منابع مقاله درباره مورفولوژی، مواد غذایی، نفوذپذیری

دانلود پایان نامه ارشد

اتاق فيكس شد.
3- سپس رنگ آميزي سلول‌ها‌ با رنگ آليزارين رد 40 میلی مولار (رجوع شود به 5-5) (شکل2-4) به مدت 10 دقيقه انجام شد.
4- سلول‌ها‌ توسط آب مقطر، به منظور خروج رنگ اضافي شست و شو شد.
5- مشاهده با ميكروسكوپ نوري انجام شد به طوري كه ماتريكس استخواني به رنگ قرمز قابل مشاهده بود (شکل 2-5).

شکل 2-4: ساختمان شیمیائی آلیزارین رد ( سایت www. Wikipedia.or)

شکل 2-5: ماتریکس استخوانی رنگ آمیزی شده با آلیزارین رد (اقتباس از پایان نامه خانم مژگان براتی).

2-4 بررسی توان زیستي سلولها (دوز فايندينگ)
2-4-1 رنگ آمیزی تریپان بلو (شکل 2-6)
سلولهای مرده و زنده میتوانند توسط رنگآمیزیهای متفاوت از هم متمایز شوند. هسته سلولها با غشا پلاسمایی آسیب دیده به دلیل نفوذپذیر شدن رنگ میشوند در حالی که سلولهای سالم به علت نفوذپذیری غشا، رنگ نمیشوند (98).

شکل 2-6: ساختار تریپان بلو (سایت www. Wikipedia.or).

الف) مراحل انجام رنگ آمیزی تریپان بلو
1- در ابتدا 50000 سلول در هر ویال پلیت 24 خانه به مدت 24 ساعت و به منظور اتصال سلولها به کف این پلیت ها کشت شد.
2- محیط رویی سلولها خارج و محیط حاوی 15 درصد FBS حاوی غلظت های 6/0، 3 و 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلی لیتر اسید بوریک به ترتیب در هر خانه پلیت 24 خانه اضافه شد.
3- سپس پلیت به انکوباتور انتقال یافت.
4- بعد از سپری شدن 12 ، 24 و 36 ساعت خانه های پلیت مربوطه به هر زمان تریپسین زنی شدند.
5- با اضافه کردن محیط کشت کامل تریپسین غیر فعال شده و به نسبت 1:1 تریپان بلو 4/0 درصد (رجوع شود به 5-9) به هر خانه اضافه شد.
6- پلیت به مدت 2 دقیقه در انکوباتور 37 درجه انکوبه شد.
7- با استفاده از لام نئوبار (خانه های متعلق به شمارش گلبولهای سفید) سلولهای آبی رنگ (سلولهای مرده ) و سلولهای بیرنگ (سلولهاي زنده) شمارش شد.
8- با استفاده از فرمول زير، درصد حیات سلولها در مورد هر غلظت در زمانهای 12، 24و 36 ساعت محاسبه گردید.

(زنده های سلول تعداد)/(سلول کل تعداد)×100 درصد توانایی زیستی

2-4-2 سنجش تترازولیوم (MTT86)

شکل 2-7: تغییر رنگ MTT بر اثر آنزیمهای میتوکندریایی و تولید بلور فورمازان (www.biotek.com).

