصورت IU/L گزارش شد.
2-8-3 سنجش ميزان رسوب ماتريكس معدني به كمك استخراج رنگ آليزارين رد در سلول های استئوژنیک
رنگ آميزي آليزارين رد جهت تشخيص كيفي رسوبات غني از كلسيم در سلول هاي كشت شده به كار مي رود. اين رنگ مي تواند از سلول هاي رنگ شده استخراج شود و مورد ارزيابي كمي نيز قرار گيرد. در اين روش رنگ آليزارين رد به كمك اسيداستيك استخراج مي گردد و سپس توسط هيدروكسيد آمونيوم خنثي و در نهايت با روش رنگ سنجي، ميزان جذب اين رنگ معلوم مي گردد (105).
سلول هاي پاساژ سوم، به تعداد50 هزار سلول در هر چاهك پليت 12 خانه قرار گرفته و پس از اینکه سلول ها تا حدود 90% كف چاهك را اشغال كردند، در 2 گروه تیمار (6 نانو و میکروگرم بر میلی لیتر) و کنترل توسط محیط تمایزی (رجوع شود به 5-4) تیمار شدند. تعويض محيط هر سه روز يكبار انجام شد اين تست به طو ر جداگانه براي مدت 5، 10، 15 و 21 روز انجام شد و سپس با استفاده از محلول رنگ آليزارين رد ماتریکس رنگ آمیزی شد (برای مراحل رنگ آمیزی رجوع شود به بخش 2-3-1)پس از رنگ آمیزی رنگ آلیزارین طی پروتوکل مشروحه در زیر استخراج شد.
2-8-3-1 رسم منحنی استاندارد برای رنگ آمیزی آلیزارین رد:
1)رقیق سازی محلول آلیزارین رد 40 Mm (رجوع شود به 5-5) به نسبت غلظت 1 به 9 در بافر ARS (رجوع شود به 5-11) (50 میکرولیتر آلیزارین رد+950 میکرولیتر بافر ARS). غلظت استوک حاصله 2Mm بود.
3)غلظت های مشخص آلیزارین رد (شکل 2-22) با رقیق کردن استوک 2Mm بوسیله بافر ARS حاصل شد.
Blank
31/3 µm
62/5 µm
125 µm
250 µm
500 µm
1Mm
2Mm
شکل 2-22: غلظت های مشخص مورد استفاده در رسم منحنی استاندارد
4) 100 میکرولیتر از هر نمونه را به یک چاهک پلیت 96 خانه منتقل کرده و جذب نمونه توسط دستگاه ELISA Reader در طول موج 450 نانومتر قرائت گردید و نمودار استاندارد (شکل 2-23) رسم گردید.