در روش رنگ سنجی MTT ، آنزیم سوکسینات دهیدروژناز موجود در میتوکندری توانایی احیای رنگ زرد دی‌متیل تیازول دی‌فنیل تترازولیوم را به بلورهای ارغوانی و نامحلول فورمازون دارد (شکل 2-7 )(99).
2-4-2-1 مراحل انجام سنجش MTT (غیر استئوژنیک)
1- سلولها به تعداد مساوی (15000 سلول) و به مدت 24 ساعت در هر خانه پلیت 96 خانه در شرايط استاندارد در انكوباتور کشت داده شد.
2- بعد از 24 ساعت، محیط رویی خارج و هر ویال دو بار توسط PBS- شسته شد. سپس در هر پلیت 100 میکرولیتر محیط کشت حاوی غلظت های 6/0، 3 و 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلی لیتر اسید بوریک به ترتیب به هر خانه پلیت 96 خانه اضافه شد.
3- بعد از سپری شدن زمان تیمار، محیط رویی سلولها خارج و پس از 3-2 بار شست و شو با بافر PBS- به هرخانه پليت 100 میکرولیتر DMEM فاقد سرم و 10 میکرولیتر محلول MTT(رجوع شود به 5-8) اضافه و به مدت 4 ساعت در انکوباتور37 قرار داده شد.
4- بعد از سپری شدن این مدت محیط رویی هر خانه تخليه و سپس به منظورحل شدن بلور های فورمازان، 100 میکرولیتر DMSO87 به آنها اضافه شد و به مدت نیم ساعت در دمای اتاق و تاریکی قرار داده شد.
5- بعد از گذشتن این مدت محتوی هر خانه از پلیت 96 خانه به خانه های جدید منتقل شد.
6- جذب مربوط به هر خانه در طیف 505 نانو متر با استفاده از ELISA-reader (مدل Elisa Reader Medical ساخت شرکت SCO GmbH کشور آلمان) خوانده شد (شکل 2-8) (100).

شکل 2-8: دستگاه ELISA READER

2-4-2-2 ترسیم منحنی استاندارد با استفاده از سنجش تترازولیوم
1)ابتدا تعداد 0 ، 1250، 2500، 5000، 10000و 20000 سلول به ازای هر خانه پلیت 96 خانه به مدت 24 ساعت جهت چسبیدن سلولها به کف خانهها در شرايط استاندارد در انكوباتور کشت شد.
2)بعد از 24 ساعت، مراحل 7-5 سنجش تترازولیم در مورد خانههای پلیت تکرار شد.
نموداراستاندارد با توجه به تعداد سلولها و میزان جذب هر خانه ترسیم شد.
3)با استفاده از منحني استاندارد (شکل 2-9) و فرمول حاصله تعداد سلولهاي زنده در زمان هاي تیمار غیر تمایزی محاسبه شد.

شکل 2-9: نمودار استاندارد MTT

2-4-2-3 مراحل انجام تست MTT استئوژنیک:
1)در هر پلیت 12 خانه تعداد 15000 سلول در هر چاهک ریخته شد.
2)پس از طی 24 ساعت و چسبیدن سلول های مزانشیمی به کف پلیت 12 خانه، محیط رویی سلول ها تخلیه و محیط استئوژنیک حاوی دوزهای0، 6 نانو و میکروگرم بر میلی لیتر از اسید بوریک اضافه شد.
3) محیط سلول ها دوبار در هفته تعویض شد.
4)پس از طی 5، 10، 15 و 21 روز، محیط رویی سلولها خارج و پس از 3-2 بار شست و شو با بافر PBS- کلیه مراحل انجام گرفته جهت انجام سنجش MTT برای سلولهای غیر استئوژنیک نیز برای سلولهای تمایز یافته انجام گرفت.

2-5 انتخاب دوز مورد نظر:
پس از انجام تستهای تریپانبلو و MTT و مطالعهی آنالیز دادهها در مرحلهی دوزیابی، دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلیلیتر اسید بوریک جهت ادامه مطالعه انتخاب شد.

2-6 بررسی توان تکثیری سلولهای بنیادی مزانشیم :
توانایی تشکیل کلونی(CFA)88
از ویژگیهای سلولهای بنیادی مزانشیمی(MSCs) توانایی تشکیل کلونی حتی در کشت اولیه است. حدود یک سوم از کلونیهای منفرد که هر کدام از یک سلول مشتق شدهاند از لحاظ پتانسیل تمایزی، هتروژن و چند توان بوده و قادرند به سه رده استخوانی، غضروفی و چربی تمایز یابند در حالی که بقیه تنها پتانسیل دو ردهای (استخوان و غضروف) یا تک ردهای (استخوان) دارند. کلونیهایی که از یک سلول MSCs تشکیل میشوند اندازههای مختلفی داشته و از نظر توانایی تمایز، پتانسیلهای متفاوتی را نشان میدهند (101) .
2-6-1 سنجش توانایی کلونیزایی:
سلولهای مغز استخوان پس از جداسازی بوسیله لام نئوبار مورد شمارش قرار گرفتند و به تعداد 104×5 سلول در پتری دیش 3 سانتی متری کشت شدند. 24 ساعت بعد محیط سلولها تخلیه و با محیط حاوی 15 درصد FBS و غلظت های 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلی لیتر اسید بوریک جایگزین شد. نمونه کنترل فاقد اسید بوریک بود. سپس برای بررسی، کلونی ایجاد شده در روز هفتم با کریستال ویولت 89رنگآمیزی شدند (شکل 2-10). تعداد کلونیها مورد شمارش قرار گرفته و قطر کلونیها نیز به کمک نرم افزار موتیک اندازهگیری شد.

شکل 2-10: توانایی تشکیل کلونی (CFA)

رنگآمیزی کریستال ویولت:
کریستال ویولت (شکل 2-11)، رنگی مونوکروماتیک است که هسته را به رنگ بنفش تیره و هستک را به رنگ بنفش روشن در میآورد. برای رنگآمیزی ابتدا سلولها دو بار با -PBS شسته و سپس با رنگ کریستال ویولت 5/0 درصد (رجوع شود به 5-7) به مدت 1 دقیقه رنگآمیزی شدند (102).

شکل 2-11: ساختمان کریستال ویولت (سایت www. Wikipedia.or)

2-6-2 محاسبه تعداد دو برابر شدگی جمعیتی(PDN)90:
PDN، عدد میانگینی است که برای جمعیت کل به کار میرود و به عنوان نتیجهای از سرعتهای مختلف تقسیم میباشد. اندازهگیری PDN برای تعیین پاسخ سلولها به شرایط کشت محرک یا بازدارنده از قبیل تغییر در غلظت مواد غذایی، داروها، سموم و هورمونها میباشد (103).
روش انجام تست PDN:
در پلیت 12 خانه تعداد 12 هزار سلول (N0= 12000) ریخته و پس از 24 ساعت و چسبیدن سلولهای مزانشیمی به کف پلیت محیط سلولها با غلظت های 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلی لیتر اسید بوریک در زمانهای 1، 3 و 6 روز جایگزین گردیده و در طی این زمانها سلولها تریپسینه و مورد شمارش قرار گرفته و از طریق فرمول زیر میزان دو برابر شدن جمعیت سلولی محاسبه گردید (102).
PDN = (log N / N0 × 3/31)

در این فرمول N0=12000 و N تعداد سلولهای پس از شمارش در زمانهای نام برده در نظر گرفته شد.

2-7 بررسي تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آميزي فلوروسنت
جهت بررسی مورفولوژی هسته از رنگ‌آمیزی کروماتین با هوخست و از آکریدین اورنژ برای بررسی مورفولوژی سیتوپلاسم استفاده شد.
برای بررسی مرفولوژی سلولهای مزانشیم، پس از اينكه تعداد 20000 سلول در هر خانه پليت 12 خانه به مدت 24 ساعت (جهت چسبيدن سلولها در شرايط استاندارد) در انكوباتور کشت داده شد؛ سلولها به مدت 36 ساعت (بیشترین مدت زمانی که در آنالیز توانائی حیات، سلولها مورد بررسی قرار گرفته و در این زمان بیشترین تاثیر مسمومیت دیده شد) توسط غلظتهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلی لیتر اسید بوریک تيمار و مراحل رنگ آمیزی جهت بررسی موفولوژی به شرح زیر انجام شد.
برای بررسی مرفولوژی سلولهای استئوبلاست، پس از اینکه سلولهای مزانشیم به تعداد 10000 در پلیت 12 خانه و به مدت 24 ساعت (جهت چسبیدن سلول ها در شرایط استاندارد) در انکوباتور کشت داده شد، سلولها با محیط تمایزی (رجوع شود به 5-4) حاوی دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلی لیتر اسید بوریک به مدت 5، 10، 15 و 21 روز تیمار داده شد. محیط سلول ها هر سه روز یکبار تعویض گردید و پس از مدت زمان تیمار مراحل رنگ آمیزی جهت بررسی موفولوژی به شرح زیر انجام شد.