شکل 2-23: نمودار غلظت های مشخص از رنگ آلیزارین رد
2-8-3-2 بررسی رسوب ماتریکس استخوانی در نمونه های تیمار شده:
1)سلولهای استئوژنیک و غیراستئوژنیک دوبار با PBS- شستشو داده شد.
2)سلول ها به مدت 15 دقیقه با فرمالدهید 10 درصد در دمای اتاق فیکس شد.
3)پس از فیکس شدن سلول ها به مدت 20 دقیقه با رنگ آلیزارین رد در دمای اتاق قرار گرفت.
4)پس از این مرحله سلول ها چندبار با آب مقطر شستشو داده شده و هر بار برای خروج رنگ اضافی بر روی شیکر قرار گرفت. سلولهای استئوژنیک توسط اسکالپر از کف ظرف جدا شده و با وزن کردن مقادیر مساوی در لوله اپندورف ریخته شد.
5)سپس 800 میکرولیتر از اسید استیک 10 درصد به آنها اضافه شد و 30 دقیقه در دمای اتاق بر روی شیکر قرار گرفت.
6) سپس محلول رویی سلول ها که حاوی رنگ آلیزارین استخراج شده است را به اپندورف منتقل گردید.
7) 500 میکرولیتر از mineral oil بر روی آنها قرار گرفت.
8) اپندورف ها به مدت 10 دقیقه در دمای 85 درجه سانتی گراد قرار گرفت.
9) پس از آن اپندورف ها به مدت 5 دقیقه بر روی یخ قرار گرفت.
10)سپس سانتریفیوژ در دور 16000g به مدت 20 دقیقه انجام گردید.
11)پس از سانتریفیوژ mineral oil از درون اپندورف ها تخلیه شده و 200 میکرولیتر از هیدروکسید آمونیوم 10 درصد به 500 میکرولیتر از محلول درون اپندورف ها اضافه گردید.
12) سپس جذب آن به کمک دستگاه ELISA Reader در 450 نانومتر قرائت گردید.
13) میزان نمونه ها از طریق فرمول خطی Y=0/099X+0/1014 با R2=0/099 محاسبه شد، در این فرمول Y میزان جذب و X غلظت نمونه میباشد.
2-8-4 بررسی الکترولیت ها (کلسیم، سدیم و پتاسیم)
2-8-4-1 بررسي ميزان كلسيم داخل سلولي با استفاده از كيت كلسيم به روش رنگ سنجي
تغييرات در غلظت كلسيم در تنظيم بسياري از پروسه هاي سلول هاي يوكاريوتي، نظير مسيرهاي متابوليكي، رشد سلول، تمايز و مرگ سلولي لازم و ضروري است. كلسيم با كرزول فتالئين ايجاد كمپلكسي مي نمايد كه در محيط قليايي، ارغواني رنگ است و شدت رنگ حاصله متناسب با غلظت كلسيم مي باشد.
Calcium+ Cresolphthalein Complexone

در سنجش میزان کلسیم از كيت تجاری پارس آزمون استفاده شد:
سلول های مزانشیم (غیر تمایزیافته) شاهد و تیمار شده با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک پس از طی مراحل ترپسین زنی (مراجعه شود به بخش 2-2-1) از کف ظروف کشت جدا شدند و طی مراحل مشروحه در زیر محتوی سلول آنها استخراج شد.
1- سلول ها پس از سانتریفیوژ سه مرتبه با بافر Tris-Hcl-Nacl (رجوع شود به 5-9) شست و شو و در 12000 دور(rpm) سانتریفوژ شد. پس از سانتریفیوژ محیط رویی کشیده شد.
2- رسوب حاوی نمونههای سلولی در حضور نيتروژن مايع ساييده شد.
3- 50 میکرو لیتر از بافر استخراج Tris-Hcl (رجوع شود به 5-10) به نمونه‌ها اضافه شد.
4- سپس نمونه‌ها در 12000 دور (rpm) به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شده؛ و محلول رويي كه حاوي محتوی داخل سلول بود، جدا و برای بررسی های بیوشیمیائی ( تست کلسیم) استفاده شد.
2-8-4-1-2 جهت انجام تست کلسیم در سلول های تمایز یافته (استئوبلاست) مراحل زیر انجام شد:
1) سلول هاي بنيادي مزانشيم پس از پاساژ سوم در پليت هاي 12 خانه با تراكم 50000 سلول قرار گرفت و بجز در گروه کنترل، تیمار سلول ها با 6 نانو و میکروگرم بر میلی لیتر اسید بوریک انجام گردید، سپس تست کلسیم به شرح زیر پس از 5، 10، 15 و 21 روز تیمار انجام شد.
2) ابتدا سلول ها در گروههای جداگانه پس از دوبار شست و شو با بافر Tris-Hcl-Nacl (رجوع شود به 5-9) به کمک اسکالپر از پلیت ها جداسازی شد و پس از توزین، مقدار مساوی از هر نمونه در اپندورف قرار گرفتند سپس به نمونه ها 50 میکرولیتر بافر استخراج کلسیم (رجوع شود به 5-14) اضافه شد.
3) نمونه

پایان نامه
Previous Entries منبع مقاله درمورد عرفان و تصوف، زبان قرآن Next Entries منبع مقاله درمورد اينكه، "، وليّ