مراحل رنگ آميزي با هوخست و آكريدين اوران‍ژ:
1- محیط رویی سلول‌های استئوژنیک و غیر استئوژنیک کشت شده درخانههاي پليت 12 خانه تخلیه شد.
2- محيط كشت باقيمانده در خانهها به وسيله -PBS شسته شد.
3- سپس سلولهاي كشت شده در هر خانه با 10 ميكروليتر محلول Hoechst 50µg/ml (شکل 2-13) (رجوع شود به 5-15) در بافر فسفات به مدت 3 دقيقه در شرايط تاريكي رنگ آميزي شد.
4- سلول‌ها با بافر PBS- شسته شدند.
5- در این مرحله جهت بررسی تغییرات مورفولوژیکی هسته، نمونه‌ها توسط میکروسکوپ فلورسانس المپوس (مدل PX41 ساخت کشور ژاپن) مجهز به دوربین (مدل DP71) مورد بررسی و عکس برداری قرار گرفتند (جهت جلوگيري از خشك شدن سلولهاي كشت شده در خانههاي پليت به هر خانه 500 میکرولیتر بافر فسفات اضافه گرديد).
6- جهت رویت دقیق محدوده‌ی سیتوپلاسم سلول‌ها، رنگ آمیزی توسط 10 میکرولیتر محلول µg/ml 5 آکریدین اورانژ (AO) (شکل 2-14) (رجوع شود به 15-5) به مدت 2 دقیقه در شرایط تاریکی انجام شد.
7- سلول‌ها با بافر -PBS شسته شدند.
8- سلول‌ها توسط میکروسکوپ فلورسانس المپوس (مدل PX41 ساخت کشور ژاپن) مجهز به دوربین (مدل DP71) مورد بررسی و عکس برداری قرار گرفتند (شکل 2-12) (102).

شکل 2-12: میکروسکوپ فلورسانس المپوس

شکل 2-13: ساختار رنگ فلورسنس هوخست

شکل 2-14: ساختار رنگ فلورسنت آکریدین اورنژ
2-8 آزمونهای بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی
2-8-1 تیمار و استخراج عصاره سلولی
1- نمونه‌های شاهد و تیمار شده سلولهای مزانشیم با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک پس از طی مراحل ترپسین زنی (مراجعه شود به بخش 2-2-1) از کف ظروف کشت جدا و طی مراحل مشروحه در زیر محتوی سلول آنها استخراج شد.
سلولهای شاهد و تیمار شده استئوژنیک با دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلی لیتر اسید بوریک توسط بافر Tris-Hcl-Nacl(رجوع شود به 5-9) شستشو داده شده و پس از تراشیده شدن با اسکالپر، با بافر Tris-Hcl (رجوع شود به 5-10) استخراج و در 12000 دور(rpm) سانتریفوژ شد. پس از سانتریفیوژ محیط رویی کشیده شد.
2- رسوب حاوی نمونههای سلولی در حضور نيتروژن مايع ساييده شد.
3- مجددا 100 میکرو لیتر از بافر استخراج قبلی به نمونه‌ها اضافه شد.
4- سپس نمونه‌ها در 12000 دور (rpm) به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شده؛ و محلول رويي كه حاوي محتوی داخل سلول بود به همراه بافر استخراج که قبلا استفاده شده بود برای بررسی های بیوشیمیائی استفاده شد.

2-8-2 بررسی فعالیت آنزیمها:
جهت بررسی میزان فعالیت آنزیمی نمونه های

پایان نامه
Previous Entries منبع پایان نامه با موضوع ، NX)=-(1+A(NX))، Next Entries منبع مقاله درمورد عرفان و تصوف، زبان قرآن